Xenofree generation of limbal stem cells for ocular surface advanced cell therapy.

Background: Limbal stem cells (LSC) sustain the corneal integrity and homeostasis. LSC deficiency (LSCD) leads to loss of corneal transparency and blindness. A clinical approach to treat unilateral LSCD comprises autologous cultured limbal epithelial stem cell transplantation (CLET). CLET uses xenobiotic culture systems with potential zoonotic transmission risks, and regulatory guidelines make necessary to find xenofree alternatives. Methods: We compared two xenofree clinical grade media and two feeder layers. We used CnT07, a defined commercial medium for keratinocytes, and a modified xenofree supplemented hormonal epithelial medium with human serum (XSHEM). Optimal formulation was used to compare two feeder layers: the gold standard 3T3 murine fibroblasts and human processed lipoaspirate cells (PLA). We tested the expressions of ΔNp63α and cytokeratin 3 and 12 by qPCR and immunofluorescence. Morphology, viability, clonogenicity, proliferation, and cell growth assays were carried out. We also evaluated interleukin 6 (IL-6) and stromal-derived factor 1 (SDF-1) by qPCR and ELISA. Results: XSHEM maintained better LSC culture viability and morphology than CnT07. Irradiated PLA feeder cells improved the undifferentiated state of LSC and enhanced their growth and clonogenicity stimulating IL-6 secretion and SDF-1 expression, as well as increased proliferation and cell growth when compared with irradiated 3T3 feeder cells. Conclusions: The combination of XSHEM and PLA feeder cells efficiently sustained LSC xenofree cultures for clinical application. Moreover, PLA feeder layers were able to improve the LSC potential characteristics. Our results would have direct clinical application in CLET for advanced therapy

Epithelial To Mesenchymal Transition In Human Endocrine Islet Cells

BACKGROUND: β-cells undergo an epithelial to mesenchymal transition (EMT) when expanded in monolayer culture and give rise to highly proliferative mesenchymal cells that retain the potential to re-differentiate into insulin-producing cells. OBJECTIVE: To investigate whether EMT takes place in the endocrine non-β cells of human islets. METHODOLOGY: Human islets isolated from 12 multiorgan donors were dissociated into single cells, purified by magnetic cell sorting, and cultured in monolayer. RESULTS: Co-expression of insulin and the mesenchymal marker vimentin was identified within the first passage (p1) and increased subsequently (insulin+vimentin+ 7.2±6% at p1; 43±15% at p4). The endocrine non-β-cells did also co-express vimentin (glucagon+vimentin+ 59±1.5% and 93±6%, somatostatin+vimentin+ 16±9.4% and 90±10% at p1 and p4 respectively; PP+vimentin+ 74±14% at p1; 88±12% at p2). The percentage of cells expressing only endocrine markers was progressively reduced (0.6±0.2% insulin+, 0.2±0.1% glucagon+, and 0.3±0.2% somatostatin+ cells at p4, and 0.7±0.3% PP+ cells at p2. Changes in gene expression were also indicated of EMT, with reduced expression of endocrine markers and the epithelial marker CDH-1 (p<0.01), and increased expression of mesenchymal markers (CDH-2, SNAI2, ZEB1, ZEB2, VIM, NT5E and ACTA2; p<0.05). Treatment with the EMT inhibitor A83-01 significantly reduced the percentage of co-expressing cells and preserved the expression of endocrine markers. CONCLUSIONS: In adult human islets, all four endocrine islet cell types undergo EMT when islet cells are expanded in monolayer conditions. The presence of EMT in all islet endocrine cells could be relevant to design of strategies aiming to re-differentiate the expanded islet cells towards a β-cell phenotype

Development of biomimetic 3D platforms for the culture and redifferentiation of pancreatic beta cells

La diabetis és una malaltia que ha assolit proporcions epidèmiques. Aquest trastorn metabòlic es caracteritza per la hiperglucèmia crònica i està associat amb una elevada mortalitat cardiovascular i la reducció de l'esperança de vida. La diabetis mellitus tipus 1 (T1DM) està causada per la destrucció autoimmune de les cèl·lules beta pancreàtiques productores d'insulina. El reemplaçament de la massa de cèl·lules beta és un tractament prometedor per als pacients de T1DM, que té com a objectiu restaurar la normoglucèmia. El trasplantament d'illots pancreàtics ha demostrat el seu potencial com a teràpia de reemplaçament cel·lular, encara que la seva aplicació es troba limitada per diversos obstacles com l'escassetat d'illots pancreàtics. Per tant, es necessiten noves estratègies dirigides a generar una font abundant de cèl·lules productores d'insulina. Un enfocament prometedor és l'expansió de les cèl·lules beta adultes. No obstant, l'expansió in vitro de les cèl·lules beta implica la pèrdua del seu fenotip, probablement com a conseqüència de l'aïllament i la posterior dissociació dels illots en cèl·lules individuals. Aquests processos destrueixen el microambient cel·lular, alterant els contactes cèl·lula-cèl·lula i cèl·lula-matriu. L'enginyeria de teixits (ET) pot ajudar a superar aquests problemes creant teixits tridimensionals (3D), mitjançant l'ús combinat de cèl·lules i biomaterials que imitin la matriu extracel·lular (ECM) nativa. La hipòtesi de treball es va basar en el fet que la funcionalització de les matrius 3D amb motius de senyalització derivats de la ECM podria reconstituir el microambient dels illots, induint la rediferenciació de les cèl·lules expandides. La línia de cèl·lules beta de rata INS-1E, es va utilitzar com a prova de concepte per al model 3D funcionalitzat. El pèptid autoensamblable RAD16-I es va funcionalitzar amb els motius d'unió a integrina RGD, YIG, IKVAV, GEF i TWY. La caracterització de les matrius funcionalitzades va evidenciar que el pèptid RAD16-I mantenia la seva estructura característica de fulla beta en afegir els motius bioactius RGD, YIG i IKVAV. Per tant, les cèl·lules INS-1E es van encapsular amb els scaffolds biomimètics, els quals van promoure la supervivència cel·lular i la formació d'agregats cel·lulars, mimetitzant la conformació in vivo dels illots pancreàtics. A més, es va observar una major secreció d'insulina en les matrius funcionalitzades amb els pèptids YIG i IKVAV. Basant-nos en aquests resultats, es va intentar adaptar el model 3D per promoure la rediferenciació de les cèl·lules expandides dels illots humans. L'encapsulació de les cèl·lules desdiferenciades en la matriu de RAD16-I no va resultar ser un sistema adequat, per aquest motiu es van establir cultius en configuració sandvitx. Prèviament, es va induir la formació d'agregats cel·lulars (ICCs), propiciant així els contactes cèl·lula-cèl·lula. La conformació dels ICCs es va mantenir i va evolucionar en els cultius en sandvitx amb excel·lents valors de viabilitat. A més, els motius d'adhesió RGD i IKVAV van promoure la reexpressió dels marcadors de cèl·lula beta Ins, Pdx1, Nkx6.1 i MAFA. Aquests resultats indiquen que els cultius en configuració sandvitx, funcionalitzats amb RGD i IKVAV, són una plataforma 3D prometedora per induir la rediferenciació cap a un fenotip de cèl·lula beta, generant així cèl·lules que puguin ser utilitzades en la teràpia cel·lular de la diabetis.La diabetes es una enfermedad que ha alcanzado proporciones epidémicas. Este trastorno metabólico se caracteriza por la hiperglucemia crónica y está asociado con una elevada mortalidad cardiovascular y la reducción de la esperanza de vida. La diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) está causada por la destrucción autoinmune de las células beta pancreáticas productoras de insulina. El reemplazo de la masa de células beta es un tratamiento prometedor para los pacientes de T1DM, que tiene como objetivo restaurar la normoglucemia. El trasplante de islotes pancreáticos ha demostrado su potencial como terapia de reemplazo celular, aunque su aplicación se encuentra limitada por diversos obstáculos como la escasez de islotes pancreáticos. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias dirigidas a generar una fuente abundante de células productoras de insulina. Un enfoque prometedor es la expansión de las células beta adultas. Sin embargo, la expansión in vitro de las células beta implica la pérdida de su fenotipo, probablemente como consecuencia del aislamiento y la posterior disociación de los islotes en células individuales. Dichos procesos destruyen el microambiente celular, alterando los contactos célula-célula y célula-matriz. La ingeniería de tejidos (TE) puede ayudar a superar estos problemas creando tejidos tridimensionales (3D), mediante el uso combinado de células y biomateriales que imitan la matriz extracelular (ECM) nativa. La hipótesis de trabajo se basó en que la funcionalización de las matrices 3D con motivos de señalización derivados de la ECM podría reconstituir el microambiente de los islotes, induciendo la rediferenciación de las células expandidas. La línea de células beta de rata INS-1E, se utilizó como prueba de concepto para el modelo 3D funcionalizado. El péptido autoensamblable RAD16-I se funcionalizó con los motivos de unión a integrina RGD, YIG, IKVAV, GEF y TWY. La caracterización de las matrices funcionalizadas evidenció que el péptido RAD16-I mantenía su estructura característica de hoja beta al añadir los motivos bioactivos RGD, YIG e IKVAV. Por lo tanto, las células INS-1E se encapsularon con los scaffolds biomiméticos, los cuales promovieron la supervivencia celular y la formación de agregados celulares, mimetizando la conformación in vivo de los islotes pancreáticos. Además, se observó una mayor secreción de insulina en las matrices funcionalizadas con los péptidos YIG e IKVAV. Basándonos en estos resultados, se intentó adaptar el modelo 3D para promover la rediferenciación de las células expandidas de los islotes humanos. La encapsulación de las células desdiferenciadas en la matriz de RAD16-I no resultó ser un sistema adecuado, por ese motivo se establecieron cultivos en configuración sándwich. Previamente, se indujo la formación de agregados celulares (ICCs), propiciando así los contactos célula-célula. La conformación de los ICCs se mantuvo y evolucionó en los cultivos en sándwich con excelentes valores de viabilidad. Además, los motivos de adhesión RGD e IKVAV promovieron la reexpresión de los marcadores de célula beta Ins, Pdx1, Nkx6.1 y MafA. Estos resultados indican que los cultivos en configuración sándwich funcionalizados con RGD e IKVAV, son una plataforma 3D prometedora para inducir la rediferenciación hacia un fenotipo de célula beta, generando así células que puedan ser utilizadas en la terapia celular de la diabetes.La diabetes es una enfermedad que ha alcanzado proporciones epidémicas. Este trastorno metabólico se caracteriza por la hiperglucemia crónica y está asociado con una elevada mortalidad cardiovascular y la reducción de la esperanza de vida. La diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) está causada por la destrucción autoinmune de las células beta pancreáticas productoras de insulina. El reemplazo de la masa de células beta es un tratamiento prometedor para los pacientes de T1DM, que tiene como objetivo restaurar la normoglucemia. El trasplante de islotes pancreáticos ha demostrado su potencial como terapia de reemplazo celular, aunque su aplicación se encuentra limitada por diversos obstáculos como la escasez de islotes pancreáticos. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias dirigidas a generar una fuente abundante de células productoras de insulina. Un enfoque prometedor es la expansión de las células beta adultas. Sin embargo, la expansión in vitro de las células beta implica la pérdida de su fenotipo, probablemente como consecuencia del aislamiento y la posterior disociación de los islotes en células individuales. Dichos procesos destruyen el microambiente celular, alterando los contactos célula-célula y célula-matriz. La ingeniería de tejidos (TE) puede ayudar a superar estos problemas creando tejidos tridimensionales (3D), mediante el uso combinado de células y biomateriales que imitan la matriz extracelular (ECM) nativa. La hipótesis de trabajo se basó en que la funcionalización de las matrices 3D con motivos de señalización derivados de la ECM podría reconstituir el microambiente de los islotes, induciendo la rediferenciación de las células expandidas. La línea de células beta de rata INS-1E, se utilizó como prueba de concepto para el modelo 3D funcionalizado. El péptido autoensamblable RAD16-I se funcionalizó con los motivos de unión a integrina RGD, YIG, IKVAV, GEF y TWY. La caracterización de las matrices funcionalizadas evidenció que el péptido RAD16-I mantenía su estructura característica de hoja beta al añadir los motivos bioactivos RGD, YIG e IKVAV. Por lo tanto, las células INS-1E se encapsularon con los scaffolds biomiméticos, los cuales promovieron la supervivencia celular y la formación de agregados celulares, mimetizando la conformación in vivo de los islotes pancreáticos. Además, se observó una mayor secreción de insulina en las matrices funcionalizadas con los péptidos YIG e IKVAV. Basándonos en estos resultados, se intentó adaptar el modelo 3D para promover la rediferenciación de las células expandidas de los islotes humanos. La encapsulación de las células desdiferenciadas en la matriz de RAD16-I no resultó ser un sistema adecuado, por ese motivo se establecieron cultivos en configuración sándwich. Previamente, se indujo la formación de agregados celulares (ICCs), propiciando así los contactos célula-célula. La conformación de los ICCs se mantuvo y evolucionó en los cultivos en sándwich con excelentes valores de viabilidad. Además, los motivos de adhesión RGD e IKVAV promovieron la reexpresión de los marcadores de célula beta Ins, Pdx1, Nkx6.1 y MafA. Estos resultados indican que los cultivos en configuración sándwich funcionalizados con RGD e IKVAV, son una plataforma 3D prometedora para inducir la rediferenciación hacia un fenotipo de célula beta, generando así células que puedan ser utilizadas en la terapia celular de la diabetes

Anàlisi cronològic de la pesca artesanal al port de Palamós per a una proposta de reserva

Segons els coneixements i l’ experiència dels pescadors d’ arts menors de la Confraria de Palamós, s’ ha observat una dràstica davallada d’ algunes de les espècies d’ interès pesquer més representatives. La proposta d’ aquest sector es basa en declarar tota una zona d’ interès pesquer artesanal a l’ entorn de les Illes Formigues com a Reserva Marina d’ Interès Pesquer. Aquest projecte pretén esbrinar l’ evolució de la pesca artesanal al port de Palamós en el últims sis anys mitjançant l’ anàlisi cronològica a través del buidatge dels fulls de subhasta proporcionats per la Confraria de Palamós. En base els resultats obtinguts s’ ha fet una valoració de la situació actual que servirà com a punt de partida per al seguiment amb posterioritat. Finalment s’ han elaborat unes primeres propostes de gestió de cares a la possible futura creació de la reserv

Xenofree generation of limbal stem cells for ocular surface advanced cell therapy

Limbal stem cells (LSC) sustain the corneal integrity and homeostasis. LSC deficiency (LSCD) leads to loss of corneal transparency and blindness. A clinical approach to treat unilateral LSCD comprises autologous cultured limbal epithelial stem cell transplantation (CLET). CLET uses xenobiotic culture systems with potential zoonotic transmission risks, and regulatory guidelines make necessary to find xenofree alternatives. We compared two xenofree clinical grade media and two feeder layers. We used CnT07, a defined commercial medium for keratinocytes, and a modified xenofree supplemented hormonal epithelial medium with human serum (XSHEM). Optimal formulation was used to compare two feeder layers: the gold standard 3T3 murine fibroblasts and human processed lipoaspirate cells (PLA). We tested the expressions of ΔNp63α and cytokeratin 3 and 12 by qPCR and immunofluorescence. Morphology, viability, clonogenicity, proliferation, and cell growth assays were carried out. We also evaluated interleukin 6 (IL-6) and stromal-derived factor 1 (SDF-1) by qPCR and ELISA. XSHEM maintained better LSC culture viability and morphology than CnT07. Irradiated PLA feeder cells improved the undifferentiated state of LSC and enhanced their growth and clonogenicity stimulating IL-6 secretion and SDF-1 expression, as well as increased proliferation and cell growth when compared with irradiated 3T3 feeder cells. The combination of XSHEM and PLA feeder cells efficiently sustained LSC xenofree cultures for clinical application. Moreover, PLA feeder layers were able to improve the LSC potential characteristics. Our results would have direct clinical application in CLET for advanced therapy

Epithelial To Mesenchymal Transition In Human Endocrine Islet Cells

BACKGROUND: β-cells undergo an epithelial to mesenchymal transition (EMT) when expanded in monolayer culture and give rise to highly proliferative mesenchymal cells that retain the potential to re-differentiate into insulin-producing cells. OBJECTIVE: To investigate whether EMT takes place in the endocrine non-β cells of human islets. METHODOLOGY: Human islets isolated from 12 multiorgan donors were dissociated into single cells, purified by magnetic cell sorting, and cultured in monolayer. RESULTS: Co-expression of insulin and the mesenchymal marker vimentin was identified within the first passage (p1) and increased subsequently (insulin+vimentin+ 7.2±6% at p1; 43±15% at p4). The endocrine non-β-cells did also co-express vimentin (glucagon+vimentin+ 59±1.5% and 93±6%, somatostatin+vimentin+ 16±9.4% and 90±10% at p1 and p4 respectively; PP+vimentin+ 74±14% at p1; 88±12% at p2). The percentage of cells expressing only endocrine markers was progressively reduced (0.6±0.2% insulin+, 0.2±0.1% glucagon+, and 0.3±0.2% somatostatin+ cells at p4, and 0.7±0.3% PP+ cells at p2. Changes in gene expression were also indicated of EMT, with reduced expression of endocrine markers and the epithelial marker CDH-1 (p<0.01), and increased expression of mesenchymal markers (CDH-2, SNAI2, ZEB1, ZEB2, VIM, NT5E and ACTA2; p<0.05). Treatment with the EMT inhibitor A83-01 significantly reduced the percentage of co-expressing cells and preserved the expression of endocrine markers. CONCLUSIONS: In adult human islets, all four endocrine islet cell types undergo EMT when islet cells are expanded in monolayer conditions. The presence of EMT in all islet endocrine cells could be relevant to design of strategies aiming to re-differentiate the expanded islet cells towards a β-cell phenotype

β-cell death.

<p>(A) β-cell death in passage 1 (days 0, 4, 8 and 12) and passage 2. A minimum of 1000 β-cells per sample was counted. Data are means ± SEM (n = 6). (B) Representative immunofluorescence image showing double staining for TUNEL (green) and insulin (red) on day 12. Nuclei are stained in blue with DAPI. Arrow indicates a TUNEL⁺/insulin⁺ β-cell. Scale bar = 50μm.</p

Insulin/glucagon double positive cells.

<p>(A) Percentage of β (black bars), α (grey bars) and double positive cells (white bars) along passage 1 in non-enriched PSA-NCAM-negative fractions. A minimum of 500 positive cells per sample was counted. Data are expressed as means ± SEM (n = 3 donors). (B) Representative confocal immunofluorescence images showing co-expression of insulin (green) and glucagon (red). Scale bar = 20 μm.</p

Loss of pancreatic endocrine and exocrine markers during <i>in vitro</i> expansion.

<p>(A) Cell composition along passages. A minimum of 500 positive cells for each population was counted on at least five representative fields. Data are means ± SEM (n = 6). (B) Representative immunofluorescence images of cell preparations on day 0, and passages 1 to 4 stained for the pancreatic endocrine hormones insulin, glucagon, somatostatin and pancreatic polypeptide (green), the exocrine markers amylase (green) and cytokeratin19 (red), and the mesenchymal marker vimentin (red). Nuclei are stained in blue with DAPI. Scale Bar = 50μm.</p

Changes in gene expression at passage 1.

<p>Gene expression analysis of the initial p1 period (days 0, 4, 8 and 12). Results are expressed as relative mRNA levels (RQ). Data are means ± SEM (n = 3–4 donors). * P< 0.05 and ** P< 0.01 vs day 0.</p