荧光PCR和PFGE在副溶血弧菌食物中毒诊断中的应用研究

[目的]探讨荧光PCR和脉冲场电泳(PFGE)在副溶血弧菌食物中毒调查中的应用。[方法]对中毒样品进行荧光PCR检测,副溶血弧菌临床分离株基因组DNA经NotI酶切,通过PFGE获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。[结果]部分样品荧光PCR检测结果呈阳性,同起食物中毒菌株PFGE图谱一致。[结论]荧光PCR可以快速准确的鉴定病原体。PFGE具有很强的菌株同源性分析能力,适用于食物中毒病原菌学鉴定和传染源溯源。荧光PCR和PFGE在食物中毒的快速诊断中可发挥重要作用

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的:建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌(LMO)的快速方法,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法:根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标-实时PCR检测体系,应用于食品中LMO检测。结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110 fg,菌液灵敏度为99 cfu/m l或4 cfu/PCR反应体系,无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时间由原来的至少4 d缩短至1 d。对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性,其中6份LMO细菌培养阳性。结论:改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,能提高LMO的检出率和准确性,可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断

实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7

目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7,应用于细菌性食物中毒的快速诊断。方法根据GeneBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因序列和大肠杆菌O157:H7rfbE基因序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标-双重实时PCR检测体系。结果双重荧光PCR反应体系检测151株金黄色葡萄球菌和27株大肠杆菌O157:H7,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对8762份大便、食品等标本进行检测,315份标本金黄色葡萄球菌实时荧光PCR阳性,其中286份金黄色葡萄球菌培养阳性;31份标本大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR阳性,其中26份大肠杆菌O157:H7培养阳性。从样品处理到检测结果仅需要时间2h~1d。结论改良分子信标-多重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7食物中毒的快速诊断和肠道传染病的初筛,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段

改良分子信标-实时PCR快速检测副溶血弧菌

目的 :建立改良分子信标 -实时 PCR检测副溶血弧菌的快速方法 ,应用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法 :根据 Gen Bank公布副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因 (TDH)的保守序列 ,设计一对引物和改良分子信标探针 ,用 FAM荧光剂标记探针的 5′,并进行特异性和灵敏度分析 ;同时以 11种细菌作对照 ,建立改良分子信标检测副溶血弧菌的实时 PCR反应体系 ,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果 :检测 12种细菌 ,只有副溶血弧菌有荧光信号 ,与其他细菌无交叉反应 ,DNA灵敏度为 16 6 .6 fg/ μl,菌液灵敏度为 6 9cfu/ ml或 6 cfu/ PCR反应体系。改良分子信标 -实时 PCR反应体系检测 4 0株副溶血弧菌均出现特异的荧光信号 ,无干扰。对 3起细菌性食物中毒共 4 8份样品和 10 0份海产品进行检测 ,9份副溶血弧菌实时 PCR阳性 ,其中 7份副溶血弧菌细菌培养阳性 ,其余样品都为阴性。检测时间仅需 2 h。结论 :改良分子信标 -实时 PCR检测体系快速、灵敏度高 ,特异性强 ,可用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断 ,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手

产单核李斯特菌的改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测体系的建立

[目的]建立改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测产单核李斯特菌(LMO)的体系,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。[方法]根据GenBank公布的LMOhlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标荧光PCR检测体系。运用磁捕获材料对PCR检测阳性的增菌液进一步处理后划平皿做分离培养。[结果]改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110fg,菌液灵敏度为99cfu/ml或4cfu/PCR反应体系,无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号。对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性。用磁捕获材料处理此8份增菌液,全部细菌培养阳性,高于国标法的6份阳性。[结论]改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,运用磁捕获试剂能有效提高培养阳性率。应用该检测系统能提高LMO的检出率和准确性。该系统可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断

双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌

目的建立改良分子信标双重实时PCR同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时PCR改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测。结果改良分子信标双重实时PCR反应体系DNA灵敏度为102.4～166.6fgμl,菌液灵敏度为32～64CFUml或3～6CFUPCR反应体系,无交叉反应。此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性。从样品处理到检测结果仅需1天时间。结论改良分子信标双重实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段

改良分子信标—实时PCR快速检测霍乱弧菌

目的　建立改良分子信标—实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法 ,应用于霍乱监测。　方法　根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位 (ctxA)的保守序列 ,设计一对引物和改良分子信标探针 ,并进行特异性和灵敏度分析 ;同时以 11种细菌作对照 ,建立改良分子信标检测霍乱弧菌的实时PCR反应体系 ,应用于霍乱监测。　结果　霍乱弧菌改良分子信标检测体系检测 12种细菌 ,只有霍乱弧菌有荧光信号 ,与其他细菌无交叉反应 ,DNA灵敏度为10 2 4fg/ul ,菌液灵敏度为 3 2cfu/ml或 3cfu/PCR反应体系。对 10 0份海产品和 3 0份腹泻病人大便标本进行检测 ,结果都为阴性。检测时间仅需 2h。　结论　改良分子信标—实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强 ,可用于霍乱的快速诊断 ,为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手

改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O_(157):H_7

目的建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157H7的快速方法。方法根据GenBank公布O157H7的rfbE保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5’端,建立改良分子信标实时PCR检测O157H7的反应体系,应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果共检测11种细菌,只有大肠杆菌O157H7有荧光信号,其余10种全无荧光信号,且与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为64fg,菌液灵敏度为59cfu/ml或2cfu/PCR反应体系。应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O157H7均出现特异的荧光信号,无干扰。对89份食品样品进行检测,5份O157H7实时PCR阳性,其余样品为阴性,检测仅需2h。5份阳性样本,经传统方法培养,有3份检出大肠杆菌O157H7。结论改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于大肠杆菌O157H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段

食品污染产单核李斯特菌不同检测方法学评估

目的评价以不同方法检测食品中污染产单核李斯特菌(LMO)效果,并对其检测方法进行优化。方法同时用国标法、改良国标法、改良分子信标-实时荧光PCR法、免疫磁性分离法对深圳市2004～2006年食品样品进行LMO分离鉴定并进行比较。结果228份样品中8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性,其中6份LMO细菌培养阳性。国标法、改良国标法,改良分子信标-实时荧光PCR法、免疫磁性分离法都能检出LMO,检出率分别为2.63%、2.63%、3.50%、2.63%。深圳市食品中LMO的污染率为2.63%(国标法),速食类冻品污染率为12.8%(国标法)。结论荧光PCR法检出率最高,将检测时间由原来的至少4～5d缩短至1d,可用于食品污染LMO状况调查的初筛和食物中毒的快速诊断;国标法与改良国标法的检出率相等,而后者的操作更方便。免疫磁性分离法的检出率最低

改良分子信标-实时PCR快速检测志贺菌

目的:建立改良分子信标-实时PCR检测志贺菌的快速方法,应用于志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。方法:根据GenBank公布志贺菌ipaH基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR-改良分子信标检测体系,应用于对志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为93 fgμ/l,菌液灵敏度为64 cfu/m l或2 cfu/PCR反应体系,无交叉反应。此反应体系检测67株志贺菌,均出现特异的荧光信号。对细菌性食物中毒样本等共657份样品进行志贺菌检测,42份志贺菌实时PCR阳性,其中41份志贺菌细菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需2 h~1 d时间。结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于志贺菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段,对于提高肠道门诊的工作效率有重要意义