Detection of triplex PCR for the modified qualitative soybean and maize genetically

A molecular screening method based on multiplex PCR that involves amplification of specific soybean or maize sequences from plant DNA (lectin or zein) and the amplification of 35S promoter and NOS terminator,for the detection of genetically modified soybean and maize was developed. The new method is proposed,for the simulicmeous cletcctimt of tree genetic elements in the.same run as reliable method for rapid detection of genetically, modified plants with sensitivity of 0.1%

Current and new approaches in GMO detection: challenges and solutions

In many countries, genetically modified organisms (GMO) legislations have been established in order to guarantee the traceability of food/feed products on the market as well as to protect the consumer freedom of choice. Therefore, several GMO detection strategies, mainly based on DNA, have been developed to implement these legislations. Due to its numerous advantages, the quantitative PCR (qPCR) is the method of choice for the enforcement laboratories in GMO routine analysis. However, given the increasing number and diversity of GMO developed and put on the market around the world, some technical hurdles could be encountered with the qPCR technology, mainly owed to its inherent properties. To address these challenges, alternative GMO detection methods have been developed, allowing faster detections of single GM target (e.g. Loop-mediated isothermal amplification), simultaneous detections of multiple GM targets (e.g. PCR capillary gel electrophoresis, microarray and Luminex®), more accurate quantification of GM targets (e.g. digital PCR) or characterization of partially known (e.g. DNA walking and Next Generation Sequencing (NGS)) or unknown (e.g. NGS) GMO. The benefits and drawbacks of these methods are discussed in this review

Detection of genetically modified crops in animal feed in Serbia

The survey was conducted on a total of 100 non-labelled samples of feed and feed mixture containing maize, soybean and rapeseed, originating from countries with different legislation systems. Screening of all samples was performed using primers for Cauliflower Mosaic Virus 35S (CaMV35S) promoter, primers for the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase (NOS) terminator and event-specific primers for GT73 rapeseed. Roundup Ready soybean was found in 26 samples, with the amount of GM soybean above the limit of 0.9% in 9 of them. There was one maize seed sample positive for the presence of MON810 maize and no rapeseed meal samples contained GM rapeseed. The results found in this study clearly showed that imported maize and soybean and complete mixtures intended for animal feed on the Serbian market contain GMO. Monitoring plans are required to control the distribution of non-labelled feeds containing GMO in the Serbian market

A Novel Universal Primer-Multiplex-PCR Method with Sequencing Gel Electrophoresis Analysis

In this study, a novel universal primer-multiplex-PCR (UP-M-PCR) method adding a universal primer (UP) in the multiplex PCR reaction system was described. A universal adapter was designed in the 5′-end of each specific primer pairs which matched with the specific DNA sequences for each template and also used as the universal primer (UP). PCR products were analyzed on sequencing gel electrophoresis (SGE) which had the advantage of exhibiting extraordinary resolution. This method overcame the disadvantages rooted deeply in conventional multiplex PCR such as complex manipulation, lower sensitivity, self-inhibition and amplification disparity resulting from different primers, and it got a high specificity and had a low detection limit of 0.1 ng for single kind of crops when screening the presence of genetically modified (GM) crops in mixture samples. The novel developed multiplex PCR assay with sequencing gel electrophoresis analysis will be useful in many fields, such as verifying the GM status of a sample irrespective of the crop and GM trait and so on

Report on the use of EU Reference Methods and JRC decision tools for GMO analysis

To ensure harmonised scientific and technical approaches for GMO detection the European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed (EURL GMFF) at the Joint Research Centre (JRC) has developed a freely accessible database, called “GMOMETHODS" providing a state-of-the-art catalogue of EU reference methods for GMO analysis. The EURL GMFF launched in 2015 a survey to assess the use of these EU reference methods by the official GMO control laboratories in the EU and to collect information on non-EU reference methods possibly employed for the same purpose. The survey aimed also to verify if, and to which extent, laboratories use two decision supporting tools, the JRC GMO-Matrix and Event-Finder which are available on the web site of the EURL GMFF. The survey was also directed to verify the types and frequencies of modifications possibly implemented in the protocols of the validated methods used by the official control laboratories. Results from the survey indicate that almost all official control laboratories (98 %) are using event-specific EU reference methods for quantifying GMOs while a lower number of laboratories is using EU reference methods for qualitative analyses (55 % for element-specific methods and 40 % for construct-specific methods). The use of qualitative non-EU reference methods for screening purposes may reflect the laboratory needs when facing rapid alert emergencies of quickly implementing analytical strategies for detecting non-authorised GM events. Indeed genetically modified crops have continued to increase globally, both in terms of approval status and event/trait diversification. In those cases methods validated in collaborative studies and having the status of EU-reference methods are generally not yet available. In the survey close to half of the respondents (41 %-47 %) declared also to employ to different extents the two JRC decision supporting tools, GMO-Matrix and Event-Finder. Interestingly the survey shows that almost half of the protocols of the reference methods used by the laboratories are somewhat adapted to laboratory specific conditions, mainly with respect to the master mix and the reaction volume of the polymerase chain reactions (PCR) while the primers and probes are never modified. In all cases, the impact of these modifications had been verified by the control laboratory to ensure the equivalence between the adapted and the original protocols. Without such proof, the laboratory would lose its mandatory accreditation. Moreover, participants in Comparative Testing schemes have achieve generally high score performance using those adapted methods suggesting that the modifications implemented do not affect analytical sensitivity, trueness and precision of the original protocols. The outcome of the 2015 survey reveals therefore that the combined efforts of the EURL GMFF and ENGL have been successful for enhancing harmonisation in quantitative GMO analysis by the adoption of scientific and technical approaches. This achievement allows the consistency of results for GM labelling and an equal-level playing field in the EU Member States.JRC.F.5-Food and Feed Complianc

P35s, Tnos And Pfmv Targeted Multiplex Pcr Using A Single Dye

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2013Genetik mühendisliği teknikleri ile modifiye edilen veya üretilen besin bitkileri geleneksel olarak genetiği değiştirilmiş (GD) bitkiler veya genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) olarak isimlendirilir. Genetiği değiştirilmiş bitkilerin ekim alanları 1996 yılından 2012 yılına 100 kat artarak, GD bitkileri yakın tarihimizin en hızlı uyum sağlanan ürün teknolojisi haline getirmiştir. Farklı kurumsal yapıların ve araştırmacıların çalışmaları incelendiğinde genetiği değiştirilmiş organizmaların insan sağlığı ve çevre üzerine riskleri ile ilgili farklı sonuçların ortaya konulduğu görülmektedir. GD bitki ve ürün çeşitlerinin varlığının ve miktarının izlenmesi ve doğrulanması için düzenleme ihtiyacı GD bitki ve ürünlerin dünya çapında marketlerde görülmesi ile artmıştır. Bu nedenle, bitki ve bitki ürünlerinde GDO çeşitlerinin tespiti için güvenilir, hızlı ve düşük maliyetli methodların geliştirilmesine ihtiyaç vardır. GDO analizinde ilk adım genellikle GDO larda bulunan promotör veya terminatörler bölgelerinin taranmasıdır. GDO pozitif olarak tespit edilen örnekler üzerinde daha sonra kalitatif ve kantitatif olay spesifik ileri analizler pozitif tespitin kontaminasyondan kaynaklanmadığından emin olunması için gerçekleştirilmelidir. Bu durum GD ürünlerin etiketlenmesi için tanımlanmış eşik seviyelerinin olduğu ülkelerde de ciddi bir öneme sahiptir. Eş zamanlı PZR GDO tespiti ve kantifikasyonu için en yaygın kullanılan tekniktir. Bu teknik ile hedef genin çoğalması, floresan boyalar kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenebilir. En sık kullanılan floresan boyalar oligonükleotid problar, yüksek çözünürlükte erime boyaları ve DNA bağlama boyalarıdır. En spesifik tespit sadece hedef dizilerine bağlanan oligonükleotid problar kullanılarak yapılabilir. Bu nedenle yüksek maliyetli olmalarına rağmen oligonükleotit problar en çok tercih edilen floresan boyalardır. DNA bağlama boyaları ve yüksek çözünürlükte erime boyaları çift iplikli DNA molekülüne bağlanırlar. DNA bağlama boyaları belli bir konsantrasyonun üstünde kullanıldığında PZR ‘ı inhibe edebililir. Yüksek çözünürlükte erime boyalarının minimum PZR inhibisyon etkisi vardır. Ayrıca yüksek çözünürlükte erime boyaları DNA bağlama boyaları ile karşılaştırıldığında hidrojen bağlarına 4 kat daha fazla bağlanır ve üstün erime eğrisi çözünürlüğü elde edilir. Eş zamanlı PZR ile GDO tespitinde en çok hedeflenen diziler karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); karnabahar mozaik virüse ait 35S terminatorü (t35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (FMV); Agrobacterium tumefacien’e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS), nopalin sentaz promotörü (pNOS) ve 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate sentaz (epsps) geni; Streptomyces hygroscopicus’a ait bar geni (BAR); Streptomyces viridochromogenes’a ait phosphinotricin-Nacetyltransferases (pat) genleridir. Bu çalışmada, GDO lu bitkilerin %99 undan fazlasının içerdiği karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (pFMV); Agrobacterium tumefacien’e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS) dizilerinin aynı anda tespiti için tek bir yüksek çözünürlükte erime (HRM) boyası kullanılarak çoklu eş zamanlı PZR methodu geliştirildi. Farklı PZR ürünleri arasındaki ayrım hedef DNA ların erime sıcaklıkları farklılıklarına dayalı olarak yapılmıştır. Ayrıca, bu elementlerin taranması için gerekli olan toplam analiz süresini kısaltmak için enzim içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemi geliştirildi. PZR tabanlı metodolojilerde hassas ve etkili sonuçlar elde etmek için yüksek kaliteli DNA gereklidir. Bu çalışmada, yüksek miktarda ve kalitede DNA elde etmek için soya ve mısır örnekleri üzerinde 5 farklı silika kolon tabanlı DNA ekstraksiyon protokolleri denenmiştir. Protokollerin üçü enzimatik adımlara dayanırken diğer 2 protokol ise tamamen kimyasal ve fiziksel hücre parçalama yöntemine dayanmaktaydı. Yöntemlerin hepsinde guanidin tiyosiyanat PZR inhibitörü inaktivasyonu ve DNA bağlanması için bir kaotropik ajan olarak kullanılmıştır. GDO tespiti için mevcut DNA ekstraksiyon metodolojileri en az 1,5 μg DNA ve 1.6 ve 2.0 arasında A260/280 oranı ile sonuçlanmalıdır. Tüm geliştirilmiş methodlardan elde edilen DNA ekstraktların A260/280 oranı istenilen aralıkta elde edildi. Tüm protokoller ile minimum limitden en azından 10 kat daha fazla olan 15 μg’ dan daha fazla DNA elde edildi. DNA konsantrasyonu açısından en iyi sonuçları boncukla homojenizasyon ve hekzasetiltrimetil amonyum bromür (STAB) muamelesi içeren protokollerden elde edilmiştir. Proteinler 280 nm’ de absorbladığı için A260/A280 oranı DNA ektraktlarındaki proteinlerin varlığının hesaplanmasında kullanılır. Diğer taraftan, karbonhidratlar, fenoller, aromatik bileşikler ve ağır metaller gibi diğer tip PZR inhibitörlerinin varlığı da PZR sonuçlarını etkileyebilir. Karşılaştırmalı olarak eş zamanlı PZR verimliliğine farklı protokoller ile elde edilen DNA kalitesinin etkisini değerlendirmek için her protokolden aynı miktarda DNA kullanılarak eş zamanlı PZR gerçekleştirildi. Eş zamanlı PZR çalışmalarında genel bitki kloroplast DNA sını hedefleyen PZR primerleri kullanıldı. DNA konsantrasyonu ve saflığı farklı protokollerden elde edilen tüm seyreltilmiş DNA lar için aynı olması nedeniyle elde edilen Ct değerleri PZR inhibitörlerinin varlığına işaret etmiştir. Tüm DNA örnekleri bitki kloroplast DNA sına spesifik erime sıcaklığında pik vermiştir. Boncuk ile homojenizasyon ve STAB muamelesini içeren protokoller ile elde edilen DNA lardan elde edilen eşik döngüsü değerleri diğer protokollere göre yaklaşık olarak 2 döngü daha düşük olarak bulunmuştur. Bu durum PZR inhibitörlerinin elimine edilmesinde bu iki protokolün daha başarılı olduğunu gösterdi. Bu iki protokol arasındaki fark proteinaz K muamelesi adımının dahil edilmesidir. DNA izolasyonu için gerekli olan maliyet ve toplam süreyi azal°ak amacıyla proteinaz K içermeyen protokol seçildi. FMV, NOS, 35S pozitif referans gıda örnekleri akredite gıda kontrol laboratuarları tarafından temin edilmiştir. FMV, NOS, 35S pozitif gıda örneklerinden çıkarılan DNA’ lar hedef spesifik primer çiftleri kullanılarak çoğaltıldı. Amplifikasyon döngülerinden sonra erime eğrisi analizi gerçekleştirildi ve hedeflenen PZR ürünlerinin Tm leri hesaplandı. Hedef spesifik erime pikleri NOS spesifik reaksiyon için 73 ± 0.38˚C de, FMV spesifik reaksiyon için 80˚C ± 0.28˚C de, 35S spesifik reaksiyon için 82.26 ± 0.29˚C de ve bitki kloroplast DNA sına specifik reaksiyon için 82 ± 0.33˚C de elde edildi. Genellikle aynı amplikon için Evagreen kullanılarak yapılan eş zamalı PZR ile elde edilen erime sıcaklıkları 0.5 ve 1 ˚C arasında değişebileceği kabul edilmektedir. Bu çalışmada elde edilen standart sapmalar 0.4˚ C ’den daha düşük bulunmuştur. Ayrıca, bütün Evagreen eş zamanlı PZR reaksiyonları önemli ek amplifikasyon ürünleri olmadan tek bir spesifik sinyal üretmiştir. Eş zamanlı PZR kantifikasyon standatları referans örneklerin purifiye edilmiş PZR ürünleri kullanılarak hazırlandı. Seri dilüsyonlar hedeflenen genin 100-1010 kopyasını içeren standart örnekler hazırlanması için yapıldı. Tespit limitini elde etmek için gr örnek başına 1-100 kopya 35S ve NOS içeren soya örnekleri ve gr örnek başına 1-100 kopya FMV içeren mısır örneği hazırlandı. 35S, FMV, NOS hedefli methodolojiler için tespit limiti 1 gen kopya/gr gıda örneği olarak bulunmuştur. Ancak bu çalışmada standart karışımlar referans gıda kontrol laboratuvarından elde edilmediği için methodların tespit limitleri geçek tespit limitlerinin sadece kaba tahminleridir. 35S, NOS ve FMV kalıplarının DNA karışımı primerlerin spesifikliğini test etmek için hazırlanmıştır. DNA karışımı her spesifik primer çifti ile eş zamanlı PZR ile çoğaltıldı. Eş zamanlı PZR reaksiyonlarının spesifikliği tüm amplifiye PZR ürünlerinin sekanslanması ile incelenmiştir. Sonuçlar çoğaltılmış dizilerin amaçlanan hedeflere en az %99 benzer olduğunu göstermiştir. İlk olarak dubleks eş zamanlı PZR denemeleri her farklı DNA kalıplarının aynı miktarda eklenmesi ile gerçekleştirildi. Dubleks reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünleri ile sonuçlanan daha fazla tercih edilen DNA kalıpları erime eğrisi analizi ile tespit edildi. FMV kalıplarından reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünü elde edildi. 35S kalıpları ise 35S ve NOS kalıpları içeren PZR larda daha fazla tercih edildi. Dubleks PZR larda farklı ilk örnek miktarının etkisini belirlemek için sadece tek bir tip Tm piki elde edene kadar çalışmalara devam edildi. Genel sonuçlar iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları altında elde edilemezken iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları üzerindeki her hedef için elde edilebildiği gösterildi. Başarılı ikili karışım denemelerinden sonra her bir referans örnekten 1000 kopya kullanılarak üçlü karışım hazırlandı. Üç primer çiftinin çoklu eşmanalı PZR da beraber çalışabildiğini göstermek ve spesifik olmayan PZR ürünü veya primer dimeri oluşturmadığını göstermek için üçlü eş zamanlı PZR çalışmaları gerçekleştirildi. Üçlü kombinasyonlar referans örneklerin 1/1/1 röfatif kopya sayısı oranına uygulanmıştır. NOS, FMV ve 35S spesifik çoklu eş zamanlı PZR 3 farklı erime piki elde edilmesi ile sonuçlandı. NOS, FMV ve 35S hedeflerine karşılık gelen erime pikleri sırasıyla 73.04±0.13˚C, 80.21±0.10˚C ve 82.15±0.08˚C de gözlenmiştir. Çoklu reaksiyonlarda ek amplifikasyon gözlenmemiştir. Bitki DNA ları her zaman GDO tarama reaksiyonlarda baskın hedef olacağından, bitki DNA ları FMV, 35S ve NOS hedeflerinin tespit hassasiyetini artırmak için ikili ve üçlü DNA karışımlarına dahil edilmemiştir. Bitki spesifik eş zamanlı PZR lar GDO taraması reaksiyonlarında pozitif PZR amplifikasyon kontrolü olarak kullanılmıştır. Daha önce akredite gıda kontrol laboratuvarları tarafından analiz edilen ham ve işlenmiş gıda örnekleri geliştirilen metodoloji kullanılarak tekrar analiz edildi. Köfte, soya yağı, soya unu, mısır, mısır yağı, don yağı, kedi ve köpek mamaları, çikolata, baklava ve ekmek çeşitlerini içeren toplam 96 örnek analiz edildi. Sonuçlarımız akredite gıda kontrol laboratuvarlarında elde edilen sonuçlar ile %100 uygumludur. Bu çalışma tek bir yüksek çözünürlükte erime boyası kullanılarak 35S, NOS ve FMV bölgelerinin eş zamanlı çoklu tespitinin mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca enzimatik olmayan hücre parçalama yöntemlerini kullanarak yüksek kalitede DNA elde edilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir.Food plants that are being produced or modified by genetic engineering techniques are conventionally named as genetically modified (GM) crops or genetically modified organisms (GMOs). The investigations have revealed different results on the risks of GMOs on human health and the environment. The regulatory need to monitor and verify the presence and the amount of GM varieties in crops and products has increased with the release of GM crops and products in the markets worldwide. Therefore, there is a need to develop reliable, quick and cost-effective methods for the detection of GM varieties in crops and their products. Screening for the GMO promoters or terminators is usually the first step for GMO analysis. The subsequent event specific qualitative and quantitative GMO analyses must be carried on the GMO positive samples to ensure that the detected GMOs were not originated from the contaminations. This has a substantial importance in countries where the quantitative threshold levels were defined for labeling of the GM products. In this study, we developed a multiplex QPCR methodology using a single high resolution melting dye to simultaneously detect Cauliflower Mosaic Virus 35S (35S) promoter, Agrobacterium tumefaciens Nopalin Synthase (NOS) terminator and Figworth mosaic virus 35S (FMV) promoter, which are contained in more than 99% of the GMO events. Discrimination between the different PCR products was based on the differences in melting temperatures of the target DNAs. We also developed an enzyme free DNA extraction methodology for food samples to shorten the total analysis time necessary for the screening of these elements. High quality DNA is necessary to obtain sensitive and efficient results in PCR based methodologies. In this study, we tried 5 different silica column based DNA extraction protocols on soybean and maize samples to obtain DNA with high quantity and quality. Three of the protocols were based on enzymatic steps whereas the other two methods were completely based on the chemical and physical cell disruption methodologies. In all of the methodologies, guanidium thiocyanate was used for PCR inhibitor inactivation and as a catastrophic agent for DNA binding. The current methodologies of DNA extraction for GMO detection must result in at least 1.5 μg DNA with A260/280 ratios between 1.6 and 2.0. A260/280 ratios of DNA extracts from all of the developed methods were in the desired range. All of the protocols were resulted in DNA amounts higher than 15 μg DNA, which is at least 10x higher than the minimal limit. The best results in terms of DNA concentration were obtained from the protocols that include bead beating and CTAB treatment. Since proteins absorb at 280 nm, the ratio A260/280 is used to estimate the presence of the proteins in DNA extracts. On the other hand, the presence of other types of PCR inhibitors such as carbohydrates, phenols, aromatic compounds and heavy metals may also affect the PCR results. To comparatively evaluate effect of the DNA quality obtained by different protocols on the QPCR efficiency, the same amount of template DNAs were used in QPCR. The universal plant chloroplast DNA targeted PCR primers were used in real time PCR trials. The obtained Ct values indicated the presence of PCR inhibitors because DNA concentrations and purities were the same for all the diluted templates obtained from different protocols. All of the templates were resulted in plant chloroplast DNA specific melting temperatures (Tm). Threshold cycle (Ct) values obtained using the protocols that include bead beating and CTAB treatment were approximately 2 cycles lower than the other protocols. This showed that these two protocols were more successful in eliminating the PCR inhibitors. The difference between these two protocols was the inclusion of proteinase K treatment step. To reduce the cost and total time necessary for the DNA isolation, we chose the protocol without proteinase K treatment. FMV, NOS, 35S positive reference food samples were supplied by the accredited food control laboratories. Extracted DNAs from FMV, NOS, 35S positive food samples were amplified by using the target specific primer pairs. Melting curve analysis was performed after the amplification cycles and Tm of the targeted PCR products were calculated. The target specific melting peaks were obtained at 73 ± 0.38˚C for NOS, 80˚C ± 0.28˚C for FMV, 82.26 ± 0.29˚C for 35S and 82 ± 0.33˚C for plant specific reactions. It is generally accepted that the Tm obtained with Evagreen QPCR could vary between 0.5 and 1 ˚C for the same amplicon. In this study, the standard deviations were lower than 0.4 ˚C. In addition, all of the Evagreen QPCR reactions generated a single specific signal without major additional amplification products. QPCR quantification standards were prepared using the purified PCR products from the reference samples. Serial dilutions were done to obtain standard samples containing 100-1010 copies of the targeted gene. In order to obtain the limit of detection (LOD), soybean samples that contain 1-100 copies of 35S and NOS per gr of the sample, and maize samples that contain 1-100 copies of FMV per gr of the sample were prepared. The limits of detection were 1 gene copy/gr food sample for the 35S, NOS and FMV targeted methodologies. On the other hand, since the standard mixtures were not obtained from a reference food control laboratory, the detected LODs were rough estimations of the real LODs. A DNA mixture of the 35S, NOS, FMV genes were prepared to test the specificity of the primers. The DNA mixture was amplified via QPCR with each specific primer pair. The specificity of the QPCR reactions was examined via sequencing of the each amplified PCR product. The results showed that the amplified sequences have at least 99% similarity to the intended targets. The same amounts of the different DNA templates were added to the initial duplex QPCRs trials. Favored DNA templates, which resulted in more abundant PCR products in duplex reactions, were determined via melting curve analysis. The FMV templates resulted in more PCR products. The 35S templates were favored in PCRs that contained the 35S and NOS templates. The subsequent trials were carried out till only one type of Tm peak was obtained to determine the effect of different initial template amounts on the duplex QPCRs. The overall results showed that; two different Tm peaks were not obtained under 1/100 relative template concentrations but two different Tm peaks were obtained for each target above 1/100 relative template concentrations. After the successful binary mixture trials, triple mixture was prepared using 1000 copies of the each reference sample. Triplex QPCR trials were carried out to show that 3 primer pairs can work together in the multiplex QPCR and do not form non-specific PCR products or primer dimers. The triple combinations were applied to 1/1/1 relative copy number ratios of the reference samples. The NOS, FMV and 35S specific multiplex QPCR resulted in 3 different melting peaks. The melting peak corresponding to NOS, FMV and 35S targets were observed at 73.04±0.13˚C, 80.21±0.10˚C and 82.15±0.08˚C, respectively. No additional amplification was observed in the multiplex reactions. Since plant DNAs will always be the dominant target in GMO screening reactions, plants DNAs were not included in the binary and triple DNA mixtures to increase the detection sensitivities of the FMV, 35S and NOS targets. Plant specific QPCRs were carried out in GMO screening reactions as a positive PCR amplification control. The raw and processed food samples, which were already analyzed by the accredited food control laboratories, were re-analyzed using the developed methodology. Total of 96 samples that include meatballs, soybean oil, soybean meal, corn, corn oil, tallow oil, cat and dog foods, chocolate, baklava and bread varieties were analyzed. Our results were in 100% accordance with the results obtained by the accredited food control laboratories. This study showed that multiple detection of 35S, NOS and FMV is possible using a single HRM dye. We also showed that it is possible to extract high quality DNA by using non-enzymatic cell disruption methodologies.Yüksek LisansM.Sc

Strategies to detect unauthorized GMO in the food and feed chain

To guarantee the traceability on the market and the freedom of choice for consumers, genetically modified organisms (GMO) legislations have been established in many countries, including in Europe (EU). However, the implementation of these legislations by the enforcement laboratories is becoming complex due mainly to the increasing number and diversity of GMO. To cope with the problematic of EU unauthorized GMO, this PhD aims to improve and strengthen the existing GMO detection system using high-tech approaches. First, as a study case, an overview of genetically modified (GM) rice, developed around the world was carried out to collect information related inter alia on elements found in their transgenic cassette. Second, according to this information, key targets, frequently found in GMO (p35S and tNOS) or exclusively observed in EU unauthorized GMO (t35S pCAMBIA), were selected to develop a strategy allowing to detect and characterize a broad range of GMO. This strategy, fully integrated in the GMO routine analysis, consists to characterize sequences surrounding detected key transgenic elements using a DNA walking approach. By this way, the acquisition of sequences from the junction between the transgenic cassette and the plant genome as well as the associations of elements typically found in transgenic constructs allow to confirm the presence of GMO in food/feed matrices. Due to its good performance thoroughly assessed via several unprocessed and processed food/feed matrices, this strategy represents a key tool, easily implementable by the enforcement laboratories. With the aim to even more simplify the workflow and increase the throughput of this strategy, the sequencing step was performed using the Next Generation Sequencing (NGS) technology instead of the Sanger technology. In parallel, the detection of GMO in alimentary matrices using exclusively the NGS technology, through a whole genome sequencing (WGS) approach, was also investigated. As this last approach does not theoretically require any prior information about the targeted sequences, GMO composed only of unknown transgenic elements could be detected. This work has thus allowed to provide additional strategies to the current GMO detection system in order to characterize a larger spectrum of GMO, both authorized or not

New plasmid calibrators for geminivirus-resistant (EMB-PV051-1 event) common bean (Phaseolus vulgaris L.) quantitation using simplex and duplex qPCR.

The geminivirus-resistant common bean, Embrapa 5.1, was the first commercial genetically modified (GM) event developed in Latin America by the Brazilian Agricultural Research Corp.. Therein novel standard reference plasmids were constructed for species-specific (pLEC) and event-specific (pFGM) qualitative and quantitative detection of Embrapa 5.1 GM common bean. To establish these plasmids as certified reference materials (CRM) for Embrapa 5.1 GM common bean, two DNA extraction protocols, simplex and duplex qPCR using two different operators (experimenters) were tested. The efficiency values ranged from 92% to 110% for the simplex and duplex reactions considering both operators. The limit of detection was enough to detect at least 0.1% GM content. These plasmids are suitable to be used as CRM for Embrapa 5.1 GM common bean. They will be useful for survey of food labels for compliance with legislation about GMO content in Brazil and in other countries where GM common bean is not yet approved for commercialization