The possibility of biotechnological application of anaerobic fungi and their biomass-degrading enzymes has been a growing area of research and development over the past decade. In this context, the occurrence and isolation of rumen fungi were evaluated in three Holstein-Gir dairy cows grazing Urochloa spp., in addition to the fermentation capacity of theses isolates in media containing different carbohydrates. Motile zoospores were found in all of the rumen samples. Twelve fungal strains were recovered and were capable of degrading different carbohydrates and lignocellulosic components, suggesting that these strains are able to produce various degradative enzymes when grown on glucose, xylose, cellobiose, fructose, and cellulose. Results pointed out the first insight into the isolation of rumen anaerobic fungi in dairy cattle in Brazil and suggested that further studies are needed to show the potential of some species for commercial application, especially in tropical ruminants.A possibilidade de aplicação biotecnológica dos fungos anaeróbios, e suas enzimas de degradação de biomassa, tem sido uma área cada vez maior de pesquisa e desenvolvimento na última década. Neste contexto, a ocorrência e o isolamento de fungos ruminais foram avaliados em três vacas Holandês x Gir sob pastejo de Urochloa spp., além da capacidade de fermentação dos isolados em meios de cultura contendo diferentes fontes de carboidratos. Zoósporos móveis foram encontrados em todos os conteúdos ruminais analisadas. Doze isolados foram recuperados e todos foram capazes de degradar diferentes carboidratos e componentes lignocelulósicos, sugerindo que estes isolados são capazes de produzir várias enzimas degradativas. Estes resultados revelaram as primeiras descobertas sobre o isolamento de fungos anaeróbios ruminais em gado leiteiro no Brasil e sugere que estudos adicionais são necessários para evidenciar o potencial de algumas espécies para a aplicação comercial, principalmente em ruminantes tropicais