Methodological approaches for spermatogonia population enrichment and effect of cryopreservation on Senegalese sole spermatogonia quality

Senegalese sole (Solea senegalensis) is an emerging species for aquaculture that shows reproductive issues in aquaculture conditions. The transplantation of cryopreserved spermatogonia into closely related species allows the production of surrogated broodstocks. However, the cryopreservation of spermatogonia might cause damage on the quality of spermatogonia, meaning quality assays must be performed. For these assays, it is important to perform cell enrichment protocols to achieve only pure spermatogonia population. Therefore, the aim of this project was to develop an efficient protocol for Senegalese sole spermatogonia enrichment and observe how the cryopreservation protocol affects these germ cells. For this purpose, two experiments were performed using fresh and cryopreserved using dimethyl sulphoxide (DMSO) as cryoprotectant solution. In experiment 1, cells were cultivated in several extracellular matrixes (uncoated, collagen, gelatine and laminin) to perform differential plating for cell enrichment. The results showed that gelatine and collagen plates showed higher spermatogonia presence, however due to the low percentage of spermatogonia recovery obtained this technique was considered unfit for the target species. Afterwards, serial strainers were used to observe that the appropriate size was the 5 μm strainer, which contained higher percentage of spermatogonia recovery. Then, two 5 μm strainers were used and showed slightly better and promising results. This method was validated by RT- PCR where three relevant spermatogonia markers (gfra1, pou5f1/oct4 and nanos2) were up regulated in the samples from the strainers, yet no significance difference was observed. In experiment 2, effect of cryopreservation on the quality of spermatogonia was evaluated where the results showed that viability, DNA integrity and epigenetic were affected by cryopreservation. No difference in lipid peroxidation was observed. Future studies should focus on the limitations of the enrichment techniques to improve this method and improving the cryopreservation protocol to decrease the damaged suffered by cells during this technique.O linguado senegalês (Solea senegalensis) é uma espécie promissora para a aquacultura europeia devido ao declínio da sua oferta no mercado de pesca, e consequentemente, o seu alto valor de mercado e também por revelar excelentes características para cultivo. Contudo, esta espécie apresenta alguns problemas reprodutivos que impedem o fecho do seu ciclo de vida em condições de aquacultura. A transplantação de espermatogónias criopreservadas em espécies intimamente relacionadas permite a produção de reprodutores substitutos. No entanto, a criopreservação de espermatogónias pode causar danos na qualidade destas como tem sido observado em espermatozóides. Para entender completamente como a criopreservação afeta as espermatogónias, devem ser realizados testes de qualidade. Para este propósito, é necessário executar protocolos de enriquecimento celular de modo a obter apenas uma população de espermatogónias puras e viáveis. Neste contexto, o objetivo deste projeto é desenvolver um protocolo eficiente para o enriquecimento de espermatogónias no linguado senegalês e observar se o protocolo de criopreservação afeta a viabilidade celular, integridade do DNA e perfil epigenético dessas células germinativas. Neste estudo, foram usados testículos de linguado senegalês juvenil frescos e criopreservados utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) como solução crioprotetora. Na experiência 1, as células foram cultivadas em diversas matrizes extracelulares (sem revestimento, colagénio, gelatina e laminina) durante 24h e 48h para realizar o differential plating para enriquecimento celular. Os resultados mostraram que o tempo (P=0.614) e a interação entre tempo e matrizes extracelulares (P=0.506) não afetou significativamente as percentagens de recuperação de espermatogónias. Contudo, existe diferença significativa entre matrizes (P<0.001). As placas de gelatina (5.3 ± 0.9 %) mostraram presença de espermatogónias significativamente maior quando comparado com as placas sem revestimento (1.55 ± 0.86 %; P<0.001) e as placas de laminina (1 ± 0.22%; P<0.001). As placas de colagénio também apresentaram maior presença significativa de espermatogónias em comparação com as placas sem revestimento (P=0.011) e placas de laminina (P<0.001). Não obstante, esta técnica foi considerada imprópria para a espécie alvo devido à baixa percentagem de recuperação de espermatogónias obtida (5.3%). Posteriormente, outra técnica (strainers) foi utilizada como método de enriquecimento celular. Uma série de tamanhos diferentes (30 μm a 1 μm) foram utilizados de modo a avaliar qual seria o tamanho mais adequado para futuras experiências. O tamanho de 5 μm demonstrou menor contaminação de outras células e maior percentagem de recuperação de espermatogónias (64.2%). Após a avaliação do tamanho, foram utilizados dois strainers de 5 μm. O primeiro strainer demonstrou uma quantidade significativamente maior de espermatogónias (26.1 ± 6.1 %) quando comparado com o flow through (< 5 μm) (11.6 ± 6.8 %; P=0.038) com alguma contaminação de outras células. O segundo strainer apresentou uma tendência semelhante à do primeiro, mas com menos quantidade de células em geral. Contudo, este não apresentou diferenças significativa nem com o primeiro strainer (P=0.263) nem com o flow through (P=0.438). No flow through observou-se grande quantidade de células e uma percentagem baixa de recuperação de espermatogónias. Esta técnica apresentou resultados um pouco melhores e promissores quando comparado com differential plating (26.1%). Esta última técnica foi validada por real-time PCR onde três marcadores genéticos relevantes de espermatogónias (gfra1, pou5f1/oct4 e nanos2) em amostras dos strainers e do flow through (< 5 μm). O gene gfra1 estava regulado positivamente nas amostras dos strainers (3.05 ± 2.45) e regulados negativamente nas amostras do flow through (-1.29 ± 0.29), enquanto o pou5f1 (2.19 ± 2.35 strainers and 0.57 ± 2.48 flow through) e o nanos2 (2.43 ± 1.66 strainers and 2.35 ± 0.67 flow through) estavam regulados positivamente para ambas as amostras. Ainda assim, não foram observadas diferenças significativas entre amostras para todos os genes. Na experiência 2, as espermatogónias criopreservadas e frescas foram enriquecidas de acordo com a metodologia selecionada na experiência 1 e a qualidade das espermatogónias foi avaliada posteriormente através de quatro técnicas (viabilidade celular, integridade do DNA, peroxidação lipídica e modificações epigenéticas). Quanto à viabilidade celular foi possível verificar que esta foi significativamente maior no grupo do fresco (78.98 ± 5.66 %) quando comparado com o grupo criopreservado (62.81 ± 3.25 %; P= 0.003). No que respeita a integridade do DNA, a fragmentação do DNA foi significativamente maior no grupo do criopreservado (37.28 ± 1.87 %) quando comparado com o grupo fresco (32.95 ± 2.28 %; P= 0.026). Em relação à peroxidação lipídica, não houve diferença significativa entre o grupo fresco (1.13 ± 0.45 μM of MDA per million spermatogonia) e o grupo criopreservado (0.91 ± 0.96 μM of MDA per million spermatogonia; P=0.701). Finalmente, em termos de modificações epigenéticas, foram observadas citosinas metiladas em três contextos diferentes, constatando-se que a maior percentagem observada, para ambos os grupos, foi no contexto CpG (81.8 ± 0.39 % fresco e 82 ± 1.05 %). Porém, nenhuma diferença significativa foi observada entre os dois grupos (P=0.733). Contudo, o grupo criopreservado demonstrou um perfil de metilação diferente com mais DMC (differentially metylated cytosines) quando comparado com o fresco. Os resultados mostraram assim que apenas a viabilidade, integridade do DNA e a epigenética foram prejudicadas pela criopreservação. Em suma, precisam de ser realizados mais estudos para abordar as limitações deste projeto e também devem ser testados mais métodos. Futuros estudos deverão se concentrar em novas soluções, tais como, avaliar a temperatura ideal e aplicar double enrichment, para alcançar o enriquecimento bem-sucedido das espermatogônias e otimizar as condições de cultura para apoiar a sobrevivência e a atividade mitótica das espermatogônias de Senegalese sole. Deverão igualmente ser testadas estratégias para evitar a contaminação de outras células e não perder espermatogônias durante o processo de enriquecimento, nomeadamente, mudanças na percentagem de FBS para remover células somáticas testiculares e adição de fatores de crescimento para combater a diminuição gradual do número total de espermatogônias, também devem ser testadas. Concretamente no que respeita ao efeito da criopreservação na qualidade das espermatogónia do linguado senegalês, foi possível verificar que a criopreservação causa apenas perda de viabilidade celular e danos no DNA. Futuros estudos devem focar-se em melhorar o protocolo de criopreservação para diminuir os danos sofridos pelas células durante esta técnica. Será também importante, realizar mais estudos sobre a correlação da criolesão das espermatogônias com a qualidade dos espermatozoides e oócitos após o transplante para determinar o grau de dano que pode ser aceite para fins comerciais e do GenBank. Por fim, futuros estudos devem explorar se o processo de congelamento/descongelamento ou a toxicidade dos crioprotetores é a razão que justifica a existência dos danos nas espermatogônias durante a criopreservação.The traineeship performed in the French National Institute for Agriculture, Food and Environment (INRAE, Rennes, France) was financed by the European Program ERASMUS+. This work was funded by AQUAculture infrastructures for EXCELlence in EUropean fish research project (3.0H2020-INFRAIA-2018-2020 / H2020-INFRAIA-2019-1- 871108

Dos resorts integrados às questões da sustentabilidade: uma

No domínio dos novos produtos o Plano Estratégico Nacional de Turismo (2007) propõe, entre outros, o produto - Turismo Residencial e Resorts Integrados, que pelo seu estudo diferenciado, contem dois universos de alojamento distintos na forma como se apresentam. No caso dos Resorts Integrados são espaços onde os arquétipos físicos assentam em conjuntos de unidades de alojamento de tipologia variada, que se ancoram num núcleo que centraliza actividades de comércio e lazer. Este artigo pretende, através de uma revisão bibliográfica, relacionar o desenvolvimento dos Resorts Integrados com as questões da sustentabilidade, através da verificação dos seus impactes. Por um lado, pretende-se conciliar os fins económicos do desenvolvimento turístico com a manutenção de recursos indispensável à sua existência e por outro lado, perceber como é que este produto turístico contribui para a preservação das características naturais, culturais, sociais e comunitárias da região, como garante da oferta que a médio e a longo prazo poderá será mantida ou mesmo melhorada

The use of sand substrate modulates dominance behaviour and brain gene expression in a Flatfish Species

Physical complexity adds physical enrichment to rearing conditions. This enrichment promotes fish welfare and reduces detrimental characteristics that fish develop in captivity. Senegalese sole (Solea senegalensis) is an important species for European aquaculture, where it is reared in intensive conditions using fibreglass tanks. However, reproductive dysfunctions present in this species do not allow it to complete its life cycle in captivity. Recently, dominance behaviour has been studied to try to solve this problem. The present study aimed to assess the effect of sand as environmental enrichment in the dominance behaviour and brain mRNA abundance of Senegalese sole juveniles. Four tanks of sole (n = 48 fish in total) were established in two different environments (with and without sand). Juveniles were subjected to dominance tests of feeding and territoriality. Behaviours analysed by video recordings related to the distance from the food delivered and harassment behaviour towards other individuals (e.g., resting of the head on another individual). In both environments, dominant sole were the first to feed, displayed more head-resting behaviour and dominated the area close to the feeding point, where the events were reduced in fish maintained in the sand. mRNA expression related to differentiation of dopamine neurons (nr4a2) and regulation of maturation (fshra) were significantly upregulated in dominant fish in the sand environment compared to dominants maintained without sand. The use of an enriched environment may affect Senegalese sole dominance, enhance welfare and possibly advance future maturation.Programa Operacional Mar2020, MAR-16-02-01-FMP-0059; d CONDISOLE (CeiMar funds, CEIJ-005); LA/P0101/2020;info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Allow me to follow you : how can the predictive value of security analyst recommendations best be employed as part of an investment strategy?

This study investigates how to explore abnormal returns from an investment strategy that moves according to publicly available analyst recommendations relative to US companies. The portfolio that buys all the upgrades to Strong Buy and Buy and short sells all the downgrades to Strong Sell and Sell presents annualized abnormal returns of 65%, in the period from 1993 to 2019, compared against the five-factor model of Fama and French with momentum and short term reversal. When calculating the transaction fee that leads to breakeven, the decade from 2010 to 2019 no longer holds significant abnormal returns if incurred in a one-way transaction fee higher than 0,04% of the trading value. This low breakeven fee compromises the profitability of the above investment strategy in current days. It is evidenced in this study that abnormal returns have a peak on the day when the recommendation is announced and that the day before also presents high abnormal returns. Strategies that constraints the stock selection on the level and change of the analyst recommendations bring slightly bigger abnormal returns. Results are higher for smaller firms and robust after testing for the firm’s liquidity and for different time periods.Este estudo investiga como explorar retornos anormais através de uma estratégia de investimento que se move de acordo com as recomendações de analistas disponíveis para o público e relativas a empresas americanas. A carteira que compra todas os upgrades para Strong Buy e Buy e vende Short todos os downgrades para Strong Sell e Sell apresenta retornos anormais anuais de 65%, no período de 1993 a 2019, em comparação com o modelo de cinco fatores de Fama and French com momentum e short-term reversal. Ao calcular os custos de transação que levam ao ponto de breakeven, a década de 2010 a 2019 já não tem retornos anormais significativos se forem incorridos custos de transação unidirecionais maiores que 0,04% do valor transacionado. Esta baixa taxa de breakeven compromete a rentabilidade das estratégias de investimento acima referidas, nos dias de hoje. É comprovado neste estudo que os retornos anormais têm um pico no dia em que a recomendação é anunciada, e que o dia anterior ao anúncio apresenta também retornos anormais elevados. As estratégias que restringem a seleção de ações ao nível e à mudança das recomendações dos analistas trazem retornos anormais ligeiramente maiores. Os resultados são mais elevados para as empresas mais pequenas e são robustos a testes do nível de liquidez das empresas e a diferentes períodos de tempo

Mass spectrometric analysis of epimeric 3α/3β functionalized steroids.

Tandem mass spectrometry (MS/MS) using an atmospheric pressure chemical ionization (APCI) source in positive mode (+) reveals different intensity ratios of two fragment peaks of the epimeric cholestane derivatives synthesized from 3{460}- or 3β-cholestanol. The investigation of the fragmentation pattern obtained from their full scan and/or collision induced dissociation (CID) spectra in the case of the cholestane skeleton together with the respective electronic ionization (EI) spectra supports a distinction of the epimers

Tailoring carbon nanotubes surface chemistry for the purification of antileukemic drugs

Biopharmaceuticals have been used to overcome fatal diseases related with aging. L-aspariginase (LA), in particular, has shown evidences of being efficient for leukemia therapy. The LA production and purification require several steps increasing the cost of the process. In this work, functionalized carbon nanotubes (CNTs) were studied as a cost-effective support to purify LA. It was shown that CNTs have strong affinity for the target biopharmaceutical, meaning that can be a promising alternative for the adsorption and purification of LA.publishe

Contributo para a produção em viveiro de plantas lenhosas ribeirinhas de qualidade

Este documento foi elaborado com o objectivo de divulgar um conjunto de orientações técnicas para a produção em viveiro de plantas lenhosas ribeirinhas de qualidade. Nele são sintetizados os resultados provenientes das actividades desenvolvidas no âmbito do Protocolo INAG – ISA/UTAD “Valorização e Requalificação das Galerias Ribeirinhas na Área do Empreendimento de Odelouca” (Contrato n.º 2004/057/INAG)

Family health nursing approach to leg ulcers

Family Health Nursing focuses its action on the user and family and, due to its centrality and proximity, it is the main responsible for monitoring chronic diseases, where leg ulcers stand out. Given the complications that they represent in the user and family, it is essential that the Family Nurse masters their characteristics, to distinguish their etiology, as well as the different treatments available, adapting them to the particularities and background of the user. Compressive therapy is a good alternative to apply to venous ulcers, if the essential criteria for its application are met. It is up to the Nurse to evaluate them and, when properly instructed, their application, to enhance health gains and cost adequacyinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Anti-tumoral effect of the non-nucleoside DNMT inhibitor RG108 in human prostate cancer cells

Background: Current therapeutic strategies for advanced prostate cancer (PCa) are largely ineffective. Because aberrant DNA methylation associated with inappropriate gene-silencing is a common feature of PCa, DNA methylation inhibitors might constitute an alternative therapy. In this study we aimed to evaluate the anti-cancer properties of RG108, a novel non-nucleoside inhibitor of DNA methyltransferases (DNMT), in PCa cell lines. Methods: The anti-tumoral impact of RG108 in LNCaP, 22Rv1, DU145 and PC-3 cell lines was assessed through standard cell viability, apoptosis and cell cycle assays. Likewise, DNMT activity, DNMT1 expression and global levels of DNA methylation were evaluated in the same cell lines. The effectiveness of DNA demethylation was further assessed through the determination of promoter methylation and transcript levels of GSTP1, APC and RAR-β2, by quantitative methylation-specific PCR and RT-PCR, respectively. Results: RG108 led to a significant dose and time dependent growth inhibition and apoptosis induction in LNCaP, 22Rv1 and DU145. LNCaP and 22Rv1 also displayed decreased DNMT activity, DNMT1 expression and global DNA methylation. Interestingly, chronic treatment with RG108 significantly decreased GSTP1, APC and RAR-β2 promoter hypermethylation levels, although mRNA re-expression was only attained GSTP1 and APC. Conclusions: RG108 is an effective tumor growth suppressor in most PCa cell lines tested. This effect is likely mediated by reversion of aberrant DNA methylation affecting cancer related-genes epigenetically silenced in PCa. However, additional mechanism might underlie the anti-tumor effects of RG108. In vivo studies are now mandatory to confirm these promising results and evaluate the potential of this compound for PCa therapy

First school first robot: caderno de atividades

info:eu-repo/semantics/publishedVersio