Estudi en mostres humanes i en cultius neuronals d'indicadors del sistema glutamatèrgic i dopaminèrgic en relació a l'exposició prolongada a contaminants orgànics tòxics persistents

Memòria presentada per optar el grau de Doctora per la Universitat de Barcelona, Programa de Doctorat de Biomedicina. Departament de Neuroquímica i Neurofarmacologia Institut d’Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB) Consell Superior d’Investigacions Científiques (CSIC); Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS); Consorci d’Investigació Biomédica en xarxa especialitzat en epidemiologia i salud pública (CIBERESP).En esta tesis se investigan los efectos que ejercen ciertos contaminantes orgánico tóxico persistentes en indicadores del sistema glutamatérgico y dopaminérgico. Concretamente se estudia 1) el efecto de contaminantes organoclorados y el metilmercurio en el transporte de glutamato en placenta humana y en los niveles de aminoácidos excitadores, glutamato y aspartato, en sangre de cordón umbilical humana, 2) el efecto de la exposición prolongada (>96h) del PCB 138 y el hexaclorociclohexano (HCH) (gamma o beta) en receptores y transportadores glutamatérgicos en cultivos primarios de neuronas corticales de ratón durante el periodo de maduración, y 3) el efecto de la exposición prolongada (>96h) del PCB 138 y el lindano (gamma-HCH) en receptores y transportadores dopaminérgicos en cultivos de neuroblastoma humano SH-SY5Y durante el periodo de diferenciación. Esta tesi demuestra que dichos contaminantes afectan a la normal funcionamento de distintos parámetros del sistema gluatamatérgico y dopaminérgico en distintas muetsras de estudio, cuando se encuentra a dosis subtóxicas y largos periodos de tiempo, y que dichas alteraciones podrian implicar disfunciones en el neurodesarrollo fetal.Aquesta tesi ha estat possible gràcies a una beca predoctoral IDIBAPS otorgada de gener del 2008 a desembre 2011. Aquest treball ha estat finançat pels següents projectes: “Estudio de mecanismos de neurotoxicidad crónica de contaminantes tóxicos: papel de los receptores GABA-A, de glutamato y de estrógenos. Posibles intervenciones terapéuticas” (PI10/00453); “Identificación de dianas moleculares y funcionales alteradas en procesos de neurotoxicidad inducida por contaminantes ambientales y biocidas en cultivos neuronales” (PI 06/1212); “Determinación de niveles de glutamato y dopamina y de sus transportadores plasmáticos en muestras de sangre y de placenta. Búsqueda de posibles biomarcadores de exposición y efecto para el metilmercurio y otros contaminantes ambientales.” (AA07_012); “Proyecto CIBER Epidemiología y Salud Pública. Neurotoxicidad de agentes ambientales, exposición de la población y salud pública.” (CB06/02/0024); Grupo de Investigación consolidado “Farmacología y Toxicología.” (2009/SGR/214) y Grupo de Investigación consolidado “Farmacología y Toxicología.” (2005/SGR/00826).Peer Reviewe

Estudi en mostres humanes i en cultius neuronals d’indicadors del sistema glutamatèrgic i dopaminèrgic en relació a l’exposició prolongada a contaminants orgànics tòxics persistents

Aquesta tesi neix d’una preocupació creixent: com estan incidint certs contaminants presents al medi ambient (conseqüència de diverses activitats humanes) en la salut de les persones i més en concret en el sistema nerviós. Aquesta tesi té com a objectiu aprofundir en l’estudi dels efectes de certs contaminants orgànics tòxics persistents en diferents paràmetres del sistema glutamatèrgic i dopaminèrgic quan es troben presents a baixes concentracions i de manera perllongada, en especial èmfasi a l’etapa del desenvolupament. La tesi s’ha dividit en tres parts. En la primera part s’estudia l’alteració d’indicadors del sistema glutamatèrgic en mostres humanes de placenta i sang de cordó umbilical en relació als seus nivells de mercuri i contaminants organoclorats. Aquesta primera part s’ha realitzat amb mostres humanes de sang de cordó umbilical i placenta que provenien d’ una cohort de naixement mare-fill del grup de València del projecte INMA (Infància i Medi Ambient) prèviament analitzades pel seu contingut en contaminants organoclorats i mercuri total (T-Hg). Partint del fet que el MeHg inhibeix el transportador de glutamat al sistema nerviós, i que altres contaminants orgànics persistents també actuen en el sistema glutamatèrgic, es va estudiar si els nivells d’aminoàcids excitadors en sang de cordó umbilical, glutamat i aspartat, es veien alterats en funció de les concentracions de contaminants organoclorats i/o T-Hg i també si el transportador de glutamat en placenta es veia inhibit davant l’exposició a contaminants. Es va demostrar que existia una correlació significativament negativa entre la suma de contaminants organoclorats, el PCB 138 i el β-HCH analitzats en sang de cordó umbilical i la concentració de glutamat. Per altre banda, es va observar, que en les mostres amb baix nivell de metilmercuri (<7µg/L) aquesta associació es pronunciava, mentre que en les mostres amb alt contingut (≥21µg/L) l’associació es perdia, insinuant-se un efecte compensatori entre MeHg i contaminants organoclorats. Finalment, es va demostrar com el MeHg inhibia completament el transport de glutamat amb una IC50 de l’ordre de micromolar, mentre que el PCB138 i el β-HCH l’inhibien parcialment, però amb una IC50 de l’ordre de nanomolar. A la segona part es van estudiar els efectes de l’exposició prolongada in vitro a concentracions subcitotòxiques de PCB138 i hexaclorciclohexà (HCH) en transportadors i receptors glutamatèrgics en cultius primaris de neurones corticals de ratolí. Per tal d’estudiar la funcionalitat dels receptors glutamatèrgics es va mesurar l’entrada de calci activada pels corresponents agonistes en presència i/o absència dels contaminants PCB 138 i el γ-HCH (lindà). El PCB 138 i el γ-HCH (lindà) en exposicions agudes van potenciar el senyal de calci mediat pel receptor glutamatèrgic d’NMDA (N-metil-D–aspartat). L’exposició prolongada (6 dies in vitro, DIV)a concentracions subcitotòxiques de PCB 138 i el γ-HCH (lindà) durant el procés de maduració neuronal va augmentar el senyal de calci intracel•lular induït per NMDA respecte el control. L’expressió de la subunitat NR1 del receptor en el procés de maduració va disminuir en presència dels contaminants durant 6 DIV respecte el control. En la tercera part es va estudiar l’efecte de l’exposició prolongada a dosis subcitotòxiques de PCB138 i γ-HCH en cèl•lules humanes de neuroblastoma SH-SY5Y diferenciades amb àcid retinoic. Es va observar que el γ-HCH disminuïa de manera dosi-dependent l’expressió de mRNA i l’expressió proteica del transportador vesicular de monoamina 2 (VMAT2) i el receptor de dopamina D2 (DRD2 L i S) quan es trobava present en aquestes cèl•lules durant el període de diferenciació durant 6DIV. En canvi el PCB 138 no va modificar la expressió de VMAT2 ni de DRD2. Aquest estudi aporta més informació dels efectes que exerceixen certs contaminants organoclorats, reforçant altres estudis àmpliament descrits on es posa de manifest l’impacte de dits contaminants en la salut humana.This thesis appears as a consequence of a growing concern: how the environmental contaminants are affecting health and particularly the nervous system. The aim of this thesis is to study how certain persistent organic toxic pollutants affect dopaminergic and glutamatergic parameters when they are present at low-doses and long-time, especially in the developmental period. The thesis is divided in three parts. In the first part it has been determined the excitatory aminoacid levels (glutamate and aspartate) in 40 human umbilical cord blood samples from a Spanish cohort and their levels have been related to the total mercury (T-Hg) and organochlorine compounds (OCs) content. It has also been studied the inhibition of glutamate transport in human placentas by methylmercury (MeHg), polychlorobiphenyl 138 (PCB 138) and beta-hexaclorocyclohexane (β-HCH). T-Hg did not show a significant correlation with glutamate nor aspartate levels in cord blood, but PCB138, β-HCH, and the sum of the 8 OCs analyzed showed a significant negative correlation with the levels of glutamate. A significant compensatory effect between T-Hg and PCB138, 4,4’-DDE and the sum of the 8 OCs analyzed has been observed. We also demonstrate that MeHg inhibit completely the glutamate transport while PCB138 andβ-HCH inhibited partially but with nanomolar affinity. In the second part we studied the effects that PCB138 and (HCH) produced on the glutamatergic receptors in primary cultures of cortical neurons (CTX) exposed to low concentrations for long period (6 days in vitro, DIV). We show that PCB 138 and lindane increased the calcium signal induced by NMDA (N-methyl-D-aspartate) in acute and long-period expositions. Also we show that PCB 138 and lindane reduced the expression of NR1 subunit in CTX cultures when they are present during 6 DIV. In the third part, we studied the effect of prolonged exposure of PCB 138 and lindane on dopaminergic receptors D2 (DRD2) (S & L isoforms) and the vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) on SH-SY5Y human neuroblastoma cells line differentiated with retinoic acid. Exposure to γ-HCH during the differentiation period decreased in a dose-dependent way the mRNA and protein expression of VMAT2 and DRD2 (L and S). PCB 138 did not modify the expression of VMAT2 or DRD2. This study provides information on the effects of certain organochlorine pollutants on glutamate and dopamine processes, reinforcing other studies which described the impact of these pollutants on human health

Influence of prenatal exposure to environmental pollutants on human cord blood levels of glutamate

El pdf del artículo es la versión post-print.Some chemicals released into the environment, including mercury and some organochlorine compounds (OCs), are suspected to have a key role on subclinical brain dysfunction in childhood. Alteration of the glutamatergic system may be one mechanistic pathway. We aimed to determine whether mercury and seven OCs, including PCBs 138, 153, and 180, DDT and DDE, hexachlorobenzene (HCB), and beta-hexachlorocyclohexane (β-HCH) influence the cord levels of two excitatory amino acids, glutamate and aspartate. Second, we evaluated if this association was mediated by glutamate uptake measured in human placental membranes. The study sample included 40 newborns from a Spanish cohort selected according to cord mercury levels. We determined the content of both amino acids in cord blood samples by means of HPLC and assessed their associations with the contaminants using linear regression analyses, and the effect of the contaminants on glutamate uptake by means of [3H]-aspartate binding in human placenta samples. PCB138, β-HCH, and the sum of the three PCBs and seven OCs showed a significant negative association with glutamate levels (decrease of 51, 24, 56 and 54%, respectively, in glutamate levels for each 10-fold increase in the contaminant concentration). Mercury did not show a significant correlation neither with glutamate nor aspartate levels in cord blood, however a compensatory effect between T-Hg and both PCB138, and 4,4'-DDE was observed. The organo-metallic derivative methylmercury completely inhibited glutamate uptake in placenta while PCB138 and β-HCH partially inhibited it (IC50 values: 4.9±0.8μM, 14.2±1.2nM and 6.9±2.9nM, respectively). We conclude that some environmental toxicants may alter the glutamate content in the umbilical cord blood, which might underlie alterations in human development. © 2013 Elsevier Inc.This work was supported by the Spanish Ministries of Health and of Science and Innovation cofinanced with European Social Funds (PI 03/1615, 04/1509, 04/1112, 04/1931, 05/1052, 05/1079, 07/0314, 09/02467, 10/0453, 11/01007, 11/02591, 13/1252); Instituto de Salud Carlos III (Red INMA G03/176, CB06/02/0024, CB 06/02/0041 and Programa Miguel Servet: CP11/0178); the FP7 UE Program (ENV-2011-282957 and HEALTH 2010.2.4.5-1), the Generalitat of Catalunya [2009/SGR/214] and the Conselleria de Sanitat Generalitat Valenciana; CIBER de Epidemiologia y Salud Pública (CIBERESP)(AA07-012)], and Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) (Predoctoral fellowship to A.P).Peer Reviewe

Influence of environmental pollutants on human cord blood levels and placental uptake of glutamate.

Trabajo presentado en las 10ª Jornadas Científicas INMA, celebradas en Barcelona, España los días 15 y 16 de noviembre de 2012Peer Reviewe