A calibrated diversity assay for nucleic acid libraries using DiStRO—a Diversity Standard of Random Oligonucleotides

We have determined diversities exceeding 1012 different sequences in an annealing and melting assay using synthetic randomized oligonucleotides as a standard. For such high diversities, the annealing kinetics differ from those observed for low diversities, favouring the remelting curve after annealing as the best indicator of complexity. Direct comparisons of nucleic acid pools obtained from an aptamer selection demonstrate that even highly complex populations can be evaluated by using DiStRO, without the need of complicated calculations

Selection of aptamers to antibiotics and their application in sensitive assay formats

0\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis 1\. Einleitung 1 1.1. Aptamere 1 1.2. Daunorubicin 12 2\. Zielstellung 18 3\. Methoden 19 3.1. Roboter BioSprint 15 19 3.2. SELEX 20 3.3. Molekularbiologische Methoden 25 3.4. Mikrobiologische Methoden 33 3.5. Analytische Methoden 35 4\. Ergebnisse 44 4.1. Halbautomatische in vitro-Selektion 44 4.2. Nicht-radioaktives Monitoring des Selektionsprozesses 47 4.3. Charakterisierung der Aptamere 49 4.4. Anwendung 66 5\. Diskussion 68 5.1. Halbautomatische in vitro-Selektion 68 5.2. Nicht-radioaktives Monitoring 69 5.3. Charakterisierung der Aptamere 70 5.4. Anwendung und Ausblick 74 6\. Zusammenfassung 77 7\. Summary 79 8\. Literaturverzeichnis 81 9\. Anhang 92 9.1. Materialien 92 9.2. BioSprint 15-Protokolle 95 9.3. Eigene Publikationen 98 9.4. Danksagung 100Der Einsatz des Anthracyclin-Antibiotikums Daunorubicin, das in großem Umfang als Zytostatikum verwendet wird, birgt aufgrund seiner Toxizität Risiken für alle, die Umgang mit der Substanz pflegen. Eine strikte Kontrolle des Arbeitsplatzes ist für Hersteller, Apotheker und Krankenhauspersonal deshalb ebenso notwendig wie die Überprüfung der tatsächlichen Konzentration des Medikaments im Blut von Patienten, um hier die Dosis so hoch wie nötig, jedoch so niedrig wie möglich zu halten. Da auch die Belastung der Umwelt durch kontaminiertes Abwasser zu einem Problem führen kann, sind Abwasseranalysen, insbesondere der Krankenhausabwässer, von großer Wichtigkeit. Im Zuge dieser Arbeit wurden Daunorubicin-spezifische DNA-Aptamere aus einer DNA-Bibliothek mit einem randomisierten Bereich von 40 Nukleotiden über eine halbautomatische in vitro-Selektion auf magnetischen Partikeln isoliert, die am Roboter BioSprint 15 etabliert wurde. Um den Verlauf der Selektion ohne Einsatz von Radioaktivität verfolgen zu können, wurden zwei Assays entwickelt. Der auf Mikrotiterplatten durchgeführte Fluorescence dye-linked aptamer assay (FLAA) erlaubt die Überprüfung der Anreicherung von bindenden Spezies über einen ssDNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff. Mit Hilfe des Diversity assay for nucleic acids (DANA) hingegen kann die Abnahme der Diversität eines Oligonukleotidpools untersucht werden. Die Kombination der Ergebnisse beider Assays erlaubt eine klare Aussage, wann die Selektion weit genug fortgeschritten ist, um mit der Vereinzelung der Aptamersequenzen beginnen zu können. Die Abnahme der Diversität des Nukleinsäurepools und die Anreicherung von Bindern verliefen bei der Daunorubicin-Selektion eindeutig parallel. Nach zehn Selektionszyklen konnten 24 Aptamere isoliert werden, die anhand ihrer Sequenz in sieben Gruppen eingeteilt wurden und sich in FLAA-Experimenten alle als affine Daunorubicin-Binder herausstellten. Alle Sequenzen wiesen einen hohen Anteil an Guanin und eine starke Sequenzhomologie untereinander auf. Der im FLAA identifizierte beste Binder wurde weitreichend charakterisiert. Seine Dissoziationskonstante lag bei 20 nM, womit er für ein Aptamer gegen ein kleines Molekül überdurchschnittlich affin ist. Die meisten bisher beschriebenen DNA-Aptamere gegen kleine Moleküle zeigen Dissoziationskonstanten im mikro¬molaren Bereich. Die Bindungseigenschaften des Aptamers wurden unter verschiedenen Puffer¬bedingungen und pH-Werten untersucht. Die Bindung zeigte sich unabhängig von der Anwesenheit bestimmter Salze, solange eine ausreichend hohe Kationenkonzentration als Gegenionen vorhanden war. Die Abhängigkeit vom pH-Wert beschrieb eine Optimumskurve, wobei die beste Bindung bei pH 6,0 detektiert wurde. Eine Prädenaturierung des Aptamers war für eine effiziente Bindung nicht nötig; eine Immobilisierung am 5 -Ende war ohne Funktionsverlust möglich. Das Aptamer zeigte sich spezifisch für die Anthracycline Daunorubicin und Doxorubicin, wobei die Affinität zu Doxorubicin, das C-14-Hydroxyl-Derivat des Daunorubicins, sogar höher war. Außerdem wurden mit Hilfe des Aptamers zwei Testsysteme für die Daunorubicin- Detektion aufgebaut. Ein kompetitiver Schnelltest wurde auf Nitrocellulosestreifen entwickelt, der die qualitative Detektion von 5 µM Daunorubicin ermöglichte. Für den proof of principle erfolgte der colorimetrische Nachweis durch manuelle Zugabe eines Enzymsubstrats. Für eine einfache und schnelle Anwendung sollte die Art der Detektion jedoch weiter optimiert werden, um einen zweiten Arbeitsschritt zu vermeiden. Des Weiteren wurde ein kompetitiver Assay im Mikrotiterplattenformat entwickelt, der die Detektion und Quantifizierung von bis zu 15 nM Daunorubicin bzw. Doxorubicin ermöglichte. Dieser Assay eignet sich aufgrund seiner Empfindlichkeit zum Monitoring der Daunorubicin-Konzentration in Patientenserum zumal Tests in 10 % fötalem Kälberserum ergaben, dass das Aptamer in verdünnten Serumproben mindestens für die Dauer des Assays stabil bleibt.Due to its toxicity, the use of daunomycin, an anthracycline antibiotic that is widely used in cancer therapy, poses a risk for everyone involved with the substance. Therefore, a strict surveillance of the working area of producers, pharmacists, and hospital staff is equally necessary as monitoring the actual dose of the drug in a patient's blood. Since a relevant proportion of administered daunomycin is excreted unmetabolised, contaminated waste water can also have an impact on the environment. For that reason, waste water analysis, especially of hospital waste water, is of great concern. This work focussed on the selection of daunomycin-specific DNA aptamers, which were isolated from a combinatorial library with a randomised region of 40 nucleotides. Aptamers were selected using a semi-automated selection procedure that was established for aptamer generation on magnetic particles. This procedure utilised the robotic workstation BioSprint 15. To monitor the course of the selection without the use of radioactivity, two assays were developed. The "fluorescence dye-linked aptamer assay" (FLAA) allows for monitoring the enrichment of binding sequences by the use of a single-stranded DNA-specific fluorescence dye. With the "diversity assay for nucleic acids" (DANA) the decrease in diversity of an oligonucleotide pool can be observed. Combination of both assays provides information of when the selection has reached a final state and when to proceed with the separation of aptamer sequences. For the daunomycin-selection, the decrease in diversity of the nucleic acid pool clearly coincided with the increase of binding molecules. After ten rounds of selection, 24 aptamers were isolated and, according to their sequence, could be divided into seven different groups. All aptamers proved to be high- affinity binders in FLAA experiments. A strong bias for guanine in the sequence was revealed as well as strong sequence homologies among all sequences. The best binder identified in FLAA experiments was further characterised. Its dissociation constant was determined to be 20 nM, which makes it superior compared to other aptamers against small molecules. Most DNA aptamers to small molecules that have been described showed dissociation constants in the micromolar range. The aptamer's binding characteristics under different buffer conditions and pH values were also evaluated. The binding proved to be independent of the presence of distinct salts, as long as the concentration of counter ions was sufficient. Binding at different pH revealed an optimum curve with the best binding observed at pH 6.0. Denaturation prior to application was not necessary for an efficient binding; immobilisation via 5'-end was possible without loss of function. The aptamer proved to be specific for the anthracyclines daunomycin and doxorubicin, the C-14-hydroxy derivative of daunomycin, with the affinity for doxorubicin being even higher. In addition, two assays based on aptamers were established for daunomycin detection. A dipstick test on nitrocellulose was developed, which allowed for the qualitative detection of 5 µM daunomycin. For the proof of principle, the colorimetric detection was achieved by manual addition of an enzyme substrate. For an easy and rapid application, however, the detection mode should be further optimised to avoid a second manual handling step. Furthermore, a competition assay in microtitre plate format was established, which permitted the detection and quantification of up to 15 nM daunomycin and doxorubicin, respectively. Based on its sensitivity, this assay would be suitable for monitoring the daunomycin concentration in patients' serum - particularly since tests performed in 10 % foetal calf serum revealed that the aptamer remains stable in diluted serum samples at least for the duration of the assay