Efeito de polietilenoglicol e polivinilpirrolidona na extração e hibridização de rRNA bacteriano de células expostas a taninos

In order to detect fluctuations in ruminal microbial populations due to forage tannins using 16S ribosomal RNA (rRNA) probes, recovery of intact rRNA is required. The objective of this work was to evaluate the effect of polyethylene glycol (PEG) and polyvinylpirrolidone (PVP) on extraction of bacterial rRNA, in the presence of tannins from tropical legume forages and other sources, that hybridize with oligonucleotide probes. Ruminococcus albus 8 cells were exposed to 8 g/L tannic acid or 1 g/L condensed tannins extracted from Acacia angustissima, banana (Musa sp.) skin, Desmodium ovalifolium, red grape (Vitis vinifera) skin and Inga edulis, or no tannins. Cells were rinsed with Tris buffer pH 7 containing either 8% PEG or 6% PVP prior to cell lysis. Total RNA samples rinsed with either PEG or PVP migrated through denaturing agarose gels. The 16S rRNA bands successfully hybridized with a R. albus species-specific oligonucleotide probe, regardless of tannin source. The effect of rinsing buffers on the density of 16S rRNA bands, as well as on the hybridization signals was compared. There were significant effects (P < 0.01) when the controls were compared to either buffer treatments due to tannin type, buffer used and the interaction of tannin type and buffer. The significant interaction indicates the influence of tannin type on the parameters evaluated.A recuperação de RNA ribossômico (rRNA) intacto é necessária para a detecção de flutuações na população microbiana ruminal decorrentes dos taninos de forrageiras, utilizando-se sondas para 16S rRNA. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de polietilenoglicol (PEG) e polivinilpirrolidona (PVP) na extração de rRNA bacteriano, em presença de taninos de leguminosas forrageiras tropicais e de outras fontes, que possa ser hibridizado com sondas de oligonucleotídeos. Culturas de Ruminococcus albus 8 foram expostas ou não a 8 g/L de ácido tânico ou a 1 g/L de taninos condensados, extraídos de Acacia angustissima, casca de banana (Musa sp.), Desmodium ovalifolium, cascas de uvas vermelhas (Vitis vinifera) e Inga edulis. As culturas foram lavadas com tampão Tris pH 7 contendo 8% PEG ou 6% PVP antes do rompimento das células. Amostras de RNA total lavadas com PEG ou PVP migraram em géis de agarose. Bandas de 16S rRNA hibridizaram com uma sonda de oligonucleotídeos espécie-específica para R. albus, independentemente da fonte de tanino. Comparou-se o efeito dos tampões de lavagem sobre a densidade das bandas de 16S rRNA, assim como sobre a intensidade de hibridização. Ocorreram efeitos significativos para fontes de taninos, tampões e para a interação entre taninos e tampões (P < 0.01). A interação significativa indica a influência do tipo de tanino nos parâmetros avaliados

Bactérias tolerantes a taninos obtidas de vacas mestiças Holandês x Zebu

The objective of this work was to isolate and characterize tannin-tolerant ruminal bacteria from crossbred Holstein x Zebu cows fed a chopped mixture of elephant grass (Pennisetum purpureum), young stems of "angico-vermelho" (Parapiptadenia rigida), and banana tree (Musa sp.) leaves. A total of 117 bacteria strains were isolated from enrichment cultures of rumen microflora in medium containing tannin extracts. Of these, 11 isolates were able to tolerate up to 3 g L-1 of tannins. Classical characterization procedures indicated that different morphological and physiological groups were represented. Restriction fragments profiles using Alu1 and Taq1 of 1,450 bp PCR products from the 16S rRNA gene grouped the 11 isolates into types I to VI. Sequencing of 16S rRNA PCR products was used for identification. From the 11 strains studied, seven were not identifiable by the methods used in this work, two were strains of Butyrivibrio fibrisolvens, and two of Streptococcus bovis.O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bactérias ruminais tolerantes a taninos obtidas de vacas mestiças Holandês x Zebu alimentadas com dieta composta por capim-elefante (Pennisetum purpureum) picado com ramos novos de angico-vermelho (Parapiptadenia rigida) e folhas de bananeira (Musa sp.). Um total de 117 cepas bacterianas foram isoladas a partir de cultivos de enriquecimento da microbiota ruminal em meio contendo extrato de taninos. Destas, 11 foram capazes de tolerar até 3 g L-1 de taninos. Procedimentos clássicos de caracterização indicaram que diferentes grupos, morfológicos e fisiológicos, estavam representados. Perfis dos fragmentos de restrição com Alu1 e Taq1 dos produtos de PCR de 1.450 bp do gene 16S rRNA agruparam os 11 isolados nos tipos I a VI. O sequenciamento dos produtos PCR 16S rRNA foi utilizado para identificação. Das 11 estirpes estudadas, sete não foram identificáveis pelos métodos utilizados neste trabalho, duas eram estirpes de Butyrivibrio fibrisolvens e duas de Streptococcus bovis

Effect of monensin and soybean oil on rumen ciliate protozoa and correlation between protozoa with ruminal fermentation and digestive parameters

Four lactating dairy cows with ruminal cannula and 155 DIM were allotted to a 4 × 4 Latin square and fed twice daily corn silage and concentrate (55:45, %DM) to evaluate the effect of monensin and soybean oil in the diet of lactating cows on the counting of ciliate protozoa beyond establishing correlations between number of protozoa with some parameters of digestion and ruminal fermentation. The treatments consisted of the inclusion of 33 ppm of sodium monensin or soybean oil at 4% DM, as following: control diet, without oil or monensin - CT; diet with monensin - MN; diet with soybean oil - OL; diet with the combination of 33 ppm of monensin and 4% of soybean oil - OM. Occurrence of 11 ciliate genera was observed, being Entodinium the predominant in all treatments. No significant soybean oil × monensin interaction was observed on protozoa number and genera. The genera Entodinium, Dasytricha, Eremoplastron and Isotricha reduced in the diets with oil, while monensin reduced the counting of Dasytricha, Eremoplastron and Epidinium. The total number of ciliate protozoa and cellulolytics protozoa was reduced by soybean oil and monensin effects, showing a defaunatory additive effect when combined the oil and the monensin. The ciliate cellulolytics was reduced by linoleic acid intake and was related positively with NDF ruminal digestibility and ruminal ammonia. The total number of protozoa was correlated with the molar proportion of propionate in the ruminal liquid, suggesting that monensin and soybean oil, due their defaunatory effect, can reduce the loss of methane in the rumen.Quatro vacas lactantes canuladas no rúmen, com 155 dias em lactação, foram dispostas em um quadrado latino 4 × 4 e alimentadas, duas vezes ao dia, com silagem de milho e concentrado (relação 55:45, base matéria seca), para se avaliarem os efeitos da monensina e do óleo de soja na dieta de vacas lactantes sobre a contagem de protozoários ciliados, além de estabelecer correlações entre os protozoários com alguns parâmetros da digestão e da fermentação ruminal. Os tratamentos consistiram da inclusão de 33 ppm de monensina sódica ou de 4% de óleo de soja na dieta, assim representados: dieta controle, sem óleo ou monensina - CT; dieta com monensina – MN; dieta com óleo – OL; combinação de 33 ppm de monensina e 4% de óleo de soja - OM. Verificou-se a ocorrência de 11 gêneros de ciliados, sendo Entodinium o predominante em todos os tratamentos. Não foi observada interação significativa óleo de soja × monensina sobre a contagem de protozoários e gêneros. Os gêneros Entodinium, Dasytricha, Eremoplastron e Isotricha foram reduzidos nas dietas com óleo, enquanto a monensina diminuiu a contagem de Dasytricha, Eremoplastron e Epidinium. O número total de protozoários e de ciliados celulolíticos foi reduzido pelos efeitos de óleo de soja e monensina, indicando efeito aditivo defaunatório quando combinados o óleo e a monensina. Os ciliados celulolíticos foram reduzidos pelo consumo de ácido linoléico e positivamente relacionados à digestibilidade ruminal da FDN e amônia ruminal. O número total de protozoários foi correlacionado à proporção de propionato no líquido ruminal, indicando que monensina e óleo de soja, pelo seu efeito defaunatório, podem reduzir a perda de metano no rúmen

Modelo para simulação da dinâmica de partículas do alimento no rúmen de bovinos alimentados com cana-de-açúcar

Animal simulation models are sets of equations used to describe biological processes. A non-steady state simulation model of cattle digestion is presented in order to represent nutrient availability as a response to feed intake pattern and the kinetics of particle size reduction. Variables representing the particle size reduction and discontinuous voluntary feed intake were included in a mechanistic model created to optimize the supplementation of sugarcane based diets. In general the predicted values were very close to observed values for fibre and nitrogen flows. The model has not shown consistent bias in relation to the behavior of the observed data of duodenal flow of neutral detergent fiber and non-ammonia nitrogen. Milk production simulations were quite close to actual values. Predictions were improved by the non steady-state model, taking into account variable intake rate in relation to the previous steady-state model. The model can be used to select strategies for supplementation of cattle fed sugarcane based diets.Modelos de simulação animal são conjuntos de equações utilizados para descrever processos biológicos. Um modelo de simulação da digestão de bovinos em condições de ingestão descontínua é apresentado com objetivo de representar a disponibilidade de nutrientes como resposta ao padrão de consumo de alimentos e à cinética da redução do tamanho de partícula. Variáveis representando a redução do tamanho de partículas e consumo de alimento descontinuo foram incluídas em um modelo mecanicista criado para aperfeiçoar a suplementação de dietas à base de cana-de-açúcar. Os valores estimados estiveram muito próximos dos valores observados para fluxos de fibra e nitrogênio. O modelo não apresentou desvios consistentes dos valores observados de fluxo duodenal de fibra em detergente neutro e nitrogênio não-amoniacal. A média geral das produções de leite foi estimada com precisão. As estimativas sob condições de disponibilidade variável de nutrientes apresentaram maior precisão quando comparadas com o modelo anterior que assumia consumo continuo de nutrientes. O modelo pode ser usado para selecionar estratégias de suplementação de dietas à base de cana-de-açúcar em vacas em lactação

Isolamento e atividade fermentativa de fungos anaeróbios do rúmen de vacas leiteiras

The possibility of biotechnological application of anaerobic fungi and their biomass-degrading enzymes has been a growing area of research and development over the past decade. In this context, the occurrence and isolation of rumen fungi were evaluated in three Holstein-Gir dairy cows grazing Urochloa spp., in addition to the fermentation capacity of theses isolates in media containing different carbohydrates. Motile zoospores were found in all of the rumen samples. Twelve fungal strains were recovered and were capable of degrading different carbohydrates and lignocellulosic components, suggesting that these strains are able to produce various degradative enzymes when grown on glucose, xylose, cellobiose, fructose, and cellulose. Results pointed out the first insight into the isolation of rumen anaerobic fungi in dairy cattle in Brazil and suggested that further studies are needed to show the potential of some species for commercial application, especially in tropical ruminants.A possibilidade de aplicação biotecnológica dos fungos anaeróbios, e suas enzimas de degradação de biomassa, tem sido uma área cada vez maior de pesquisa e desenvolvimento na última década. Neste contexto, a ocorrência e o isolamento de fungos ruminais foram avaliados em três vacas Holandês x Gir sob pastejo de Urochloa spp., além da capacidade de fermentação dos isolados em meios de cultura contendo diferentes fontes de carboidratos. Zoósporos móveis foram encontrados em todos os conteúdos ruminais analisadas. Doze isolados foram recuperados e todos foram capazes de degradar diferentes carboidratos e componentes lignocelulósicos, sugerindo que estes isolados são capazes de produzir várias enzimas degradativas. Estes resultados revelaram as primeiras descobertas sobre o isolamento de fungos anaeróbios ruminais em gado leiteiro no Brasil e sugere que estudos adicionais são necessários para evidenciar o potencial de algumas espécies para a aplicação comercial, principalmente em ruminantes tropicais

Ruminal ciliate protozoa of cattle and buffalo fed on diet supplemented with monensin or extracts from propolis

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de dietas suplementadas com monensina ou produtos à base de própolis, nas populações de protozoários ciliados no rúmen de bovinos (Bos taurus) e bubalinos (Bubalus bubalis). Quatro bovinos da raça Holandesa e quatro búfalos da raça Murrah adultos, fistulados no rúmen, foram distribuídos em delineamento quadrado latino (4x4). A dieta constituiu-se de 50% de silagem de milho e 50% de concentrado à base de milho em grãos e farelo de soja, com adição de monensina sódica ou aditivo à base de própolis LLOSA2 ou LLOSC1. As amostras do conteúdo ruminal foram coletadas duas horas após a alimentação. O gênero Entodinium foi o mais representativo em todos os tratamentos, para ambas as raças de ruminantes. Em búfalos, foi observado o efeito redutor do tratamento LLOSC1 nas populações do gênero Entodinium, além do efeito redutor dos tratamentos monensina e LLOSA2 sobre os gêneros da subfamília Diplodiniinae. A média de ciliados foi maior em bubalinos (56x104 mL-1) do que em bovinos (26x104 mL-1). Houve aumento do pH ruminal dos bovinos no tratamento com monensina. O extrato de própolis LLOSC1 reduziu os ciliados do rúmen em bubalinos.The aim of this work was to evaluate the effect of diets supplemented with monensin or with extracts of propolis, on the population of ciliate protozoa in the rumen of cattle (Bos taurus) and water buffalo (Bubalus bubalis). Four Holstein cattle and four Murrah buffalo, fistulated in the rumen, were distributed in 4x4 Latin square design. The diet was constituted by 50% corn silage and 50% concentrate based on corn grain and soybean meal, and the supplementation of monensin sodium or propolis extracts LLOSA2 or LLOSC1. Samples of ruminal contents were collected two hours after feeding. The genus Entodinium was the most common in all treatments for both cattle and buffalo. The LLOSC1 treatment reduced the populations of the genus Entodinium in buffalo. Monensin sodium and LLOSA2 reduced protozoa of the genera of the Diplodiniinae subfamily in buffalo. The average concentration of ciliates was higher in buffalo (56x104 mL-1) than in cattle (26x104 mL-1). There was ruminal pH increase in cattle treated with monensin. The LLOSC1 propolis extract reduced rumen ciliates in buffalo