Exploring structure-function relationships of glycoside hydrolases from families 9, 48 and 74

A parede das plantas é formada por uma matriz composta principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. Celulose é o principal polissacarídeo das paredes das plantas, apresentando alta cristalinidade e recalcitrância. Xiloglucano (XyG) é um polissacarídeo complexo envolvido no controle da expansão celular e na biossíntese de componentes da parede celular vegetal. Uma complexa rede entre XyG e celulose é mediada por ligações de hidrogênio. A eficiente hidrólise de XyG e celulose é uma estratégia promissora na desconstrução da biomassa lignocelulósica pela ação orquestrada de CAZymes. Aqui são descritas as caracterizações funcional e estrutural de três novas enzimas das hidrolase de glicosídeos das famílias 9 (BlCel9), 48 (BlCel48) e 74 (XcGH74). XcGH74 é uma xiloglucanase de Xanthomonas campestris altamente específica para XyG. Durante a hidrólise do XyG por XcGH74 XX e XG são os produtos finais. A estrutura cristalográfica dessa enzima foi resolvida e as razões moleculares para sua alta permissibilidade no reconhecimento de XyG analisadas. Os resultados sugerem que XcGH74 cliva XyG preferencialmente entre motivos X–X; no entanto, não hidrolisa entre os motivos L–L, onde uma substituição da cadeia lateral é um pré-requisito para o reconhecimento do substrato. BlCel9 e BlCel48 são celulases de Bacillus licheniformis. BlCel48 é cataliticamente estável em uma ampla gama de temperaturas e pHs exibindo atividade em celulose inchada com ácido fosfórico (PASC) e celulose bacteriana (BC). BlCel48 libera predominantemente celobiose, e também pequenas quantidades de celotriose, celotetraose como produtos do PASC e tem processividade aparente 4,6 vezes maior em BC do que em PASC. Análises de espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) mostraram que essa enzima é globular e monomérica em solução. A estrutura cristalográfica de BlCel48 foi resolvida na presença de ligantes nas posições -5 a -2 e +1 a +2 no sítio catalítico. A especificidade no reconhecimento de celo-oligossacarídeo foi investigada por cromatografia de troca aniônica de alto desempenho (HPLC-PAD), cristalografia de proteínas e análise de acoplamento estatístico, mostrando que esta enzima possui endo iniciação durante a hidrólise de PASC. BlCel9 é uma endoglucanase que exibe eficiência catalítica máxima em pH 7,0 e 60 °C. Tem maior atividade em PASC, seguida por BC e, em menor grau, carboximetilcelulose (CMC). A análise por HPAEC-PAD dos produtos hidrolíticos demonstrou que o produto final da hidrólise é principalmente celobiose. Análises de dados cristalografia de raios X e SAXS mostraram que essa enzima é monomérica em solução, conforme estimado a partir dos dados do SAXS. Tem uma forma alongada composta por um módulo de ligação à carboidratos (CBM3c) N-terminal ligado ao domínio catalítico (GH9) C-terminal por um linker de 20 aminoácidos. Os domínios estão intimamente justapostos em uma conformação estendida e formam uma estrutura relativamente rígida em solução, indicando que as interações entre os domínios catalíticos e CBM3c desta enzima têm um papel cooperativo no reconhecimento da celulose. Juntos, esses resultados lançam alguma luz sobre a relação entre estrutura e função das hidrolases glicosídicas das famílias 9, 48 e 74.Plant cell walls form a matrix composed mainly of cellulose, hemicellulose, and lignin. Cellulose is the main polysaccharide of the plant cell walls with high crystallinity and recalcitrance. Xyloglucan (XyG) is a complex polysaccharide involved in the control of cell expansion and biosynthesis of cell walls components. A complex crosslink between XyG and cellulose is mediated by H-bonds. An efficient hydrolysis of XyG and cellulose is a promising strategy to achieve an effective lignocellulosic biomass deconstruction by orchestrated action of CAZymes. Here are described the functional and structural characterization of three novel enzymes belonging to glycoside hydrolase families 9 (BlCel9), 48 (BlCel48) and 74 (XcGH74). XcGH74 is a highly specific xyloglucanase from Xanthomonas campestris . During the XyG hydrolysis, XX and XG are its end products. We also solved the structure of this enzyme and analyzed molecular reasons for its high permissibility in XyG recognition. These results suggest that the XcGH74 is able to cleave XyG preferentially between X-X motifs; however, it is unable to hydrolyze the polysaccharide between L-L motifs where a side-chain substitution is a prerequisite to improved substrate recognition. The BlCel9 and BlCel48 are cellulases from Bacillus licheniformis. BlCel48 is catalytically stable in a broad range of temperatures and pH conditions, exhibiting hydrolytic activity against phosphoric acid swollen cellulose (PASC) and bacterial cellulose (BC). BlCel48 releases predominantly cellobiose, and also small amounts of cellotriose and cello-tetraose as products from PASC with apparent processivity 4.6-times greater performance on BC than on PASC. Small-angle X-ray scattering (SAXS) data analysis revealed a globular molecular shape and monomeric state in solution. The crystal structure of BlCel48 was solved and used in presence of ligands spanning -5 to -2 and +1 to +2 subsites into the catalytic site. The specificity of the recognition of the cello-oligosaccharide was investigated by high-performance anion exchange chromatography (HPLC-PAD), protein crystallography, and statistical coupling analysis, which showed that this enzyme has an endo-like initiation on PASC. BlCel9 is a processive endoglucanase exhibiting maximum catalytic efficiency at pH 7.0 and 60 °C, exhibiting highest hydrolytic activity against PASC, followed by BC, and to a lesser extent carboxymethyl-cellulose (CMC). The HPAEC-PAD analysis of the hydrolytic products demonstrated that the end product of the enzymatic hydrolysis is primarily cellobiose. SAXS and X-ray crystallographic data analyses revealed that this enzyme adopts a monomeric state in solution, as estimated from SAXS data; has an elongated shape composed of an N-terminal family 3 carbohydrate-binding module (CBM3c) and a C-terminal GH9 catalytic domain joined together by 20 amino acid residue long linker peptides. The domains are closely juxtaposed in an extended conformation and form a relatively rigid structure in solution, indicating that the interactions between the CBM3c and GH9 catalytic domains might play a key role in cooperative cellulose recognition. Together, these results shed some light on the structure-function relationship of glycoside hydrolases from families 9, 48 and 74

Structural and functional characterization of a xyloglucanase from Xanthomonas campestris

Xyloglucanases (Xghs) are important enzymes involved in xyloglucan modification and degradation. Xanthomonas campestris (Xcc) is a phytopathogenic bacterium which produces a large number of glycosyl hydrolases (GH), but has only one family 74 GH (Xcc-Xgh). A Xcc-Xgh xyloglucan-specific endo-β-1,4-glucanase from family GH74 has been cloned from the Xanthomonas campestris by expression cloning in E. coli. The recombinant enzyme was purified by resin another Ni-NTA column and gel permeation chromatography. The recombinant Xcc-Xgh is stable at pH of 5.3 and temperature below 40°C; the specific activity this enzyme were determined such as 9.31U/mg protein. This enzyme was purified and crystallized. Diffraction datasets were collected for native enzyme and its two complexs with glucose at maximum resolution of 2.0, 2.1 and 2.7 Å, respectively. Data were indexed in the hexagonal crystalline system with unit-cell parameters a=b=153.4 and c=84.9 Å. Data scaling indicated that crystals belong to either space group P61 or its enantiomorph P65. Translation search in molecular replacement calculations solved the space group ambiguity (P61) and the structure refinement is currently in progress. That elucidation of the three-dimensional structure by SAXS and Crystallography of this enzyme will increase our understanding of structure function relationships of the GH74 family members and might provide new structural insights about xyloglucanases mode of action on xyloglucan polysaccharides.Universidade Federal de Sao CarlosXiloglucanases (Xghs) são enzimas envolvidas na degradação da parede celular vegetal pela modificação do polissacarídeo xiloglucano. Xanthomonas campestris (Xcc) é uma bactéria fitopatogênica que produz um grande número de hidrolases de glicosídeos (GH) e apenas uma GH da família 74. Uma xiloglucanase Xcc-Xgh da família GH 74 foi clonada e expressa de forma heteróloga em E. coli. A enzima recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade Ni-NTA e separação por exclusão molecular. Essa enzima tem maior estabilidade funcional na temperatura 40 °C e pH 5,3; é específica para a hidrólise de xiloglucano e sua atividade específica determinada foi 9,31U/mg. Por meio de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foi possível determinar para duas diferentes construções desta enzima, uma com mutação e outra sem mutação, as curvas de estabilidade térmica diferentes para cada uma delas; isso reforça a estreita relação entre estrutura e função da presente enzima. Após a cristalização, conjuntos de dados de difração foram coletados para a enzima na forma apo e dois complexos com glicose na resolução máxima de 2,0, 2,1 e 2,7 Å, respectivamente. Os dados foram indexados no sistema cristalino hexagonal, com os parâmetros de célula unitária a=b =153,4 Å e c=84,9 Å. Os resultados do escalonamento indicam que os cristais pertencem ao grupo espacial P61 ou o seu enantiômero P65. A determinação estrutural por substituição molecular deixou claro que o verdadeiro grupo espacial é P61. Os ligantes de glicose obtidos por soaking com glicose pura e produtos da hidrólise de xiloglucano podem estar correlacionados com a atividade catalítica desta enzima. A determinação da estrutura tridimensional, como também os resultados funcionais, contribuem para a compreensão da maquinaria molecular das enzimas membros da família GH 74 e lança novas perspectivas estruturais sobre o modo de ação das xiloglucanases em polissacarídeos de xiloglucano

Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a new xyloglucanase from Xanthomonas campestris pv. campestris

Xyloglucanases (Xghs) are important enzymes involved in xyloglucan modification and degradation. Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) is a phytopathogenic bacterium which produces a large number of glycosyl hydrolases (GH), but has only one family 74 GH (Xcc-Xgh). This enzyme was overexpressed in Escherichia coli, purified and crystallized. Diffraction data sets were collected for the native enzyme and its complex with glucose to maximum resolutions of 2.0 and 2.1 Å respectively. The data were indexed in a hexagonal crystal system with unit-cell parameters a = b = 153.4, c = 84.9 Å. As indicated by molecular-replacement solution, the crystals belonged to space group P61.FAPESP (08/56255-9, 07/08706-9, 10/52362-5, 09/05349-6)CAPESCNPq / INCT do Bioetanol (471834/2009-2, 301981/2011-6, 550931/2011-2