目的:建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌(LMO)的快速方法,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法:根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标-实时PCR检测体系,应用于食品中LMO检测。结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110 fg,菌液灵敏度为99 cfu/m l或4 cfu/PCR反应体系,无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时间由原来的至少4 d缩短至1 d。对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性,其中6份LMO细菌培养阳性。结论:改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,能提高LMO的检出率和准确性,可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断

张顺祥

扈庆华

李庆阁

林一曼

王冰

石晓路

贺连华

郑琳琳

Xiamen University Institutional Repository

[基金项目 ]  国家自然科学基金资助项目 ( 30300281 ) ,广东省卫生厅资助项目 ( A2003709) ,深圳市科技局资助项目( 200404139)[作者简介 ]  王冰 ( 1977- ), 女,大学本科,技师, 主要从事微生物检验研究。【论著】改良分子信标 -实时 PCR快速检测产单核李斯特菌王  冰1,扈庆华 1,石晓路 1, 李庆阁2,郑琳琳 2,林一曼 1, 贺连华1,张顺祥 1( 11广东省深圳市疾病预防控制中心, 广东深圳  518020; 21厦门大学生命科学学院,福建厦门  361005)[摘要 ]  目的: 建立改良分子信标 -实时 PCR检测产单核李斯特菌 ( LMO )的快速方法, 应用于食品中 LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法: 根据 GenBank公布的 LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针, 建立改良分子信标 -实时 PCR检测体系, 应用于食品中 LMO检测。结果: 改良分子信标 -实时 PCR反应体系 DNA灵敏度为110 fg,菌液灵敏度为 99 cfu /m l或 4 cfu /PCR反应体系,无交叉反应。以此反应体系检测 28株 LMO,均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时间由原来的至少 4 d缩短至 1 d。对 228份食品进行 LMO检测, 8份增菌液 LMO实时荧光PCR阳性,其中 6份 LMO细菌培养阳性。结论: 改良分子信标 -实时 PCR反应体系快速、灵敏度高, 特异性强, 能提高LMO的检出率和准确性,可应用于 LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断。[关键词 ]  产单核李斯特菌; 改良分子信标;实时 PCR;检测[中图分类号 ]  R378199+ 4    [文献标识码 ]  A    [文章编号 ]  1004- 8685( 2006) 06- 0644- 03Rapid simultaneous detection ofL isteriamonocytogenes usingmodifiedmolecular beaconsand real- tim e PCRW ang B in1, H u Q ing-hua1, Sh iX iao-lu1, L i Q ing-ge2, Zheng L in-lin2, L in Y i-m an1, H e L ian-hua1, Zhang Shun-x iang1( 11Shenzhen Center fo rD iseaseContro l and P revention, Shenzhen 518020, Ch ina; 21Schoo l o fL ife Sc iences, X iam en University,X iam en 361005, Ch ina)[ Abstract]  Objective: Rapid de tection o fL is teria monocy togenes ( LMO ) using m od ified m o lecu la r beacons and rea l- tim e PCRw as developed1The estab lished m ethod w as applied to an investiga tion o f the in fec tious status o fL isteria m onocy togenes in food andLMO food poisoning1Methods: One set of pr imers w as designed based on the co re sequence o f hlyA gene pub lished on GenB ank todetect LMO1The co rrespond ing mod ified mo lecular beacons labe led w ith FAM were designed1Them odified mo lecular beacons andrea l- time PCR assay w ere app lied to detect the LMO in food1Resu lts: For them odified mo lecular beacons- based real- tim e PCRassay, the sensitiv ity ach ieved w as 110 fg or 4 cfu /PCR reaction1The re was no cross - reaction w ith othe r bacteria as control1Therea l- time PCR assay w as used to detect 28 LMO stra ins, no false signals w ere observed1The detection tim e w as reduced from atleast five days to on ly one day1A to tal of 228 food po ison ing sam ples were tested, 8 were found LMO positive by real- timePCR1Among the tested positive sam ples, 6 w ere LMO positive bym odified trad itiona lme thod1The de tection rate of LMO in food inShenzhen was 2163% 1Conclu sion: Themodified mo lecular beacons- based rea l- time PCR assay is rapid, sens itive and specific1 Itcould be app lied to the rapid diagnosis o f LMO food po isoning and investigation of the infectious status of it in food1[ Key words]  L ister ia m onocy togenes; M odified m o lecu lar beacon; Real- tim e PCR; Detec tion  产单核李斯特菌 ( L1m onocy togenes, 以下简称 LMO )广泛分布于自然界, 是一种人畜共患病的病原菌, 它能引起败血症、脑膜炎以及流产等疾病, 病死率高达 30% [1]。WHO已将其列为 90年代食品四大致病菌之一 [ 2]。自 1926年首次报道李斯特氏病以来, 欧美等国食源性 LMO病爆发的报道日益增多 [ 3]。目前, 我国尚无食源性 LMO病爆发流行的报道, 但是动物中的 LMO病的爆发流行和禽肉中 LMO的污染情况已见报道 [4]。目前 LMO的检验仍以传统培养法为主, 但操作繁琐, 耗时长, 且阳性率低。随着分子生物学技术的发展, 人们采用PCR技术应用于细菌的快速诊断,然而传统 PCR技术易污染,造成检测失败。自 1995年美国 PE公司提出实时 PCR检测原理后,实时 PCR以其快速、定量、无需后电泳、无交叉污染等突出优点而被广泛采用。改良分子信标是我们在分子信标探针基础上提出的一种新型分子探针, 以它为基础建立的实时PCR技术 ,可以更好地实现多重实时 PCR检测多种致病菌。本文采用改良分子信标技术建立 LMO的实时 PCR方法, 和国家标准检测方法进行比较, 评价新方法的准确性和灵敏度, 并应用于深圳市食品中 LMO的污染状况调查。644 中国卫生检验杂志 2006年 6月第 16卷 第 6期  C hinese Jou rnal ofH ea lth Laboratory Technology, Jun 2006; V ol 16 No 61 材料与方法11 1 试剂李斯特增菌肉汤基础、1% 盐酸丫啶黄、1% 萘啶酮酸钠盐、SIM琼脂、三糖铁琼脂均由北京陆桥技术有限公司提供;羊血平板由惠安生物科技公司提供; AP I L ISTER IA鉴定试剂条由法国生物梅里埃公司提供; T aq E由大连宝生公司提供;荧光 PCR引物与探针由上海生工生物工程公司合成并标记。11 2 主要仪器iCyc ler实时 PCR扩增仪 (美国 B io- Rad公司出品 );荧光显微镜 (型号: BX50 - 32E01; 日本奥林巴斯公司 ); U ltro-spec2000紫外可见光蛋白核酸分析仪 ( Pharm acia公司 )。11 3 实验用菌株28种细菌共 83株菌株, 分别来自中国药品生物制品检定所、军事医学科学院以及本实验室从食品中分离。详见表 1。表 1 实验用菌株菌株名称及菌号 英文名称 菌株数 菌株来源甲型副伤寒沙门菌 ( 50001 ) S1paratyph iA 1 检定所乙型副伤寒沙门菌 ( 50004 ) S1paratyph iB 1 检定所丙型副伤寒沙门菌 ( 50017 ) S1paratyph iC 1 检定所伤寒沙门菌 ( 47727) S1 typhi 1 检定所蜡样芽孢杆菌 ( 63301 ) Ba cillu s cereus 1 检定所弗劳地枸橼酸杆菌 ( 48001 ) Citrobac ter freud ii 1 检定所肉毒梭菌 ( 64203) Clostridium botu linum 1 检定所产芽孢梭菌 ( 64941) C lostrid ium sporog enes 1 检定所产气肠杆菌 ( 45103) En terobac ter aerog enes 1 检定所阴沟肠杆菌 ( 45301) Enterobacter cloacae 1 检定所大肠埃希菌 ( 44104) E scherich ia coli 1 检定所产单核李斯特菌 ( 54001- 4、54007- 2) L ister ia monocytog enes 2 检定所奇异变形杆菌 ( 49003 ) Proteu s mirabilis 1 检定所普通变形杆菌 ( 49001 ) Proteu s vu lgaris 1 检定所粘质沙雷氏菌 ( 41002 ) S erra tia marcescen s 1 检定所鲍式志贺菌 ( 51265) S hige lla boydii 1 检定所痢疾志贺菌 ( 51376) Shig ella dysen teria e 1 检定所福氏志贺菌 ( 51093) Sh ig ella flexneri 1 检定所宋内氏志贺菌 ( 51081 ) Sh ige lla sonn ei 1 检定所金黄色葡萄球菌 ( 26001 ) S taphylococcus areus 1 检定所粪链球菌 ( 33219) S trep tococcus 1 检定所乙型溶血性链球菌 ( 32210 ) S trep tococcu s h emolytic- B 1 检定所副溶血弧菌 ( 20001) Vibrio parahaemolyticu s 1 检定所霍乱弧菌 ( 16001) Vibrio cholera 1 检定所小肠结肠炎耶尔森氏菌 ( 52201) Yersinia en terocolitica 1 检定所产单核李斯特菌 L ister ia monocytog enes 10 蛇口检验检疫局产单核李斯特菌 L ister ia monocytog enes 12 军事医学科学院格氏李斯特菌 1 军事医学科学院威氏李斯特菌 1 本次调查分离英诺克李斯特菌 27 本次调查分离产单核李斯特菌 L ister ia monocytog enes 6 本次调查分离114 菌株的分离和鉴定李斯特氏菌的分离鉴定参照 GB /T47891 30 - 2003以及API L ISTER IA鉴定试剂盒说明书进行检测。115 模板提取( 1) DNA 提取: 菌株经 LB1 增菌培养过夜后, 菌体用500 L l TE buffer悬浮, 加入终浓度为 50 Lg /L l溶菌酶, 37e作用 1 h,然后再加入终浓度为 1% SDS和 01 2Lg /L l的蛋白酶 K, 55e 作用 1 h后,用酚 -氯仿抽提 DNA。 ( 2)取 1 m l菌液, 离心沉淀,制备菌悬液, 煮沸, 离心, 取上清液 5L l即可用于实时 PCR反应。116 样品采自深圳市某肉菜市场、深圳市某超市、深圳市某牛奶厂、深圳市进出口检疫局蛇口分局、深圳市各商场及食品厂家等各类样品共 5类 7个品种 228份。每份样品均无菌采样,无菌独立包装, 每件样品约 200 g ( m l), 在 4e 保存 , 4 h 内送达实验室 (如不马上增菌则放置 - 20e 保存 )。117 样品模板 DNA提取将食品样品用 LB1增菌过夜后,取 1 m l增菌液于 EP管,12 000 r /m in离心 2 m in,弃去上清, 加 1 000 L l灭菌三蒸水洗涤, 12 000 r /m in离心 2 m in, 重复用灭菌三蒸水洗涤三次, 加100 L l灭 菌三蒸水混匀, 100e 干浴 器中裂解 10 m in,10 000 r /m in离心 1 m in, 取 5L l加入荧光 PCR体系。118 改良分子信标检测体系的建立11811 引物和探针设计  根据 GenBank公布的 LMO溶血素基因 ( h lyA )序列进行比较分析, 自行设计一对引物和探针。探针 5c端标记 FAM, 3c端标记 DBCYE。引物和探针均由上海Sangon公司合成。11812 PCR反应条件  反应总体积为 25L ,l内含 5L l模板,215 L l 10 @ PCR缓冲液, 115 mmo lM gC l2, 01 25 mmo l/L dNTP,1 UT aq酶, 25 pm o l引物, 25 pm o l探针。实时 PCR反应参数为: 94e 预变性 5 m in, 40个循环中 94e 变性 20 s, 52e 退火 25 s, 72e 延伸 20 s。采用退火阶段检测荧光。11813 特异性检测  抽提表一所列细菌的 DNA, 对 h lyA基因进行改良分子信标实时 PCR扩增。11814 灵敏度分析  选一株 LMO (编号为 54001- 4)作为灵敏度分析的代表株。包括 DNA灵敏度分析和菌液灵敏度分析。DNA灵敏度分析:按常规 DNA提取方法提取模板 DNA。用 U ltrospec2000紫外可见光蛋白核酸分析仪测 DNA的浓度。然后进行 5倍稀释,每个稀释度取 1 L l用于实时 PCR反应。菌液灵敏度分析: 菌株经 LB1增菌过夜后, 进行 10倍稀释,共做 10个稀释度, 然后依次取 10个稀释度的 1 m l菌液进行实时 PCR反应。同时参照 GB /T478912- 2003做细菌总数计数。119 实时 PCR反应体系的应用以国标方法作为对照 (生化鉴定部分采用 API L ISTER IA鉴定试剂条 ), 运用于 228份各类食品的检测。2 结果与分析211 LMO改良分子信标体系的检测结果21111 特异性分析  28种菌株经改良分子信标体系检测, 只有 LMO有荧光信号, 其余菌株均无荧光信号。21112 灵敏度结果  DNA灵敏度为 110 fg, 菌液灵敏度为80 cfu /m l或 4 cfu /PCR反应体系。645中国卫生检验杂志 2006年 6月第 16卷 第 6期  C h inese Jou rnal ofH ea lth Laboratory Technology, Jun 2006; Vol 16 No 6图 1 分子信标 -荧光 PCR检测 LMO hlyA左图:空白; 右图: h lyA( + )21 113 灵敏度结果  DNA灵敏度为 110 fg, 菌液灵敏度为99 c fu /m l或 4 cfu /PCR反应体系。21 2 应用在受检的 5类食品共 228份中, 国标法检测出阳性标本 6份, 荧光 PCR法检测出阳性标本 8份, 总污染率为 21 63% ( 6 /228)。表 2 5类食品 LMO检出情况类别检测份数阳性份数国标法 荧光 PCR法污染率国标法 荧光 PCR法生肉 96 0 0 0 0冻肉 25 1 2 4% 8%冻禽 51 3 3 5188% 5188%生奶 40 0 0 0 0速食类冻品 16 2 3 1215 1817%总数 228 6 8 2163% 315%3 讨论我们在改良分子信标技术的基础上, 建立了实时 PCR检测细菌的方法。研究表明: ( 1 )此方法灵敏度高, 每毫克或每毫升样品含 99 cfu细菌, 即可检出。 ( 2)特异性强, 与对照组27种细菌无交叉反应, 即类似的肠道致病菌均呈阴性。 ( 3)操作简单, 结果观察直观明了,可一次检测 96份标本 (含阴阳性对照 )。 ( 4)适用于 LMO食物中毒的快速诊断和大量样品的检测。检测食品标本需 1天半时间 (包括样品的增菌和前期处理 )。传统的细菌学检验方法主要是细菌培养和生化鉴定法, 需要 4天完成,而且操作繁琐, 检出率低。而实时 PCR检测时间短, 检出率高,在实时 PCR研究的基础上, 可进一步实现双重或多重实时 PCR, 同时诊断 10种食源性致病菌,满足常见细菌性食物中毒快速诊断的要求。改良分子信标探针是为了提高杂交效率, 在原来分子信标原理基础上提出的。改良分子信标的突出特点是将分子信标的臂部分也作为靶识别序列, 而不仅仅是用于形成发夹结构的无关添加序列。对于同样长度的检测靶序列, 改良分子信标比分子信标更短 ,而且由于臂序列不再悬空, 因而与靶序列的结合更趋紧密。已经证明, 改良分子信标比分子信标更易设计且成功率更高 ,同时对扩增条件要求不严, 因此对于多个靶序列的同时检测 ,改良分子信标的优势更加明显。  LMO的毒力是由多基因决定的, 主要已发现的致病因子分为两大类, 即由 prfA基因产物协同调节的毒力因子, 如prfA、LMO 溶血素 ( LLO )、磷脂酰肌醇特异的磷脂酶 C( P I2PLC)、卵磷脂酶操纵子和不为 prfA调控的毒力因子, 如p60蛋白质、内化素 inlAB操纵子及其他毒力因子 [ 5~ 7]。LMO溶血素 ( LLO )是单增李氏菌的必要致病因子。溶血实验是 LMO与英诺克李斯特菌区别的重要生化项目。临床分离的 LMO致病菌株全部溶血, 不溶血的菌株无毒性。 LMO溶血素 ( LLO )由 hlyA基因编码, 该基因是致病性李斯特菌普遍存在的毒力基因 [8~ 10]。从该基因选择合适片段可作为克隆杂交分析的引物和探针, 这表明所选取的引物和探针对 LMO特异性很高 [5]。作者对 228份 LB1增菌肉汤进行荧光实时 PCR检测,有 8份样品呈现阳性, 其中 6份样品能通过国标法分离到 LMO菌株。对 28株经 API L ISTERIA试剂条鉴定为 LMO的菌株和 2株标准 LMO菌株进行荧光 PCR检测, 结果均为阳性, 与生化鉴定结果吻合。证明运用荧光 PCR做样品初筛和菌株鉴定,结果可信。由于荧光 PCR灵敏度高于传统检验方法, 并将检测时间由原来的至少 5 d缩短至 1 d, 因此在检测食品中 LMO时, 可先用荧光 PCR进行快速筛选, 以节省人力物力, 缩短检验时间。此法也可通过检测食品、病人呕吐物和排泄物等, 快速诊断单增李斯特菌食物中毒。[参考文献 ][ 1 ] F len ing DW, C osh i SL, M acDonald KL, et a l1Pasteu rized m ilk as ve-lh ide of in fection in an ou tb reak of listerios is [ J] 1New Eng l J M ed,1985, 312( 1 ) : 404- 4071[ 2 ] 杜蔷 1内化素基因扩增技术检测生肉中单核增生性李斯特氏菌[ J]1首都报, 1995, 1 (专刊 ) : 871[ 3 ] 韩怀忠 1食源性李斯特氏菌病 [ J] 1中国食品卫生杂志, 1993, 8( 5 ): 491[ 4 ] 肖义泽,任丽娟,王金玉,等 1云南省首次动物性李斯特菌病暴发的流行病学调查 [ J]1中华流行病学杂志, 2000, 21( 3 ): 2361[ 5 ] 雷祚荣 1细菌毒素分子生物学 [M ]1北京:中国科学技术出版社,19931190- 2001[ 6 ] 陈宁庆 1实用生物毒素学 [ M ] 1 北京: 中国科学技术出版社,2001192- 1041[ 7 ] 姜永强 1产单核细胞李氏菌毒力因子的分子遗传学研究进展[ J] .国外医学微生物学分册, 1996, 19 ( 3) : 23- 251[ 8 ] Datta AR, W entz BA, H luWE1Detection of hem olyt icL isteria m ono-cytogenes by u sing DNA colony hyb rid ization[ J]1Appl Environ M icro-b io,l 1987, 53( 9 ): 2256- 22591[ 9] V inesA, Sw am inathan B1Nucleot ide sequence analysis of tw o virulence- associated genesinL isteria m on ocy tog en es serotyp e 1 /2b and com par-ison w ith th e sam e genes in other serotypes im portan t in hum an d isease[ J]1LettApp lM icrob io,l 1997, 24 ( 3) : 166- 1681[ 10 ] V icenteM F, F Baquero1C loning and express ion of the L isteria m ono-cytogenes h aem olysin in E1 col i [ J] 1FEM S M icrob io l Lett, 1985, 30( 3 ): 77- 791(收稿日期: 2006- 03- 03)646 中国卫生检验杂志 2006年 6月第 16卷 第 6期  C hinese Jou rnal ofH ea lth Laboratory Technology, Jun 2006; V ol 16 No 6

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

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