Endophytic fungi from the roots of horseradish (Armoracia rusticana) and their interactions with the defensive metabolites of the glucosinolate myrosinase – isothiocyanate system

K

Analytical and chemometric tools for the metabonomic study of complex biological matrices by High- Resolution Mass Spectrometry

Mes travaux de thèse mettent en avant le développement de la stratégie métabonomique dans le cadre de deux thématiques d'actualité : le domaine du dopage sportif (Partie A) et celui de l'Exposome (Partie B). La première partie regroupe deux études et a pour objectif d'évaluer la contribution de la métabonomique au développement de nouveaux outils de criblage du dopage. Au cours de ces études, je me suis intéressée à l'analyse non-ciblée d'échantillons d'urine d'athlètes dopés et non- dopés, fournis par l'Agence Française de Lutte contre le Dopage et par des volontaires. L'originalité de cette démarche réside dans son caractère non-ciblé et plus particulièrement, dans sa capacité à mettre en évidence des perturbations au niveau métabolique grâce à (i) la spectrométrie de masse haute résolution (ToF) et très-haute résolution (FT-ICR) et (ii) l'analyse de données multivariées. Des potentiels biomarqueurs du dopage au tétrahydrocannabinol, salbutamol et budésonide ont ainsi pu être mis en évidence. La deuxième partie de ma thèse a pour objectif d'évaluer l'impact de la vinclozoline sur le système hormonal de rats et répond ainsi aux besoins de la nouvelle réglementation. Pour cette étude, je me suis donc intéressée aux échantillons de testicules de rats ayant subi un traitement à la vinclozoline. De par son caractère compréhensif, l'approche métabonomique m'a permis d'apporter des informations complémentaires aux études ciblées réalisées auparavant. Ces travaux me permettent alors de mettre en évidence les apports et les limites de la stratégie métabonomique par rapport : (1) au choix et à la préparation des échantillons d'origine biologique, (2) aux avantages et aux inconvénients des différentes techniques analytiques, (3) aux possibilités en termes de traitement des données, (4) aux exigences statistiques et (5) à la valeur biologique des résultats obtenusMy research work highlights the development of a metabonomic strategy through two topical issues: the doping in sport (Part A) and the Exposome (Part B). The first part includes two studies and aims to assess the contribution of metabonomics to the development of new screening tools. During these studies, I focused on the non-targeted analysis of clean and doped urine samples provided by the French Anti-Doping Agency and by volunteers. The originality of this approach lies in its non-targeted nature and, particularly, in its ability to highlight metabolic disruptions by (i) high-resolution (ToF) and very high-resolution (FT ICR) mass spectrometry and (ii) the analysis of multivariate data. The implemented strategy revealed several potential biomarkers for the use of tetrahydrocannabinol, budesonide and salbutamol. The second part of this thesis aims to evaluate the impact of vinclozolin on the hormonal system of rats and thus meets the requirements of the new regulations. For this study, I focused on testes extracts coming from rats treated with vinclozolin. Due to its comprehensive nature, the metabonomic study provided additional information to the previous targeted approach. All these results highlight the contributions and the limitations of metabonomics with regard to: (1) the choice and the preparation of biological samples, (2) the advantages and disadvantages of different analytical techniques, (3) the opportunities in terms of data processing, (4) the statistical requirements and (5) the biological value of the result

Doping control using high and ultra-high resolution mass spectrometry based non-targeted metabolomics-a case study of salbutamol and budesonide abuse.

We have detected differences in metabolite levels between doped athletes, clean athletes, and volunteers (non athletes). This outcome is obtained by comparing results of measurements from two analytical platforms: UHPLC-QTOF/MS and FT-ICR/MS. Twenty-seven urine samples tested positive for glucocorticoids or beta-2-agonists and twenty samples coming from volunteers and clean athletes were analyzed with the two different mass spectrometry approaches using both positive and negative electrospray ionization modes. Urine is a highly complex matrix containing thousands of metabolites having different chemical properties and a high dynamic range. We used multivariate analysis techniques to unravel this huge data set. Thus, the several groups we created were studied by Principal Components Analysis (PCA) and Partial Least Square regression (PLS-DA and OPLS) in the search of discriminating m/z values. The selected variables were annotated and placed on pathway by using MassTRIX

The IbeA protein from adherent invasive Escherichia coli is a flavoprotein sharing structural homology with FAD‐dependent oxidoreductases

International audienceInvasion of brain endothelium protein A (IbeA) is a virulence factor specific to pathogenic Escherichia coli. Originally identified in the K1 strain causing neonatal meningitis, it was more recently found in avian pathogenic Escherichia coli (APEC) and adherent invasive Escherichia coli (AIEC). In these bacteria, IbeA facilitates host cell invasion and intracellular survival, in particular, under harsh conditions like oxidative stress. Furthermore, IbeA from AIEC contributes to intramacrophage survival and replication, thus enhancing the inflammatory response within the intestine. Therefore, this factor is a promising drug target for anti‐AIEC strategies in the context of Crohn's disease. Despite such an important role, the biological function of IbeA remains largely unknown. In particular, its exact nature and cellular localization, i.e., membrane‐bound invasin versus cytosolic factor, are still of debate. Here, we developed an efficient protocol for recombinant expression of IbeA under native conditions and demonstrated that IbeA from AIEC is a soluble, homodimeric flavoprotein. Using mass spectrometry and tryptophan fluorescence measurements, we further showed that IbeA preferentially binds flavin adenine dinucleotide (FAD), with an affinity in the one‐hundred nanomolar range and optimal binding under reducing conditions. 3D‐modeling with AlphaFold revealed that IbeA shares strong structural homology with FAD‐dependent oxidoreductases. Finally, we used ligand docking, mutational analyses, and molecular dynamics simulations to identify the FAD binding pocket within IbeA and characterize possible conformational changes occurring upon ligand binding. Overall, we suggest that the role of IbeA in the survival of AIEC within host cells, notably macrophages, is linked to modulation of redox processes

Élimination des composés pharmaceutiques en station d’épuration par traitements biologiques et ozonation tertiaire

National audienceThe choice to operate the CAS and MBBR systems with full nitrification, results in the same level of performance on pharmaceutical compounds removal for both biological systems (despite the differences on process conditions : sludge concentration, hydraulic contact time…).The biological treatment of 10 pharmaceuticals with CAS or MBBR reactor succeeded in 24% of removal of the 7 refractory compounds measured (carbamazepine, sulfamethoxazole, propranolol, atenolol, diclofenac, econazole, salicylic acid), and an average of 45% including also paracetamol, ketoprofen and ibuprofen with an important variability on performances (> 20%). The combined system CAS biolog ical treatment plus tertiary ozonation at low ozone dosage (0.45 gO3/gDOC) improves the average removal up to 92% with only one compound -econaz ole- moderately eliminated (70%). It has been observed that increasing the ozone from the low to the intermediate dosage of 1.30 gO3/gDOC leads to an average removal improvement of around 6% whereas a more important TOD (2.30 gO3/gDOC) did not led to a better performance.Contrary to the lack of toxicity observed with normalized ecotoxicity tests, endpoints measured on zebrafish embryos (FET bioassay) such as mortality, developmental abnormalities and genotoxicity demonstrated a residual toxicity (null/weak) both, in wastewater after a biological treatment followed or not by a tertiary ozonation treatment. However, the tertiary ozonation resulted in an improvement of the residual endocrine disrupting potential measured in the biologically-treated effluents.This study shows that normalized bioassays are not sensitive enough for the ecotoxicological evaluation of wastewaters and that there is a great need for the development of suitable sensitive bioassays in order to characterize properly the possible residual toxicity of differently treated effluents.The knowledge of the sample chemical fingerprints, by a comprehensive non-target approach based on the comparison of biochemical signatures, is a promising growing strategy to identify and prioritize the emerging contaminants and to contribute to the study of the treatment performance.Les performances atteintes par les deux systèmes biologiques étudiés – boues activées conventionnelles (BA) et réacteur biologique à biomasse fluidisée (MBBR) – dans le traitement des dix micro— polluants d’origine pharmaceutique quantifiés sont similaires et cela grâce au niveau d’épuration identique en nitrification totale.Les abattements quantifiés sont variables et atteignent en moyenne pour les sept composés réfractaires seulement 24% (carbamazépine, sulfaméthoxazole, propranolol, aténolol, diclofénac, éconazole, acide salicylique). Les trois autres composés, bien éliminés en traitement biologique, atteignent en moyenne 96% (paracétamol, kétoprofène et ibuprofène).Le traitement biologique combiné à l’ozonation tertiaire élimine efficacement les composés pharmaceutiques de l’eau dès l’utilisation des doses faibles d’ozone (0,45 gO3/g de carbone organique dissous COD). Un abattement moyen de 92% d’efficacité est quantifié sur la moyenne de composés pharmaceutiques dissous, à comparer aux 24% à 45% d’abattement obtenu en traitement bio logique seul. Le passage à une dose d’ozone de 1,30 gO3/gCOD permet d’augmenter de 6% l’abattement moyen des micropolluants. Cette performance n’est pas améliorée par l’utilisation des doses d’ozone plus importantes.Contrairement aux tests d’écotoxicité normalisés (peu sensibles pour discriminer des effets toxiques dans les eaux traitées biologiquement ou chimiquement), les effets mesurés sur les embryons du poisson Danio rerio comme la mortalité, les anomalies sur le développement et la génotoxicité ont montré un effet toxique (nul à faible) pour les effluents biotraités ou ozonés. Par rapport au traitement biologique, l’ozonation tertiaire améliore significativement le potentiel de perturbation endocrinienne des effluents par la réduction complète de l’activité oestrogénique et glucocorticoïde des effluents.L’ozonation n’augmente ni ne diminue le niveau de toxicité des effluents déjà atteint avec le traitement biologique seul. Il existe un bruit persistant probablement lié à la présence d’autres micro - polluants rémanents dans l’eau et non quantifiés par la méthode d’analyse ciblée. Leur activité peut être à l’origine du niveau d’effet toxique faible obtenu pour certains biomarqueurs. Ces résultats montrent la nécessité d’améliorer la sensibilité des bioessais dans le but d’optimiser l’évaluation des effets écotoxicologiques résiduels dans les différents types d’effluents.L’obtention des signatures chimiques, au travers d’une approche non ciblée, s’avère un outil puissant et complémentaire. Elles révèlent la complexité des effluents étudiés par le nombre important de signaux obtenus. Les cartographies réalisées, par l’analyse en composantes principales, permettent d’avoir une vision globale des effluents et de leur mise en relation respective. Cette approche globale complète efficacement les résultats obtenus par le dosage ciblé des micropolluants

Study design and general strategy.

<p>Study design and general strategy.</p

Principal Component Analysis showing clusters corresponding to the 4 groups (B, S, V, CA).

<p>Principal Component Analysis showing clusters corresponding to the 4 groups (B, S, V, CA).</p

CA vs. V discriminant profiles: (a) creatine and (b) xanthosine.

<p>CA vs. V discriminant profiles: (a) creatine and (b) xanthosine.</p

UHPLC-QTOF/MS chromatogram.

<p>UHPLC-QTOF/MS chromatogram.</p

S vs. CA discriminant profiles: (a) pantothenic acid and (b) salbutamol.

<p>S vs. CA discriminant profiles: (a) pantothenic acid and (b) salbutamol.</p