Structural insights into RNA processing by the human RISC-loading complex.

Targeted gene silencing by RNA interference (RNAi) requires loading of a short guide RNA (small interfering RNA (siRNA) or microRNA (miRNA)) onto an Argonaute protein to form the functional center of an RNA-induced silencing complex (RISC). In humans, Argonaute2 (AGO2) assembles with the guide RNA-generating enzyme Dicer and the RNA-binding protein TRBP to form a RISC-loading complex (RLC), which is necessary for efficient transfer of nascent siRNAs and miRNAs from Dicer to AGO2. Here, using single-particle EM analysis, we show that human Dicer has an L-shaped structure. The RLC Dicer's N-terminal DExH/D domain, located in a short 'base branch', interacts with TRBP, whereas its C-terminal catalytic domains in the main body are proximal to AGO2. A model generated by docking the available atomic structures of Dicer and Argonaute homologs into the RLC reconstruction suggests a mechanism for siRNA transfer from Dicer to AGO2

GraFIX: a semiautomatic approach for parsing low- and high-quality eye-tracking data

Fixation durations (FD) have been used widely as a measurement of information processing and attention. However, issues like data quality can seriously influence the accuracy of the fixation detection methods and, thus, affect the validity of our results (Holmqvist, Nyström, & Mulvey, 2012). This is crucial when studying special populations such as infants, where common issues with testing (e.g., high degree of movement, unreliable eye detection, low spatial precision) result in highly variable data quality and render existing FD detection approaches highly time consuming (hand-coding) or imprecise (automatic detection). To address this problem, we present GraFIX, a novel semiautomatic method consisting of a two-step process in which eye-tracking data is initially parsed by using velocity-based algorithms whose input parameters are adapted by the user and then manipulated using the graphical interface, allowing accurate and rapid adjustments of the algorithms’ outcome. The present algorithms (1) smooth the raw data, (2) interpolate missing data points, and (3) apply a number of criteria to automatically evaluate and remove artifactual fixations. The input parameters (e.g., velocity threshold, interpolation latency) can be easily manually adapted to fit each participant. Furthermore, the present application includes visualization tools that facilitate the manual coding of fixations. We assessed this method by performing an intercoder reliability analysis in two groups of infants presenting low- and high-quality data and compared it with previous methods. Results revealed that our two-step approach with adaptable FD detection criteria gives rise to more reliable and stable measures in low- and high-quality data

Structural biology and characterization of the human R2TP, an HSP90 co-chaperone complex

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 13-07-2017Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 13-01-201

Biophysical characterization of a chaperone complex involved in macroautophagy

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura:31-01-2020Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 31-07-2021Eukaryotic cells have developed regulated pathways to maintain a fine balance between protein synthesis, folding, trafficking and degradation (proteostasis). Disruption of this homeostasis network may lead to the onset of pathologies such as cancer or neurodegenerative disorders. Therefore, cells count on several pathways to remove and prevent accumulation and aggregation of potentially toxic proteins, namely the ubiquitin-proteasome system (UPS) and autophagy. Three types of autophagy have been described so far: chaperone-mediated autophagy (CMA), microautophagy and macroautophagy. The chaperone Hsp70 has a central role in all of them. In macroautophagy, Hsp70, in collaboration with other partners (CHIP, Bag3, HspB8), forms a complex that recognizes, ubiquitinates and delivers aggregate-prone proteins towards special locations in cells (aggresomes), for further degradation. This project focuses on the biophysical characterization of the HspB8:Bag3:Hsp70 complex and its components. HspB8, Bag3 and Hsp70 form a stable ternary complex in vitro, which we have studied by different biophysical techniques and also by standard electron microscopy (negative staining) and cryoelectron microscopy (cryoEM). Using cryoelectron tomography, we have analyzed the distribution of the ternary complex in the specimen grids, and have found a tendency of the complex not to distribute evenly within the ice layer, but in a single stratum probably the air-water interface. Using single particle analysis, a low-resolution map has been obtained by negative staining, which combined with crosslinking-mass spectrometry data, has allowed us to build a pseudo-atomic model of the ternary complex. Additionally, we have obtained by cryoEM a low-resolution 3D map where only the atomic models of Hsp70SBD and BAG:Hsp70NBD could be accommodated. The model supports the previously described bimodal character of the Bag3:Hsp70 interaction

Structural characterization of the minimal human RISC-loading complex

Die Genexpression ist die Voraussetzung für die Proteinbiosynthese in allen Zellen. Eine schnelle und feingesteuerte Kontrolle der Genexpression, die Genregulation, ist dabei als Reaktion auf Umweltveränderungen von großer Bedeutung. Unter Zuhilfenahme von kleinen RNAs spielen die RNA-Interferenz (RNAi) und verwandte Geninaktivierungsprozesse (gene silencing pathways) eine wichtige Rolle bei der Genregulation in Eukaryoten. Die gezielte Abschaltung von Genen durch RNAi wird durch die Erzeugung von kleinen doppelsträngigen RNAs (dsRNAs) in sogenannten RNA-induced-silencing complexes (RISCs) initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass ein minimaler H. sapiens Komplex, der RISC -loading -Komplex (RLC), bestehend aus Dicer , Ago2 und TRBP2, in der Lage ist, Vorläufer-RNAs in etwa 21-23 Nukleotid lange dsRNAs zu zerkleinern, diese in ihre Einzelstränge zu trennen, den entsprechenden Führungsstrang auf Ago2 zu laden und eine komplementäre Ziel-mRNA endonukleolytisch zu schneiden. Somit kann dieser minimale Komplex die Verarbeitung der Vorläufer-RNA in kleine dsRNAs durch Dicer mit der Beladung dieser kleinen RNA-Produkte auf Ago2 verbinden/koppeln. Innerhalb des RLC wirken Dicer und Ago2 als Endoribonukleasen, während das dsRNA-Bindungsprotein TRBP2 die Dicer-RNA Komplexe zu Ago2 rekrutiert und für die Beladung der entsprechenden kleinen RNAs in den Komplex und auf Ago2 wichtig ist. Strukturinformationen des RLCs, der Subkomplexe sowie die einzelnen RLC-Proteine sind kaum vorhanden, und über die RNA-Transfermechanismen innerhalb des RLCs ist wenig bekannt. Innerhalb dieser Arbeit wurde ein Expressions- und Reinigungssystem für die einzelnen rekombinanten Proteine etabliert. Die menschlichen Proteine Dicer und Ago2 wurden als N-terminal Hexahistidin markierte Proteine in Sf9- bzw. High Five-Insektenzellen hergestellt, und menschliches TRBP2 wurde als N-terminal GST-markiertes Protein in E. coli BL21(DE3)Star-Zellen exprimiert. Die einzelnen Proteine wurden gereinigt und der RLC präpariert. Der RLC und dessen Komponenten wurden strukturell durch makromolekulare Röntgenkristallographie und Einzelpartikel Elektronenmikroskopie untersucht. Da die Kristallisation von diesem großen und hochflexiblen Komplex während dieser Arbeit nicht möglich war, wurden die Hauptstrukturarbeiten am RLC mit Hilfe von Einzelpartikel Elektronenmikroskopie-Studien durchgeführt. So konnte eine dreidimensionale Struktur des H. sapiens RLCs mit einer Auflösung von 22,8 Å rekonstruiert werden. Diese Rekonstruktion zeigt, dass der RLC eine C- förmige Gestalt mit verschiedenen flexiblen Regionen aufweist. Ein Vergleich mit einer früheren Rekonstruktion des RLC zeigt, dass die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des RLC (RNA-gebundener Komplex) eine offenere Konformation einnimmt. Zusätzlich lässt die erreichte höhere Auflösung die Bestimmung neuer struktureller Details, des RLC zu, so dass einzelne Domänen erkennbar sind. Um die RLC-Komponenten innerhalb der hier bestimmten RLC-Rekonstruktion zu lokalisieren, sollten Referenzdichten der Subkomplexe und von Dicer berechnet werden. Aufgrund der hohen Heterogenität der Subkomplexe und von rekombinantem Dicer, waren zuverlässige Rekonstruktionen bisher nicht möglich. Die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des humanen RLC und weitere in der Zwischenzeit erlangte biochemische und strukturelle Ergebnisse anderer Gruppen, bedingen ein neues mögliches Modell für die RNA-Transfer–Mechanismen innerhalb des RLCs, welches diskutiert wird.  Das große human Dicer Protein enthält eine N-terminale DExD/H-Helikase Domäne, dessen Funktion noch immer unklar ist. Interessanterweise interagiert diese Domäne mit TRBP2. Mit Hilfe dieser Interaktion wird die Endonuklease-Aktivität von Dicer aktiviert. Um die Wechselwirkung zwischen Dicer und TRBP2 im Detail zu verstehen, wurden in dieser Arbeit zusätzlich zu dem vollständigen Dicer-TRBP2 Komplex, minimale Dicer-TRBP2 Komplexes für strukturelle Analysen präpariert. Ein Atommodell der Interaktionsfläche mit verschiedenen minimalen Dicer-TRBP2 Komplexen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erhalten werden. Es kann aber gezeigt werden, dass dieses Dicer-Fragment die Bindung von TRBP2 zu einzelsträniger RNA vermindert, was auf eine Rolle von TRBP2 bei der Substratwahl von Dicer schließen lässt.  H. sapiens TRBP2 besitzt drei dsRBDs, die für RNA- und Proteinbinding sowie die eigene Homodimerisierung verantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Kristallstruktur der zweiten dsRNA-Bindungsdomäne (dsRBD2) von TRBP2 gelöst und bis zu einer Auflösung von 2.28 Å verfeinert werden. Die Domäne hat eine typische α-β-β-β-α dsRBD Faltung, wobei die α-Helices gegen eine Seite des dreisträngigen antiparallelen β-Faltblattes packen. Die asymmetrische Einheit enthält vier Moleküle der dsRBD2, die untereinander zwei verschiedene Dimerisierungstellen bilden. Durchgeführte SAXS- und MALS-Messungen zeigen allerdings, dass die dsRBD2 in Lösung als Monomer vorliegt. Die identifizierten Dimerisierungsstellen scheinen daher nur Kristallisationsartefakte zu sein. Die Ergebnisse in dieser Arbeit deuten darauf hin, dass nicht die dsRBD2 allein sondern auch die Loop-Regionen zwischen den dsRBDs von hTRBP2 für die Dimerisierung wichtig sind. Ein Vergleich dieser Struktur mit der zuvor gelösten Struktur der dsRBD2 von TRBP2 im Komplex mit einem kurzen CG-Duplex zeigt, dass RNA-induzierte strukturelle Umlagerungen im Bereich der RNA-Bindungsstellen innerhalb der Domäne möglich sind. Zusätzlich zeigt die ermittelte SAXS Struktur der dsRBD2, dass genau diese Regionen, welche für RNA-Bindungen wichtig sind, sehr flexibel sind und so die Bindung von verschiedenen RNA-Substraten erlauben

Investigating the mechanisms underlying fixation durations during the first year of life: a computational account

Infants’ eye-movements provide a window onto the development of cognitive functions over the first years of life. Despite considerable advances in the past decade, studying the mechanisms underlying infant fixation duration and saccadic control remains a challenge due to practical and technical constraints in infant testing. This thesis addresses these issues and investigates infant oculomotor control by presenting novel software and methods for dealing with low-quality infant data (GraFIX), a series of behavioural studies involving novel gaze-contingent and sceneviewing paradigms, and computational modelling of fixation timing throughout development. In a cross-sectional study and two longitudinal studies, participants were eye-tracked while viewing dynamic and static complex scenes, and performed gap-overlap and double-step paradigms. Fixation data from these studies were modelled in a number of simulation studies with the CRISP model of fixation durations in adults in scene viewing. Empirical results showed how fixation durations decreased with age for all viewing conditions but at different rates. Individual differences between long- and short-lookers were found across visits and viewing conditions, with static images being the most stable viewing condition. Modelling results confirmed the CRISP theoretical framework’s applicability to infant data and highlighted the influence of both cognitive processing and the developmental state of the visuo-motor system on fixation durations during the first few months of life. More specifically, while the present work suggests that infant fixation durations reflect on-line perceptual and cognitive activity similarly to adults, the individual developmental state of the visuo-motor system still affects this relationship until 10 months of age. Furthermore, results suggested that infants are already able to program saccades in two stages at 3.5 months: (1) an initial labile stage subject to cancellation and (2) a subsequent non-labile stage that cannot be cancelled. The length of the non-labile stage decreased relative to the labile stage especially from 3.5 to 5 months, indicating a greater ability to cancel saccade programs as infants grew older. In summary, the present work provides unprecedented insights into the development of fixation durations and saccadic control during the first year of life and demonstrates the benefits of mixing behavioural and computational approaches to investigate methodologically challenging research topics such as oculomotor control in infancy

Structure of a tetrameric photosystem I from a glaucophyte alga Cyanophora paradoxa

Photosystem I (PSI) is one of the two photosystems functioning in light-energy harvesting, transfer, and electron transfer in photosynthesis. However, the oligomerization state of PSI is variable among photosynthetic organisms. We present a 3.8-angstrom resolution cryo-electron microscopic structure of tetrameric PSI isolated from the glaucophyte alga Cyanophora paradoxa, which reveals differences with PSI from other organisms in subunit composition and organization. The PSI tetramer is organized in a dimer of dimers with a C2 symmetry. Unlike cyanobacterial PSI tetramers, two of the four monomers are rotated around 90 degrees, resulting in a completely different pattern of monomer-monomer interactions. Excitation-energy transfer among chlorophylls differs significantly between Cyanophora and cyanobacterial PSI tetramers. These structural and spectroscopic features reveal characteristic interactions and excitation-energy transfer in the Cyanophora PSI tetramer, suggesting that the Cyanophora PSI could represent a turning point in the evolution of PSI from prokaryotes to eukaryotes