Pamam dendrimer-based therapeutic and diagnostic nanodevices

Dendrimers are ideal materials to be used in the emerging field of nanomedicine. Their nanoscale size and high density of functional groups on their peripheries allow them to be used for various biomedical applications. This work exploits dendrimers as drug delivery vehicles and a versatile platform for capturing biomarkers with improved sensitivity and specificity. Hydroxyl terminated poly(amidoamine) dendrimer (PAMAM-OH) was modified with a linker having amine group at the end and conjugated to two drugs, erythromycin (EM) and allopregnanonolne, respectively and evaluated in vitro. Both drugs were provided with a linker having carboxylic group required for conjugation reaction with dendrimer. The release rate of the drugs from the conjugates in PBS buffers at pH 7.4 for EM and pH 2.1 for allopregnanolone were evaluated by reverse phase HPLC (RP-HPLC) analysis. EM released quite fast, about 90% of the drug was released within 10 hours and completed within 20 hours, while allopregnanolone released in slower manner, about 90% of the drug was released within 9 days. Dendrimer-EM conjugate was not cytotoxic and was significantly efficacious in inhibiting the nitrite production compared to free drug. The inhibition of bacterial growth by dendrimer-EM conjugate was comparable to free EM. Combined with the intinsinic properties of dendrimers, these nanodevices could lead to improved in vivo efficacy. PAMAM-OH was successfully used for the development of a solid phase bio-sensing platform. The ELISA plate was modified first with polyethylene-glycol (PEG) and then PAMAM-OH was immobilized. A capture antibody was oxidized and covalently attached to dendrimer-modified ELISA plate which gives antibody favorable orientation for the antigen binding sites toward the analyte. The dendrimer modified plate showed enhanced sensitivity and the detection limit for TNF-á was found to be 0.48 pg/mL, which is significantly better than the commercially available ELISA kit. The selectivity of the dendrimer-modified ELISA plate was examined by studying TNF-á in a mixture of cytokines which gave similar results. Dendrimer-modified ELISA plate provides a greater opportunity for the detection of a wide range of cytokines and biomarkers

Development of enzyme-functionalized hybrid mesoporous nanodevices for advanced chemical communication

Tesis por compendio[ES] La presente tesis doctoral se centra en el diseño, síntesis y caracterización de varios nanodispositivos híbridos orgánico-inorgánicos, utilizando como soporte nanopartículas de sílice mesoporosa equipadas con enzimas y puertas moleculares, los cuales muestran capacidades comunicativas además de la evaluación de diferentes estrategias de comunicación. El primer capítulo incluye un resumen de diferentes conceptos sobre los que se fundamentan los estudios realizados tales como nanotecnología, materiales de sílice mesoporosa, materiales con puertas moleculares que reaccionan a estímulos específicos, partículas Janus y biocomputación. Finalmente, se incluyen conceptos básicos acerca de la comunicación química, materiales y estrategias empleados hasta ahora y ejemplos representativos. A continuación, en el segundo capítulo, se presentan los objetivos generales de esta tesis doctoral que son abordados en los siguientes capítulos experimentales. El tercer capítulo muestra un sistema de biocomputación para liberación basado en nanopartículas Janus de oro-sílice mesoporosa capaces de comunicarse con el entorno procesando la información e imitando la función lógica booleana propia de un demultiplexer y que resulta en la liberación controlada de la carga. Se muestra que dicho nanodispositivo puede llevar a cabo sus funciones en medios complejos como en células cancerígenas. En el cuarto capítulo, se presenta un modelo circular de comunicación dentro de una red de tres nanopartículas diferentes basado en el intercambio jerárquicamente programado de mensajes químicos. La parte mesoporosa del nanodispositivo 1 (S1βgal) es cargada con la especie fluorescente [Ru(bpy)3]Cl2 y tapada con cadenas de oligo(etilenglicol) que contienen puentes disulfuro y que funcionan como puertas moleculares, mientras que la enzima β-galactosidasa es unida a la parte del oro. En la nanopartícula 2 (S2galox), la enzima galactosa oxidasa es inmovilizada en la cara del oro mientras que la sílice mesoporosa es cargada con 4-(bromometil)benzoato de metilo y los poros tapados con un derivado de arilboronato autoinmolante sensible a H2O2 que forma un complejo huéspedanfitrión con β-ciclodextrina. Finalmente, el nanodispositivo 3 (S3est) es funcionalizado con la enzima esterasa en la parte del oro, cargada con la especie reductora hidroclururo de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en la parte mesoporosa y tapada con una nanoválvula supramolecular que responde a pH (βciclodextrina:benzimidazol). En el quinto capítulo, se muestra un modelo interactivo de comunicación química entre una nanopartícula Janus abiótica y un organismo vivo (Saccharomyces cerevisiae). En particular, el nanodispositivo está basado en nanopartículas funcionalizadas con glucosa oxidasa en la parte del oro, cargadas con el genotóxico fleomicina y tapadas con la puerta molecular sensible a pH (βciclodextrina:benzimidazol). El microorganismo usado en el estudio es una levadura modificada que expresa GFP bajo el control del promotor del gen RNR3; la transcripción de dicho gen es inducida con la exposición a agentes que dañan el ADN. La ruta de comunicación interactiva empieza con la adición de sacarosa (estímulo de entrada) la cual es hidrolizada en glucosa por la invertasa localizada en el espacio periplásmico de las levaduras y que difunde al nanodispositivo donde es trasformada en el correspondiente ácido por la glucosa oxidasa de la parte del oro. La bajada local de pH da lugar a la apertura de la nanoválvula sensible a pH del nanovehículo y con ello a la liberación de fleomicina (mensaje de vuelta) que induce la expresión de GFP (señal de salida) en las levaduras. En el sexto capítulo, proponemos una estrategia para establecer una comunicación lineal entre dos microorganismos diferentes que no interactúan entre ellos mediada por un nanodispositivo que actúa como traductor químico. Finalmente, las conclusiones generales de la presente tesis doctoral son expuestas en el capítulo siete. El estudio de las capacidades comunicativas de los nanodispositivos mesoporosos funcionalizados con enzimas permite la construcción de estrategias de cooperación entre diferentes entidades que permiten funcionalidades que van más allá que aquellas llevadas a cabo por agentes individuales.[CA] La present tesi doctoral es centra en el disseny, síntesi i caracterització de diversos nanodispositius híbrids orgànic-inorgànics, utilitzant com a suport nanopartícules de sílice mesoporosa equipades amb enzims i portes moleculars, i que mostren capacitats comunicatives a més de l’avaluació de diferents estratègies de comunicació. El primer capítol inclou un resum de diferents conceptes sobre els quals es fonamenten els estudis realitzats com ara nanotecnologia, materials de sílice mesoporosa, materials amb portes moleculars que reaccionen a estímuls específics, partícules Janus i biocomputació. Finalment, s’inclouen conceptes bàsics sobre la comunicació química, materials i estratègies utilitzades fins ara i exemples representatius. A continuació, en el segon capítol, es presenten els objectius generals d’aquesta tesi doctoral que són abordats en els següents capítols experimentals. El tercer capítol mostra un sistema de biocomputació per alliberament basat en nanopartícules Janus d’or-sílice mesoporosa capaços de comunicar-se amb l’entorn processant la informació i imitant la funció lògica booleana pròpia d’un demultiplexer i que resulta en l’alliberament controlat de la càrrega. Es mostra que aquest nanodispositiu pot dur a terme les seves funcions en mitjans complexos com en cèl·lules canceroses. En el quart capítol, es presenta un model circular de comunicació dins d’una xarxa de tres nanopartícules diferents basat en l’intercanvi jeràrquicament programat de missatges químics. La part mesoporosa del nanodispositiu 1 (S1βgal) es carrega amb l’espècie fluorescent [Ru(bpy)3]Cl2 i es tapa amb cadenes d’oligo(etilenglicol) que contenen ponts disulfur i que funcionen com portes moleculars, mentre que l’enzim β-galactosidasa s’immobilitza a la part de l’or. A la nanopartícula 2 (S2galox), l’enzim galactosa oxidasa s’immobilitza a la cara de l’or mentre que la sílice mesoporosa es carrega amb 4-(bromometil)benzoat de metil i els porus són tapats amb un derivat d’arilboronat autoimmolant sensible a H2O2 que forma un complex hoste-amfitrió amb β-ciclodextrina. Finalment, el nanodispositu 3 (S3est) es funcionalitza amb l’enzim esterasa en la part de l’or, es carrega amb l’espècie reductora hidroclurur de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) a la part mesoporosa i es tapa amb una nanoválvula supramolecular que respon a pH (β-ciclodextrina:benzimidazol). En el cinqué capítol, es mostra un model interactiu de comunicació química entre una nanopartícula Janus abiòtica i un organisme viu (Saccharomyces cerevisiae). En particular, el nanodispositiu està basat en nanopartícules funcionalitzades amb glucosa oxidasa en la part de l’or, carregades amb el genotòxic fleomicina i tapades amb la porta molecular sensible a pH (βciclodextrina:benzimidazol). El microorganisme utilitzat en l’estudi és un rent modificat que expressa GFP sota el control del promotor del gen RNR3; la transcripció d’aquest gen és induïda amb l’exposició a agents que danyen l’ADN. La ruta de comunicació interactiva comença amb l’addició de sacarosa (estímul d’entrada) la qual és hidrolitzada en glucosa per la invertasa localitzada en l’espai periplasmàtic dels rents i que difon al nanodispositiu on és transformada en el corresponent àcid per la glucosa oxidasa de la part de l’or. La baixada local de pH dona lloc a l’obertura de la nanoválvula sensible a pH del nanovehicle i amb això l’alliberament de fleomicina (missatge de tornada) que indueix l’expressió de GFP (senyal de sortida) en el rent. En el sisé capítol, proposem una estratègia per establir una comunicació lineal entre dos microorganismes diferents que no interactuen entre ells facilitada per un nanodispositiu que actua com a traductor químic. Finalment, les conclusions generals de la present tesi doctoral són exposades en el capítol set. L’estudi de les capacitats comunicatives dels nanodispositius mesoporosos funcionalitzats amb enzims permet la construcció d’estratègies de cooperació entre diferents entitats que permeten funcionalitats que van més enllà que aquelles dutes a terme per agents individuals. Esperem que els resultats obtinguts inspiren aplicacions futures en diferents àrees com ara biomedicina, nanorobots, materials que imiten la naturalesa i tecnologies de la informació.[EN] This PhD Thesis is focused on the design, synthesis and characterization of several hybrid organic-inorganic nanodevices using mesoporous silica nanoparticles equipped with enzymes and molecular gates which display communication capabilities as well as the design and evaluation of different communication strategies. The first chapter includes an overview of the different concepts which lay the foundations of the presented studies such as nanotechnology, mesoporous silica materials, stimuli-responsive gated materials, Janus particles and biocomputing. Basic concepts of chemical communication, materials and enabling technologies employed so far and representative examples in this field are also included. Next, in the second chapter, the general objectives of this PhD Thesis that are addressed in the following experimental chapters are presented. The third chapter shows a biocomputing delivery system based on Janus gold-mesoporous silica nanoparticles capable of chemically communicating with the environment and processing the information mimicking a demultiplexer Boolean logic function which results in a programmed cargo release. Finally, it is shown that such nanodevice is operative in complex media such as cancer cells. In the fourth chapter, it is presented a circular model of communication within a network of three different nanoparticles based on the hierarchically programmed exchange of chemical messages. The mesoporous face of nanodevice 1 (S1βgal) is loaded with the fluorescent dye [Ru(bpy)3]Cl2 and capped with disulfidecontaining oligo(ethylene glycol) chains acting as gatekeepers, whereas the enzyme β-galactosidase is attached to the gold face. In nanoparticle 2 (S2galox), the enzyme galactose oxidase is immobilized on the Au face, while the mesoporous silica is loaded with methyl 4-(bromomethyl)benzoate and the mesopores capped with a H2O2-sensitive self-immolative arylboronate derivative which forms a host-guest complex with β-cyclodextrin. Finally, the nanodevice 3 (S3est) is functionalized with the enzyme esterase on the Au face, loaded with the reductive species tris(2- carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) in the mesoporous face and capped with a pH-responsive supramolecular nanovalve (β-cyclodextrin:benzimidazole). In the fifth chapter, it is showed an interactive model of chemical communication between an abiotic Janus nanoparticle and a living organism (Saccharomyces cerevisiae). In particular, the nanodevice is based on Janus goldmesoporous silica nanoparticles functionalized with glucose oxidase on the Au face, loaded with the genotoxin phleomycin and capped with a pH-responsive (βcyclodextrin:benzimidazole) gatekeeper. The microorganism used in the studies is an engineered budding yeast that expresses GFP under the control of the RNR3 promoter; RNR3 gene transcription is induced upon exposure to DNA-damaging agents. The interactive communication pathway starts with the addition of sucrose (input) which is hydrolyzed into glucose by invertase located in periplasmic space of yeasts and diffuses to the nanodevice where it is transformed into the corresponding acid by glucose oxidase on the Au face. The local drop in pH leads to uncapping of the pH-sensitive nanovalve in the nanocarrier and the release of phleomycin (feedback messenger) that induces GFP expression (output) in yeasts. In the sixth chapter, we propose a strategy to establish linear communication between two different non-interacting microorganisms mediated by a nanodevice which acts as a chemical “nanotranslator”. Finally, the general conclusions from this PhD Thesis are presented in chapter seven. The study of communication capabilities of enzyme-functionalized mesoporous nanodevices enables the construction of strategies of cooperation between different entities allowing sophisticated functionalities that go beyond those carried out by individual agents. We hope that the obtained results inspire future applications in different areas such as biomedicine, nanorobots, life-like materials and information technologies.The authors wish to thank the Spanish Government (projects RTI2018-100910-B-C41 and RTI2018-101599-B-C22 (MCUI/AEI/FEDER, UE), CTQ2017-87954-P), the Generalitat Valenciana (PROMETEO 2018/024), the Comunidad de Madrid (IND2017/BMD7642) and CIBER-BBN (NANOCOMMUNITY project) for support.De Luis Fernández, B. (2021). Development of enzyme-functionalized hybrid mesoporous nanodevices for advanced chemical communication [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171506TESISCompendi

Towards autonomous DNA-based Nanodevices

Molecular recognition, programmability, self-assembling capabilites and biocompatibility are unique features of DNA. The basic approach of DNA nanotechnology is to exploit these properties in order to fabricate novel materials and structures on the nanometer scale. This cumulative dissertation deals with three aspects of this young research area: fast analysis, autonomous control of functional structures, and biocompatible autonomous delivery systems for nanoscale objects. 1. At low temperatures and under favorable buffer conditions, two complementary DNA strands will form a double-helical structure in which the bases of the two strands are paired according to the Watson-Crick rules: adenine bases bind with thymine bases, guanine bases with cytosine bases. The melting temperature TM of a DNA duplex is defined as the temperature at which half of the double strands are separated into single strands. The melting temperature can be calculated for DNA strands of known sequences under standard conditions. However, it has to be determined experimentally for strands of unknown sequences and for applications under extreme buffer conditions. A method for fast and reliable determination of DNA melting temperatures has been developed. Stable gradients of the denaturing agent formamide were generated by means of diffusion in a microfluidic setup. Formamide lowers the melting temperature of DNA and a given formamide concentration can be mapped to a corresponding virtual temperature along the formamide gradient. Differences in the length of complementary sequences of only one nucleotide as well as a single nucleotide mismatch can be detected with this method, which is of great interest for the detection of sequence mutations or variations such as single nucleotide polymorphisms (SNPs). 2. Knowledge of the stability of DNA duplexes is also of great importance for the construction of DNA-based nanostructures and devices. Conformational changes occuring in artificially generated DNA structures can be used to produce motion on the nanometer scale. Usually, DNA devices are driven by the manual addition of fuel molecules or by the periodic variation of buffer conditions. One prominent example of such a conformational change is the formation of the so-called i-motif, which is a folded four-stranded DNA structure characterized by noncanonical hemiprotonated cytosine-cytosine base-pairs. In order to achieve controlled autonomous motion, the oscillating pH-value of a chemical oscillator has been employed to drive the i-motif periodically through its conformational states. The experiments were conducted with the DNA switch in solution and attached to a solid substrate and constitute the first example of DNA-based devices driven autonomously by a chemical non-equilibrium reaction. 3. Finally, a DNA-crosslinked and switchable polyacrylamide hydrogel is introduced, which is used to trap and release fluorescent colloidal quantum dots in response to externally applied programmable DNA signal strands. Trapping and release of the nanoparticles is demonstrated by studying their diffusion properties using single molecule fluorescence microscopy, single particle tracking and fluorescence correlation spectroscopy. Due to the biocompatibility of the polymerized acrylamide and the crosslinking DNA strands, such gels could find application in the context of controlled drug delivery, where the autonomous release of a drug-carrying nanoparticle could be triggered by naturally occurring, potentially disease-related DNA or RNA strands

DNA Walkers: Emerging Analytical Applications, Biomolecular-Nanomaterial Probes and Biomolecule Sensors

DNA walkers are a unique class of dynamic DNA devices that move nucleic acid walkers processively along designated one-, two-, or three-dimensional tracks. Because of the unique mechanical motion, dynamic interaction, and capabilities for signal amplification, programmable signal transduction, high directionality, and predictable analytical performance on the basis of Watson-Crick base paring rules, this class of dynamic DNA nanodevice has gained great attention from the analytical community in the recent years. This includes bioanalytical applications that range from nucleic acid sensing, to protein detection and to cellular imaging and analysis. The research described herein focuses on improving the understanding of biophysical processes involved in the design and operation of DNA walkers. Specifically, we developed a series of stochastic DNA walkers capable of probing dynamic interactions occurring at the biomolecule-nanoparticle (bio-nano) interface. By monitoring dynamics of DNA walkers on spherical nucleic acid (SNA) tracks, we systematically investigated effects of varying interfacial factors, including intramolecular interactions, orientation, cooperativity, steric effect, multivalence, and binding hindrance on enzymatic activities at the bio-nano interface. Leveraging the newly gained knowledge at the interface, we also fabricated ultrasensitive biosensors for amplified detection of nucleic acids and antibodies. Our study revealed critical roles of interfacial factors to enzyme activities and performance of enzyme-driven nanodevices. We also demonstrate that improvement in understanding bio-nano interfaces will facilitate the design and operation of biosensors and inspire new sensing mechanisms

Optymalizacja procesów transferu energii i transferu elektronowego w biofotowoltaicznych nanourządzeniach zawierających fotosystem I oraz cytochrom c553 z ekstremofilnego krasnorostu Cyanidioschyzon merolae

One of the biggest challenges of modern-day solar technologies is to develop carbon-neutral, efficient and sustainable systems for solar energy conversion into electricity and fuel. Over the last two decades there has been a growing impact of ‘green’ solar conversion technologies based on the natural solar energy converters, such as the robust extremophilic photosystem I (PSI) and its associated protein cofactors. The main bottleneck of the currently available biophotovoltaic and solar-to-fuel technologies is the low power conversion efficiency of the available devices due to wasteful charge recombination reactions at the interfaces between the working modules, as well as instability of the organic and inorganic components. This thesis describes the development of three novel approaches to improve energy and electron transfer in PSI-based biophotoelectrodes and plasmonic nanostructures: (1) construction of all-solid-state mediatorless biophotovoltaic devices incorporating p-doped silicon substrate, extremophilic robust PSI complex and its associated light harvesting antenna (PSI-LHCI) in conjunction with its natural electron donor cytochrome c553 (cyt c553) from a red microalga Cyanidioschyzon merolae and (2), biofunctionalization of the silver nanowires (AgNWs) with a highly organised architecture of the cyt c553/PSI-LHCI assembly for the significant improvement of absorption cross-section of the C. merolae PSI-LHCI complex due to plasmonic interactions between the distinct subpool of chlorophylls (Chls) and AgNWs nanoconstructs. The third (3) approach was based on development of the photo-driven in vitro hydrogen production system following hybridisation of the robust extremophilic PSI-LHCI complex with the novel and established proton reducing catalysts (PRC). The last approach has led to generation of molecular hydrogen with TOF of 521 mol H2 (mol PSI)-1 min-1 and 729 mol H2 (mol PSI)-1 min-1 for the hybrid systems of PSI-LHCI with cobaloxime and the DuBois-type mononuclear nickel proton reduction catalysts, respectively. The TOF values for biophotocatalytic H2 production obtained in this study were 3-fold and 16.6-fold higher than those published for cyanobacterial PSI/PRC hybrid systems employing cobaloxime and a similar Ni mononuclear PRC, respectively. Construction of all-solid-state mediatorless PSI-based nanodevices was facilitated by biopassivation of the p-doped Si substrate with His6-tagged cyt c553, as evidenced by significant lowering of the inherent dark saturation current (J0), a well-known semiconductor surface recombination parameter. Five distinct variants of cyt c553 were obtained by genetically engineering the specific linker peptides of 0-19 amino acids in length between the cyt c553 holoprotein and a C-terminal His6-tag, the latter being the affinity ‘anchor’ used for specific immobilisation of this protein on the semiconductor surface. The calculated 2D Gibbs free energy maps for all the five cyt c553 variants and the protein lacking any peptide linker showed a much higher number of thermodynamically feasible conformations for the cyt c variants containing longer linker peptides upon their specific immobilisation on the Si surface. The bioinformatic calculations were verified by constructing the respective cyt c553/Si bioelectrodes and measuring their dark current-voltage (J-V) characteristics to determine the degree of p-doped Si surface passivation, measured by minimisation of the J0 recombination parameter. The combined bioinformatic and J-V analyses indicated that the cyt c553 variants with longer linker peptides, up to 19AA in length, allowed for more structural flexibility of immobilised cyt c553 in terms of both, orientation and distance of the haem group with respect to the Si surface, resulting in efficient biopassivation of this semiconductor substrate. This molecular approach has allowed for the developing of an alternative, cheap and facile route for significant reduction of the inherent minority charge recombination at the p-doped Si surface. To improve direct electron transfer within all-solid state PSI-based nanodevices, the specific His6-tagged cyt c553 variants, generated in this study, were attached to the Ni-NTA-functionalised p-doped Si surface prior to incorporation of the PSI-LHCI photoactive layer. Such nanoarchitecture resulted in an open-circuit potential increment of 333 μV for the specific PSI-LHCI/cyt c553/Si nanodevice compared to the control device devoid of cyt c553. Moreover, the all-solid state mediatorless PSI-LHCI-based devices produced photocurrents in the range of 104-234 μA/cm2 when a bias of -0.25 V was applied, demonstrating one of the highest photocurrents for this type of solid-state devices reported to date. The power conversion efficiency of the PSI-LHCI/p-doped Si devices was 20-fold higher when 19AA variant of cyt c553 was incorporated as the biological conductive interface between the PSI-LHCI photoactive module and the substrate, demonstrating the significant role of this cyt variant for improving direct electron transfer within the PSI-based all-solid-state mediatorless biophotovoltaic device. In a complementary line of research, it was demonstrated that the highly controlled assembly of C. merolae PSI-LHCI complex on plasmon-generating AgNWs substantially improved the optical functionality of such a novel biohybrid nanostructure. By comparing fluorescence intensities measured for PSI-LHCI complex randomly oriented on AgNWs and the results obtained for the PSI-LHCI/cyt c553 bioconjugate with AgNWs it was concluded that the specific binding of PSI-LHCI complex with the defined uniform orientation yields selective excitation of a pool of Chls that are otherwise almost non-absorbing. This is remarkable, as this work shows for the first time that plasmonic excitations in metallic nanostructures not only can be used to enhance native absorption of photosynthetic pigments, but also, by employing cyt c553 as the conjugation cofactor, to activate the specific Chl pools as the absorbing sites, only when the uniform and well-defined orientation of PSI-LHCI complex with respect to plasmonic nanostructures is achieved. This innovative approach paves the way for the next generation solar energy-converting technologies to outperform the reported-to-date biohybrid devices with respect to power conversion efficiency.Jednym z głównych wyzwań technologicznych jest opracowanie wydajnych i odnawialnych systemów konwersji energii słonecznej w elektryczność i paliwo, stosując zerowy bilans emisji związków węgla. W ciągu ostatnich dwóch dekad nastąpił znaczący postęp w zastosowaniu “zielonych” technologii biofotowoltaicznych, opartych na naturalnych białkach absorbujących energię słoneczną, takich jak fotosystem I (PSI) wraz ze związanymi z nim kompleksami antenowymi i kofaktorami transportu elektronowego. Głównym ograniczeniem obecnych urządzeń fotowoltaicznych jest ich niska wydajność kwantowa, związana z procesami rekombinacji ładunku w interfejsach pomiędzy modułami tych urządzeń, jak również ograniczona stabilność zastosowanych jak dotąd biologicznych i syntetycznych komponentów. W ramach niniejszej rozprawy doktorskiej opracowano nowatorską technologię, polegającą na zastosowaniu wysokostabilnego PSI oraz naturalnego donora elektronów dla tego kompleksu, cytochromu c553 (cyt c553), wyizolowanych z ekstremofilnego krasnorostu Cyanidioschyzon merolae, do konstrukcji trzech typów nanourządzeń biofotowoltaicznych: (1), biofotoogniw w stałej konfiguracji (ang., all-solid-state), zawierających domieszkowany pozytywnie półprzewodnikowy substrat krzemowy (ang., p-doped Si, p-Si) wraz z warstwami fotoaktywnego kompleksu PSI i cyt c553; (2), plazmonowych srebrnych bionanodrutów (AgNWs), funkcjonalizowanych wysokouporządkowaną nanoarchitekturą monowarstw PSI i cyt c553, oraz (3), systemu fotokatalitycznej produkcji wodoru cząsteczkowego in vitro z zastosowaniem kompleksów hybrydowych PSI wraz z syntetycznymi katalizatorami redukcji protonów (ang., proton reducing catalysts, PRC). W przypadku ostatniego z powyższych systemów, optymalizacja biofotokatalitycznej produkcji wodoru cząsteczkowego z zastosowaniem systemów hybrydowych z PSI i PRC, opartych na kobaloksymie i niklowym katalizatorze mononuklearnym typu DuBois, precypitowanych na powierzchni PSI w roztworze wodnym, pozwoliła na osiągnięcie aktywności wydzielania wodoru odpowiednio, 521 moli H2 (mol PSI)-1 min-1 oraz 729 moli H2 (mol PSI)-1 min-1, przewyższając tym samym 3-17-krotnie aktywność wydzielania wodoru w podobnych systemach biohybrydowych i warunkach pomiarowych. Poraz pierwszy zastosowano cyt c553 z C-terminalną metką His6 do biopasywacji półprzewodnikowego substratu p-Si, mierzonej minimalizacją parametru rekombinacji powierzchniowej J0. Poprzez inżynierię genetyczną sklonowano i wyrażono w E. coli 5 różnych wariantów cyt c553, z których 4 zawierały w swej strukturze sekwencje peptydowe o długości 5-19 aminokwasów (AA), aby zbadać ich wpływ na procesy rekombinacji ładunku w obrębie elektrody krzemowej. Peptydy te zostały wstawione pomiędzy holobiałkiem a metką His6, którą zastosowano do unieruchomienia każdego z wariantów cyt c553 na powierzchni elektrody. Obliczenie energii swobodnej Gibbsa pozwoliło na utworzenie konformacyjnych map 2D dla każdego z wariantów, w których pokazano, iż warianty z semi-helikalnym peptydem 19AA przyjmują znacząco większą liczbę termodynamicznie możliwych konformacji na powierzchni elektrody pod względem odległości i kąta nachylenia grupy hemowej w stosunku do powierzchni elektrody. Bioinformatyczna analiza została potwierdzona poprzez ciemniową charakterystykę prądowo-napięciową (J-V) utworzonych odpowiednio bioelektrod krzemowo-cytochromowych. Stwierdzono, że warianty cyt c553 z dłuższymi peptydami pomiędzy metką His6 a holobiałkiem efektywnie minimalizują prądy ciemniowe krzemowego substratu, najprawdopodobniej dzięki istnieniu większej ilości termodynamicznie zoptymalizowanych konformacji cytochromu, pozwalających na minimalizację rekombinacji ładunku powierzchniowego substratu. Funkcjonalizacja elektrody p-Si wariantem cyt c553, charakteryzującym się największym stopniem swobody orientacji grupy hemowej w stosunku powierzchni elektrody krzemowej, pozwoliła na efektywną biopasywację tego półprzewodnikowego substratu poprzez minimalizację parametru J0, co z kolei pozwoliło na zwiększenie parametru Voc o 333 μV w biofotoogniwach typu PSI/cyt c553/p-Si, w porównaniu do kontroli zawierającej jedynie PSI/p-Si. Uzyskano fotoprądy w stałych biofotoogniwach PSI/p-Si w zakresie 104-234 μA cm-2 (przy nadpotencjale -0.25 V), co należy do jednych z najwyższych wartości fotoprądów wygenerowanych przez stałe biofotoogniwa z PSI, w podobnych warunkach pomiarowych. Jednocześnie wydajność konwersji energii słonecznej w fotoogniwach typu PSI-LHCI/cyt c553/p-Si była 20-krotnie wyższa, w obecności wariantu cyt c553 19AA, zastosowanego w tych urządzeniech jako biologiczna warstwa biopasywacji substratu krzemowego oraz warstwa kondukcyjna pomiędzy substratem a PSI. Tym samym wykazano, że ów wariant może być zastosowany w urządzeniach biofotowoltaicznych do zwiększenia transferu elektronowego pomiędzy substratem a PSI. W równoległym i komplementarnym kierunku badań, zastosowanie równomiernej i specyficznie ukierunkowanej nanoarchitektury fotoaktywnej warstwy PSI na plazmonowych nanostrukturach metalicznych AgNWs, sfunkcjonalizowanych uprzednio cyt c553, pozwoliło na znaczące zwiększenie efektywnej absorpcji PSI, w zakresie spektralnym, w którym PSI jest nieaktywny in vivo, poprzez aktywację specyficznej puli tzw. czerwonych cząsteczek chlorofilu w obrębie fluoroforów PSI. Tym samym pokazano, że oddziaływania plazmonowe mogą być efektywnie zastosowane nie tylko do zwiększenia całkowitej absorpcji fotoaktywnych kompleksów białkowych, ale również do aktywacji spektralnej specyficznych pigmentów, wyłącznie w obrębie wysokouporządkowanej i zorientowanej nanoarchitektury tych fotokompleksów na nanokonstruktach plazmonowych. Powyższe nowatorskie podejście badawcze może być w przyszłości zastosowane do konstrukcji nowej generacji urządzeń biofotowoltaicznych o zwiększonej wydajności konwersji energii słonecznej

Design of new hybrid nanomaterials with molecular gates as nanodevices for therapeutic applications

Tesis por compendioLa presente tesis doctoral, que lleva por título “Diseño de nuevos nanomateriales híbridos con puertas moleculares como nanodispositivos para aplicaciones terapéuticas” está centrada en el desarrollo de nuevos materiales funcionales híbridos orgánico-inorgánicos para aplicaciones de liberación controlada. Los dos capítulos de la presente tesis en los que se describen los resultados obtenidos (el segundo y el tercer capítulos) están directamente relacionados con el uso de las nanopartículas mesoporosas de sílice como matriz inorgánica en el desarrollo de nuevos materiales híbridos orgánico-inorgánicos para aplicaciones en liberación controlada. Aun así, los resultados se han dividido en dos capítulos, dependiendo del estímulo aplicado para la liberación de la molécula encapsulada. En uno de los capítulos, los diferentes materiales desarrollados se basan en nanodispositivos controlados enzimáticamente, mientras que en el otro capítulo es un cambio de pH o de fuerza electroestática (en los dos casos debido a la presencia de un microorganismo patógeno) el que causa la consecuente liberación de la carga. En el caso de los nanodispositivos controlados enzimáticamente, los cuales se describen en el Capítulo 2, se desarrollaron tres sólidos diferentes. El primer ejemplo se basó en el diseño, síntesis y caracterización de nanopartículas mesoporosas de sílice recubiertas con sales de azopiridinio, que se hidrolizan en presencia de esterasas y reductasas, las cuales se encuentran en la microflora del colon. Estas sales, que contienen un enlace azoico, se seleccionaron para una posible liberación selectiva en el colon. Los estudios de viabilidad celular e internalización se llevaron a cabo con células HeLa, así como los estudios de liberación del agente quimioterapéutico camptotecina. Un segundo ejemplo se centró en el diseño, síntesis, caracterización y aplicaciones de un nuevo nanodispositivo que responde a la presencia de proteasas para liberación controlada, empleando nanopartículas de sílice cubiertas con el polímero -poli-L-lisina. En este caso, se pretendía evaluar dos mecanismos diferentes de anclaje del polímero y los dos dieron resultados positivos, aunque presentaron diferentes perfiles de liberación en cada caso. También se realizaron estudios de viabilidad e internalización celular con este nuevo nanodispositivo, así como la liberación de camptotecina en células HeLa. Finalmente, el último nanodispositivo que responde a la acción de un enzima; incluye el diseño y aplicación de un “scaffold” 3D inteligente con puertas moleculares, el cual consiste en la combinación de nanopartículas mesoporosas de sílice con puertas y biomateriales porosos clásicos. En este caso, las nanopartículas mesoporosas de sílice se cubrieron con poliaminas y ATP. Estas nanopartículas se incorporaron durante la síntesis de un “scaffold” de gelatina, el cual se preparó mediante técnicas de prototipado rápido (RP). En presencia de fosfatasa ácida se induce la liberación del colorante encapsulado en los poros de las nanopartículas. La fosfatasa ácida se seleccionó como estímulo activador de este material diseñado, ya que es un enzima cuya concentración se emplea para evaluar la actividad de los osteoclastos en procesos de remodelación ósea y como marcador en metástasis de huesos. Estas propiedades abren posibilidades de uso de esta combinación en el diseño de materiales funcionales para la preparación de numerosos “scaffolds” avanzados con puertas moleculares, que puedan ayudar en aplicaciones de medicina regenerativa y terapias de cáncer de huesos. Con respecto al otro tipo de nanodispositivos, que se muestra en el Capítulo 3, se ha evaluado el posible uso de las nanopartículas mesoporosas de sílice con puertas moleculares como posibles vehículos para la liberación controlada de fármacos cuando un microorganismo patógeno está presente. En este caso, el diseño y desarrollo de nuevos materiales híbridos orgánico-inorgánicos se ha basado en el uso de nanopartículas mesoporosas de sílice como matriz inorgánica, cubiertas con entidades moleculares orgánicas que podrían responder a un cambio en el pH del ambiente o a un cambio en la fuerza electroestática, debido a la presencia de un microorganismo patógeno, tales como hongos o bacterias. Uno de estos nanodispositivos desarrollados demuestra las aplicaciones y propiedades antifúngicas de un soporte cargado con tebuconazol y cubierto con moléculas que actúan de puerta molecular dirigida mediante un cambio de pH. El otro material presenta aplicaciones antibacterianas contra bacterias gram-positivas y gram-negativas, ya que se utiliza un nanodispositivo cargado con vancomicina y funcionalizado con -poli-L-lisina. En los dos casos, se ha demostrado que el uso de la nanoformulación puede mejorar la efectividad del fármaco encapsulado, mejorando y ampliando el espectro de acción del mismo, lo cual abre un gran abanico de posibilidades en aplicaciones de estos nanodispositivos en el tratamiento de infecciones. En resumen, se puede concluir que en la presente tesis se han desarrollado nuevos sólidos híbridos orgánico-inorgánicos, así como se han descrito las aplicaciones de estos nanodisposotivos como sistemas de liberación controlada. Los resultados obtenidos podrían ser útiles en futuros diseños de materiales híbridos avanzados en biotecnología, biomedicina y, concretamente, en aplicaciones terapéuticas (como terapias contra el cáncer, tratamiento de infecciones, medicina regenerativa, etc.)Mas Font, N. (2014). Design of new hybrid nanomaterials with molecular gates as nanodevices for therapeutic applications [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48491TESISCompendi

Viral nanomotors for packaging of dsDNA and dsRNA

While capsid proteins are assembled around single-stranded genomic DNA or RNA in rod-shaped viruses, the lengthy double-stranded genome of other viruses is packaged forcefully within a preformed protein shell. This entropically unfavourable DNA or RNA packaging is accomplished by an ATP-driven viral nanomotor, which is mainly composed of two components, the oligomerized channel and the packaging enzymes. This intriguing DNA or RNA packaging process has provoked interest among virologists, bacteriologists, biochemists, biophysicists, chemists, structural biologists and computational scientists alike, especially those interested in nanotechnology, nanomedicine, AAA+ family proteins, energy conversion, cell membrane transport, DNA or RNA replication and antiviral therapy. This review mainly focuses on the motors of double-stranded DNA viruses, but double-stranded RNA viral motors are also discussed due to interesting similarities. The novel and ingenious configuration of these nanomotors has inspired the development of biomimetics for nanodevices. Advances in structural and functional studies have increased our understanding of the molecular basis of biological movement to the point where we can begin thinking about possible applications of the viral DNA packaging motor in nanotechnology and medical applications

Computational studies of graphene and silicene for DNA base detection

Graphene's success for nanopore DNA sequencing has shown that it is possible to explore other potential single- and few-atom thick layers of elemental 2D materials beyond graphene (e.g. phosphorene and silicene), and also that these materials can exhibit fascinating and technologically useful properties for DNA base detection that are superior to those of graphene. The buckled honeycomb structure, tunable bandgap, and high thermal stability of silicene makes it an ideal material that can be used for designing the active components of nanodevices for biosensing applications such rapid sequencing of DNA. Additionally, the tunable bandgap of silicene provides versatile electronic and thermal properties allowing silicene to be tuned into both a semi-metallic material and a semiconducting material. Due to the remarkable properties of silicene, it is therefore extremely important to perform exploratory studies to determine silicene's ability to detect individual DNA bases as this material is being sought after by many experimental groups as a promising alternative to graphene for designing nano-bioelectronic devices for high-speed DNA sequencing. In this thesis, using density functional theory (DFT), we studied the interaction of DNA bases with finite-size nanomaterials from silicene and graphene. To determine the potential of monolayer silicene as a DNA sensing material, we performed first-principal calculations based on two device concepts, namely, nanoribbon and nanopore devices. Due to the differences in structural and electronic properties of DNA bases, each base is expected to have a unique interaction with the silicene, or graphene monolayer material and this interaction was modeled and quantified using density functional theory. In this research, we found that silicene devices have lower binding energies compared to graphene devices, reflecting the minimal sticking of DNAivbases to silicene's surface in the optimized structures. We noticed a significant change in bandgap for DNA bases using silicene nanopore device compared to graphene devices. Furthermore, the silicene devices with DNA bases show a greater change in density of state signal compared to graphene. We also observed that the silicene nanopore device performs better than the graphene nanopore device. These findings support the idea of silicene being a potential candidate material for advanced DNA base detection using the transverse tunneling current modality. We hope that the findings of this research will provide useful insights that can serve as a guidance to experimentalists and material scientists working in the field. Ideas for future research include examining this system using a periodic calculation; simulate a real device and calculate the current spectrum; and expanding the research to include other single-layer materials such as transition-metal dichalcogenides, and Van der Waals heterostructures