Isolamento e Caracterização Bioquímica e Estrutural de Fosfolipases A2 Ácidas do Veneno da Serpente Bothrops brazili

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Mestrado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Andreimar Martins Soares.A serpente Bothrops brazili está distribuída por toda a região amazônica e seu veneno, como nas demais serpentes deste gênero, é rico em proteínas e peptídeos bioativos. As fosfolipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) são importantes enzimas presentes no veneno de serpentes e estão relacionadas a um amplo espectro de efeitos farmacológicos tais como inflamação aguda, miotoxicidade e nocicepção. O presente trabalho teve como objetivo efetuar o isolamento e a caracterização bioquímica e estrutural de duas novas PLA2s ácidas do veneno de B. brazili, denominadas de Braziliase-I e Braziliase-II. Para tanto, o veneno foi fracionado em três etapas cromatográficas que se mostraram eficientes na purificação: troca iônica, interação hidrofóbica e fase reversa. A homogeneidade e pureza das proteínas foram avaliadas por SDS-PAGE, onde se observou a presença de uma única banda de aproximadamente 14 kDa. As massas moleculares foram determinadas por espectrometria com valores de 13.894,38 Da para Braziliase-I e 13.869,63 Da para Braziliase-II. As estruturas primárias das duas PLA2s foram determinadas, podendo-se verificar que se tratam de PLA2s da classe Asp49, sendo observada uma elevada identidade com PLA2s ácidas isoladas do veneno de outras serpentes. A atividade enzimática foi avaliada utilizando-se o substrato fluorescente NBD-PC e demonstrou que ambas possuem maior atividade entre pHs de 6,8 a 11 e que perdem atividade na temperatura de 80ºC e na presença de EDTA. A modelagem molecular das Braziliase-I e II foi feita utilizando-se a PLA2 CB (3R0L) de Crotalus durissus terrificus como modelo. A dinâmica molecular realizada mostrou elevada qualidade no modelo gerado e também fez melhorias em ambos os modelos. Dos resíduos encontrados em regiões desfavoráveis (gráfico de Ramachandran), os mesmos estavam localizados em regiões de elevada flexibilidade. O modelo final foi capaz de adquirir a conformação típica de uma PLA2 de veneno de serpente. A atividade edematogênica foi realizada em modelo murino com ambas as PLA2s (Braziliase-I e Braziliase-II) que mostraram ser capazes de promover edema, induzindo um aumento de 27,6% e 22,8% nos primeiros 30 minutos e regredindo logo após. A atividade miotóxica foi avaliada para Braziliase-I e II que demonstraram não serem miotoxinas. Por meio de ensaio de agregação plaquetária detectou-se que ambas as PLA2s isoladas indicaram apresentar atividade antiplaquetária sobre a agregação induzida por ADP e a Braziliase-II sobre a agregação induzida por colágeno também. Por fim, o isolamento e a caracterização das PLA2s constituem etapas fundamentais para o estudo da função dessas proteínas na fisiopatologia do envenenamento e na viabilidade destas enzimas como alvos potenciais para pesquisa de novos fármacos de ação antibacteriana, antiplasmodial, antifúngica, antiplaquetária, antitumoral entre outras

Inibidores de quimotripsina do veneno de Bothrops atrox (Serpentes: Viperidae): Caracterização, atividade antimicrobiana e anti-Trypanosoma cruzi

Dissertação apresentada a Universidade Federal de Rondônia, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental para obtenção do título de Mestre.Orientador: Dr. Andreimar Martins SoaresOs venenos de serpentes são compostos por uma complexa mistura de toxinas e outras substâncias bioativas abrangendo um amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas. Cerca de 90% do peso seco desses venenos é constituído de proteínas e peptídeos, englobando uma grande variedade de enzimas como proteases (metalo e serino), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases, esterases e inibidores de serinoproteases. Os inibidores de serinoproteases do tipo quimotripsina presentes no veneno de serpentes têm demonstrado potencial aplicação na regulação de enzimas proteolíticas e por atuar como possíveis agentes antimicrobianos. O principal objetivo deste trabalho é identificar inibidores de quimotripsina presentes no veneno da serpente Bothrops atrox, com ação antimicrobiana e anti-Trypanosoma cruzi. Inicialmente, 10 mg do veneno de B. atrox foram solubilizados e aquecidos em uma solução ácida a 80ºC por 30 min, e o sobrenadante aplicado na coluna C18 acoplada ao sistema HPLC, obtendo-se a eluição de cinco frações. Estas frações foram desidratadas e testadas em ensaios de inibição da quimotripsina, sendo que todas inibiram a ação desta enzima. As cinco frações foram analisadas por espectrometria MALDI-TOF MS onde observou-se a presença de peptídeos e proteínas entre as faixas de 733,63 a 48.443,3 Da, constatando-se que todas as frações apresentam proteínas com massa molecular semelhante a inibidores de serinoprotease do tipo quimotripsina. Na fração 1 foram detectadas um grupo de proteínas na faixa de 7.000 Da e outra de 9.107,70 Da com atividade inibitória de crescimento de Staphylococcus aureus e formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. A fração 2 apresentou proteínas na faixa de 13 a 14 kDa, que demonstrou a maior atividade contra o crescimento de S. aureus e T. cruzi, comparada as demais frações. Na fração 3, também foi observado a presença de duas proteínas: 8.528,68 e 23.555,52 Da, com atividade inibitória de S. aureus e T. cruzi. E a recromatografia da fração 3 apresentou por espectrometria de massa uma molécula com a massa de 8.527,88 Da e inibição de quimotripsina de 78%. As demais frações demonstraram uma maior variedade de peptídeos e proteínas, necessitando de etapas adicionais de purificação para o isolamento dos inibidores de quimotripsina. Neste estudo, relatou-se a primeira descrição de inibidores de quimotripsina presentes no veneno da serpente B. atrox com ação antimicrobiana contra S. aureus e anti-Trypanosoma cruzi, e estes achados abrem expectativas de utilização destes inibidores como agentes potencialmente terapêuticos

Micropropagação, propagação por sementes e banco de germoplasma de Mandevilla velutina (Mart.) Woodson

Mandevilla velutina (Mart.) Woodson (Apocynaceae) é uma planta medicinal de espécie nativa de regiões do Cerrado brasileiro com propriedades anti-ofídicas. Devido a alta exploração e devastação deste bioma, M. velutina está em perigo de extinção. Como uma iniciativa para a conservação desta espécie ameaçada e economicamente importante, um protocolo de micropropagação foi desenvolvido e genótipos foram colocados no Banco de Germoplasma "Cerrado In vitro". Para a propagação in vitro de M. velutina, segmentos nodais foram inoculados no meio Murashige and Skoog (MS) suplementado com diferentes concentrações de BA, zeatina, 2ip, DTT e TDZ. A melhor resposta de multiplicação foi obtida em meio suplementado com 0.44 µM BA na razão 1: 6.7. Plântulas cultivadas em MS/2 suplementado com 26.85 µM NAA enraizaram com sucesso (50.5%). Quando plântulas enraizadas e não enraizadas foram aclimatizadas em condições de solo, grande perda foi observada entre plântulas não enraizadas, enquanto as enraizadas tiveram 100% de sobrevivência. Foi possível a manutenção de 43% de M. velutina em condições saudáveis por seis meses, sem subculturas usando meio MS suplementado com 2% de sacarose, 13.8 mM de espermidina, 2% de sorbitol e 2% de dextrose.Mandevilla velutina (Mart.) Woodson (Apocynaceae) is a medicinal plant species with antivenom properties, native from Brazilian Savanna regions (Cerrado), which due to overexploitation and habitat deforestation is in danger of extinction. As an initiative for conserving this endangered but economically important plant species, a micropropagation protocol was developed and genotypes were stored in the Germplasm Bank "Cerrado In vitro". For the in vitro propagation of M. velutina, nodal segments were inoculated on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with different concentrations of BA, Zeatin, 2ip, DTT and TDZ. Best multiplication ratio was achieved when to the medium 0.44 µM BA, ranging 1: 6.7, were added. Plantlets cultured on MS/2 medium supplemented with 26.85 µM NAA rooted successfully (50.5%). Although rooted and un-rooted plantlets acclimatized to soil conditions, great losses were observed within un-rooted plantlets, while the rooted presented 100 % survival. It was possible to maintain 43% of the M. velutina germplasm under healthy conditions for six months, with no subcultures, using the MS medium supplemented with 2% sucrose, 13.8 mM spermidine, 2% sorbitol and 2% dextrose

Plant-antivenom: Database of anti-venom medicinal plants

Plant-antivenom is a computational Websystem about medicinal plants with anti-venom properties. The system consists of a database of these plants, including scientific publications on this subject and amino acid sequences of active principles from venomous animals. The system relates these data allowing their integration through different search applications. For the development of the system, the first surveys were conducted in scientific literature, allowing the creation of a publication database in a library for reading and user interaction. Then, classes of categories were created, allowing the use of tags and the organization of content. This database on medicinal plants has information such as family, species, isolated compounds, activity, inhibited animal venoms, among others. Provision is made for submission of new information by registered users, by the use of wiki tools. Content submitted is released in accordance to permission rules defined by the system. The database on biological venom protein amino acid sequences was structured from the essential information from National Center for Biotechnology Information (NCBI). Plant-antivenom's interface is simple, contributing to a fast and functional access to the system and the integration of different data registered on it. Plant-antivenom system is available on the Internet at http://gbi.fmrp.usp.br/plantantivenom

Venenos e toxinas ofídicas purificadas como ferramenta biotecnológica para o controle de Ralstonia solanacearum

The objective of this work was to evaluate the in vitro antibacterial activity of snake venoms and purified toxins on the phytopathogenic bacterium Ralstonia solanacearum. The evaluations were performed with 17 crude venoms (13 from Bothrops, 3 from Crotalus, and 1 from Lachesis) and seven toxins (1 from Bothrops and 6 from Crotalus). Antibacterial activity was assessed in MB1 medium containing solubilized treatments (1 μL mL‑1). A total of 100 μL bacterial suspension (8.4 x 109 CFU mL-1) was used. After incubation at 28°C, the number of bacterial colonies at 24, 48, and 72 hours after inoculation was evaluated. SDS-PAGE gel at 15% was used to analyze the protein patterns of the samples, using 5 μg protein of each sample in the assay. Furthermore, the minimum inhibitory concentration (MIC) and lethal concentration (LC50) values were determined by the Probit method. Venoms and toxins were able to reduce more than 90% of R. solanacearum growth. These results were either equivalent to those of the positive control chloramphenicol or even better. While MIC values ranged from 4.0 to 271.5 µg mL-1, LC50 ranged from 28.5 µg mL-1 to 4.38 mg mL-1. Ten crude venoms (7 from Bothrops and 3 from Crotalus) and two purified toxins (gyroxin and crotamine) are promising approaches to control the phytopathogenic bacterium R. solanacearum.O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antibacteriana in vitro de venenos e toxinas purificadas de serpentes sobre a bactéria fitopatogênica Ralstonia solanacearum. As avaliações foram realizadas em 17 venenos brutos (13 de Bothrops, 3 de Crotalus e 1 de Lachesis) e sete toxinas (1 de Bothrops e 6 de Crotalus). A atividade antibacteriana foi avaliada em meio MB1 que continha os tratamentos solubilizados (1 μL mL-1). Utilizou-se o total de 100 μL de suspensão bacteriana (8,4 x 109 UFC mL-1). Após incubação a 28°C, avaliou-se o número de colônias bacterianas às 24, 48 e 72 horas após a inoculação. O gel SDS-PAGE a 15% foi usado para analisar o perfil proteico das amostras, tendo-se utilizado 5 μg de proteína no ensaio. Além disso, os valores de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração letal (CL50) foram determinados pelo método Probit. Os venenos e as toxinas foram capazes de reduzir mais de 90% do crescimento de R. solanacearum. Esses resultados foram ou equivalentes aos do controle positivo cloranfenicol ou até melhores. Enquanto os valores de CIM variaram de 4,0 a 271,5 µg mL-1, a CL50 variou de 28,5 µg mL-1 a 4,38 mg mL-1. Dez venenos brutos (7 de Bothrops e 3 de Crotalus) e duas toxinas (giroxina e crotamina) são abordagens promissoras para o controle da bactéria fitopatogênica R. solanacearum

Caracterização das atividades enzimáticas presentes na peçonha de Bothrops jararacussu Lacerda, 1884 (Viperidae-crotalinae): purificação parcial de proteínas biologicamente ativas

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação)As serpentes ou ofídios são répteis desprovidos de membros, que podem ou não ser peçonhentos, com ampla distribuição mundial. Assim sendo, este trabalho propõe a determinação das atividades biológicas da peçonha de Jararacuçu e a purificação parcial dos seus componentes ativos

Plant-antivenom: Database of anti-venom medicinal plants

Plant-antivenom is a computational Websystem about medicinal plants with anti-venom properties. The system consists of a database of these plants, including scientific publications on this subject and amino acid sequences of active principles from venomous animals. The system relates these data allowing their integration through different search applications. For the development of the system, the first surveys were conducted in scientific literature, allowing the creation of a publication database in a library for reading and user interaction. Then, classes of categories were created, allowing the use of tags and the organization of content. This database on medicinal plants has information such as family, species, isolated compounds, activity, inhibited animal venoms, among others. Provision is made for submission of new information by registered users, by the use of wiki tools. Content submitted is released in accordance to permission rules defined by the system. The database on biological venom protein amino acid sequences was structured from the essential information from National Center for Biotechnology Information (NCBI). Plant-antivenom`s interface is simple, contributing to a fast and functional access to the system and the integration of different data registered on it. Plant-antivenom system is available on the Internet at http://gbi.fmrp.usp.br/plantantivenom.Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq)Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES

Comparative structural studies on Lys49-phospholipases A(2) from Bothrops genus reveal their myotoxic site

Phospholipases A(2) (PLA(2)s) are membrane-associated enzymes that hydrolyze phospholipids at the sn-2 position, releasing lysophospholipids and free fatty acids. Phospholipase A(2) homologues (Lys49-PLA(2)s) are highly myotoxic and cause extensive tissue damage despite not showing measurable catalytic activity. They are found in different snake venoms and represent one third of bothropic venom composition. The importance of these toxins during envenomation is related to the pronounced local myotoxic effect they induce since this effect is not neutralized by serum therapy. We present herein three structures of Lys49-PLA(2)s from Bothrops genus snake venom crystallized under the same conditions, two of which were grown in the presence of alpha-tocopherol (vitamin E). Comparative structural analysis of these and other Lys49-PLA(2)s showed two different patterns of oligomeric conformation that are related to the presence or absence of ligands in the hydrophobic channel. This work also confirms the biological dimer indicated by recent studies in which both C-termini are in the dimeric interface. In this configuration, we propose that the myotoxic site of these toxins is composed by the Lys 20, Lys115 and Arg118 residues. For the first time, a residue from the short-helix (Lys20) is suggested as a member of this site and the importance of Tyr119 residue to myotoxicity of bothropic Lys49-PLA(2)s is also discussed. These results support a complete hypothesis for these PLA(2)s myotoxic activity consistent with all findings on bothropic Lys49-PLA(2)s studied up to this moment, including crystallographic, bioinformatics, biochemical and biophysical data. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq

Myotoxic and cytolytic activities of dimeric Lys49 phospholipase A2 homologues are reduced, but not abolished, by a pH-induced dissociation

Lys49 phospholipase A2 (PLA2) homologues are myotoxic proteins devoid of catalytic activity. Their toxic determinants map to the C-terminal region 115–129, which plays an effector role in membrane damage. The dimeric state was reported to be essential for a Lys49 PLA2 which lost its liposome-disrupting activity after dissociating into monomers at pH 5.0. This study, evaluated the effects of a pH-induced dissociation on the toxicity of four Lys49 PLA2s, using biological targets instead. Both their cytolytic and myotoxic activities were lower at pH 5.0 than at pH 7.2. However, in contrast with experiments using artificial bilayers, toxic effects upon biological targets were not abolished at pH 5.0. Importantly, C-terminal synthetic peptides of two Lys49 PLA2s also showed lower cytolytic action at pH 5.0 than at pH 7.2, indicating that factors other than the dimeric/monomeric state of the proteins may also be involved in these differences of toxicity. Results support the view that the dimeric state of Lys49 PLA2s could play an enhancing, although not essential role, in their C-terminal region-mediated mechanism of myotoxicity.International Foundation for Science/[F/2766-3]/IFS/SueciaUniversidad de Costa Rica//UCR/Costa RicaNeTropica/[01-R-2003]//SueciaFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo//FAPESP/BrasilUCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias de la Salud::Instituto Clodomiro Picado (ICP