The role of arachidonic acid mobilisation in myeloid cells

Haemopoietic growth factors (GF) are important for regulating the proliferation and differentiation of immature cells, but granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 3 (IL-3) also have a role in regulating the function of mature phagocytic cells. The study presented in this thesis investigated the GF regulation of phospholipase A2 (PLA2) in immature and mature haemopoietic cells. In mature neutrophils, respiratory burst (NADPH oxidase) and PLA2 activity stimulated by the agonist FMLP can be enhanced (primed) by GF. A comparison was made between the mechanism of priming of both PLA2 and NADPH oxidase by GM-CSF and TNF. GM-CSF and TNF both stimulate the phosphorylation and activation of p42ERK2 and p38 MAP kinase (MAPK) in neutrophils. To investigate the role of these MAPKs in priming PLA2 and NADPH oxidase, inhibitors of p42ERK2 (PD098059) and p38 MAPK (SB203580) were used. Inhibition of p42ERK2 blocked neither superoxide generation nor cytokine-mediated priming, but partially inhibited cytokine-mediated priming of PLA2. In contrast inhibition of p38 MAPK blocked primed and unprimed NADPH oxidase activity, but only partially inhibited primed PLA2 activity. The dissociation of the priming of these two enzymes systems indicates that they may activated by different mechanisms. Inflammation of the vascular endothelium is pail of the pathogenic process in the crisis phase of sickle cell disease (SCD). This study investigated whether the priming of neutrophil PLA2 and NADPH oxidase activity in response to in vitro GM-CSF and TNF was altered in both the steady state and crisis of SCD. The data showed raised resting levels of neutrophil PLA2 even in the steady state, indicating an ongoing activation of these cells. But there were reduced responses of PLA2 and NADPH oxidase to GF priming in both steady state and crisis, and this may contribute to the susceptibility of these patients to infection. Immature cells were also studied. A range of myeloid and lymphocytic cell lines were screened for the presence of PLA2 activity measured by arachidonate release stimulated by calcium ionophore. Immature myeloid cells (HL-60 and K562) had extremely low PLA2 activity which was not enhanced by GF. Immature lymphocytic cells. Daudi and IL-2-dependent CTLL cells also released little arachidonic acid, and PLA2 activity was not further enhanced by stimulation with IL-2. However, the GF dependent myeloid cell lines (TF-1, THP-1) and purified human CD34+ stem cells showed higher levels of PLA2 activity which was increased by GM-CSF and IL-3. This suggests that PLA2 activity may be important for mediating the effects of myeloid growth factors

Maintaining Identity within Chaos

"Epithelial wound healing is an inherent ability of all organisms to deal with aggressions from the surrounding environment and maintain tissue barrier integrity. Wounds can result from accidental trauma, surgery or various pathological conditions. Independently on the cause, all wounds need to be properly solved to avoid complications, ranging from infection to fibrosis and tumour initiation. Understanding the cellular and molecular basis of wound repair is an important asset for biomedical research. The process of wound healing is attained in a highly regulated and efficient manner to ensure correct return to homeostatic conditions.(...)

Determination of gene expression and proteome of brain tissue from schizophrenic patients

Orientador: Emmanuel Dias-NetoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A esquizofrenia é um distúrbio mental debilitante que afeta aproximadamente 1% da população mundial, caracterizado por sintomas produtivos como delírios e alucinações e sintomas negativos como apatia e decréscimo das emoções. Nesta tese, realizamos estudos do transcriptoma e do proteoma em tecido cerebral de pacientes com esquizofrenia, buscando identificar genes e proteínas envolvidas com esta doença. Em nossas análises transcricionais, utilizamos a técnica de Serial Analysis of Gene xpression (SAGE), uma abordagem ainda inédita em esquizofrenia. Os dados permitiram a análise de mais de 20 mil transcritos, e apontaram para o possível envolvimento de genes associados a processos como mielinização, função sináptica, metabolismo energético e homeostase de cálcio, incluindo genes anteriormente envolvidos com esquizofrenia, e também uma boa parcela de genes até então não associados com a doença. Uma pequena fração destes novos marcadores foi avaliada por Real-Time PCR permitindo a confirmação de alguns achados de SAGE. ossas análises de proteoma foram feitas com as técnicas de eletroforese de duas dimensões, seguida por espectrometria de massas e pela técnica de shotgun proteomics, também inédita em esquizofrenia. Estas análises foram realizadas com amostras de diferentes regiões cerebrais, incluindo córtex pré-frontal e lobo temporal anterior, e apontaram para alterações quantitativas em proteínas relacionadas com a homeostase de cálcio, citoesqueleto, metabolismo energético e de oligodendrócitos. De modo geral, observamos uma boa consistência entre os resultados obtidos quando estudamos diferentes classes de marcadores potenciais (genes e proteínas). Por muitas vezes os genes alterados não corresponderam a alterações quantitativas nas mesmas proteínas, no entanto, na maior parte dos casos, observamos alterações consistentes nas mesmas vias. Observamos a regulação diferencial do metabolismo de oligodendrócitos, energético, sináptico e revelamos a provável alteração da homeostase de cálcio em cérebros de pacientes com esquizofrenia, além de identificarmos genes e proteínas diferencialmente expressas nunca relacionadas à doença. Nossos dados reforçam achados prévios, apontam potenciais biomarcadores e podem fornecer novas pistas na compreensão da esquizofreniaAbstract: Schizophrenia is a mental debilitating disorder that affects 1% of the world population. It is characterized by positives symptoms such as delirium and hallucinations and negative symptoms such as apathy and emotion decrease. Here, we have studied the ranscriptome and proteome of brain samples of patients with schizophrenia, in an attempt to identify genes and proteins markers of the disease. Our transcriptome analyses of pre-frontal cortex were performed with Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), here used for the first time in the study of schizophrenia. The data obtained allowed the analysis of approximately 20,000 transcripts, which suggested the importance of myelinization, synaptic function, energy metabolism and calcium homeostasis, in the genesis of schizophrenia. A series of genes previously implicated in the disease were identified, together with new potential markers which were revealed here for the first time. A small fraction of these was validated using realtime PCR, which confirmed some of the SAGE findings. Two-dimensional gel electrophoresis, mass spectrometry and shotgun proteomics were the approaches used here for large-scale protein analysis in schizophrenia. These approaches were used in brain samples derived from distinct areas such as pre-frontal cortex and anterior temporal lobe, and indicated quanitative alterations of proteins involved with calcium homeostasis, energy and oligodendrocyte metabolism and cytoskeleton. In general, a good correlation was observed when the different approaches (transcriptome and proteome) were used. In may cases, the alterations of some genes was not reflected by a correspondent alteration of the encoded protein. However, in most cases, reproducible alterations were found in the same pathways. Beside the identification of new schizophrenia-related genes and proteins, we also confirmed the the differential regulation of oligodendrocyte, synaptic and energetic metabolism, in this disease.Our data reinforce previous findings, and suggest new potential biomarkers that may contribute to the understanding of schizophreniaDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula

MicroRNA regulation of podocyte insulin sensitivity

Diabetic Nephropathy (DN) is a devastating complication of diabetes, and is the leading cause of end stage renal failure in the UK. Uncovering mechanistic pathways in DN pathogenesis is vital in establishing new therapeutic targets to prevent its progression. Podocyte-specific insulin resistance in mice leads to a renal injury that mimics that seen in diabetic kidney disease, indicating that podocyte insulin signalling may be of critical importance in the development of DN. MicroRNAs (miRNAs) are post-transcriptional gene regulators that demonstrate aberrant expression in multiple diabetic models, and are implicated in the development of insulin resistance in liver, fat and muscle. The aim of this work was to establish the role of miRNAs in the regulation of podocyte insulin signalling. This thesis details the differential microRNA expression of an in vitro model of podocyte insulin resistance, and the subsequent validation of miR-155-5p as an important regulator of podocyte insulin sensitivity. MiR-155 was upregulated in insulin-resistant podocytes, and in the urine of patients with DN. Furthermore, overexpression of miR-155 in podocytes resulted in reduction in PI3K/Akt signalling and abrogation of glucose uptake in vitro. Bioinformatic analyses were used to identify putative miR-155 targets. PIK3R1 and CSF1R were confirmed to demonstrate miR-155 induced repression, hypothesised to result in podocyte insulin resistance via negative regulation of PI3K signalling. Whole glomerular miRNA sequencing from the db/db mouse indicated that changes associated with established diabetic pathways of oxidative stress, inflammation and fibrosis are transcriptionally activated as early as 4 weeks. These findings support the hypothesis that changes in miRNA expression are an initiating insult in DN, and highlight miRNAs as potential therapeutic targets to arrest disease development

Molecular and cellular changes in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) skin during metamorphosis

Metamorphosis in vertebrates is driven by thyroid hormones (THs) and in flatfish consists in the extraordinary transformation of a symmetric pelagic larva into an asymmetric benthic juvenile. The mechanisms underlying how THs can orchestrate the cellular, morphological and functional modifications associated with maturation of juvenile/adult states in flatfish are still unexplored. The Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) was the target of the present thesis and the molecular basis of THs action was determined in the head, skin and gastrointestinal tract using RNA sequencing. The first objective of the present thesis was to generate reference transcriptomes of these three tissues using 454 pyrosequencing. Transcriptome dynamics during metamorphosis were mapped with SOLiD sequencing of whole larvae and revealed greater than 8,000 differentially expressed (DE) genes significantly up- or down-regulated in comparison with the juvenile stage. The present study contributes substantially to the molecular resources available for this species and will be an important tool for identifying new potential molecular markers for solving problems related to Atlantic halibut production during metamorphosis. The second part of this thesis was focused in the skin due to its importance as the major barrier between the animal and its external environment and the involvement of THs in skin development during metamorphosis has been described. The present work targets the development of the primary barrier, osmoregulatory capacity and pigmentation development of Atlantic halibut skin. A multivariate approach using bioinformatics, biochemistry and molecular biology techniques allowed the characterization of the asymmetric development of H. hippoglossus ocular and abocular skin sides. The asymmetric development of skin is associated with metamorphosis although establishment of its primary barriers and osmoregulatory functional properties occurs early and is independent of metamorphosis. In addition, it was hypothesized that thyroid axis has a central role in the asymmetric pigmentation observed during metamorphosis in ocular and abocular skin sides. The third part consisted in study the cross-talk between the thyroid and cortisol axis and it was observed that both THs and cortisol act synergistically in modulating the changes in skin during halibut metamorphosis.A metamorfose em vertebrados é um processo pós-embrionário desencadeado pelas hormonas da tiróide (THs) e em peixes-chatos (pleuronectiformes) consiste no processo de transformação da larva pelágica simétrica em juvenil bentónico assimétrico. Durante a metamorfose destes peixes teleósteos ocorre a migração de um dos olhos. No fim do processo metamórfico os olhos ficam no mesmo lado da cabeça e a pigmentação acentua-se apenas no lado ocular. A importância das THs durante a metamorfose nos “peixes-chatos” tem sido demonstrada ao longo dos últimos anos, no entanto, o papel destas hormonas durante as modificações celulares, morfológicas e funcionais associadas à maturação dos peixes juvenis/adultos é pouco claro. Após entrar nas células a partir de transportadores específicos (por exemplo os “monocarboxylate transporters”, MCTs) e se ligarem a receptores nucleares (TRs), as THs activam a expressão génica e por sua vez induzem mudanças na estrutura, maturação e função dos tecidos e órgãos. A forma biologicamente activa é a T3 e é originada nos tecidos periféricos pela conversão da T4 através da acção de enzimas específicas chamadas de deiodinases, que podem também inactivar as THs. Assim, como as THs actuam na transcrição de genes responsivos, definiu-se que uma das principais hipóteses deste trabalho é que a maturação dos tecidos durante a metamorfose deve ser precedida a modificações significativas no transcriptoma. O alabote do Atlântico (Hippoglossus hippoglossus) foi escolhido como modelo de estudo devido à sua importância para a aquacultura mas principalmente devido ao seu lento desenvolvimento larvar (metamorfose dura aproximadamente 58 dias) e ao tamanho das larvas (aproximadamente 14.50-23.00 mm início e fim da metamorfose). Estas características permitiram não só analisar larvas individuais mas também dissecar tecidos e analisá-los em separado a nível molecular. O primeiro objectivo do presente trabalho foi determinar a base molecular da acção das THs através da sequenciação do transcriptoma por RNAseq de três tecidos (cabeça, pele e trato gastrointestinal – trato GI) durante a metamorfose de H. hippoglossus (Capítulo 2). Três diferentes transcriptomas de referência foram gerados utilizando a técnica de pirosequenciação 454 e após a “assembly” foram obtidos 90.676 (cabeça), 65.530 (pele) e 38.426 (tracto GI) contigs. Através de uma abordagem de múltiplos passos de Blast, mais de 57 % dos contigs foram anotados com sucesso, permitindo assim identificar para cada tecido um conjunto de processos biológicos e genes candidatos associados às alterações morfológicas e funcionais durante a metamorfose. Posteriormente, a dinâmica do transcriptoma durante a metamorfose foi avaliada através da sequenciação de larvas individuais (n = 3) de vários estados metamórficos. A abordagem utilizada foi uma sequenciação do tipo SOLiD, e após o mapeamento das sequências “reads” contra o transcriptoma de referencia foi possível detectar mais de 8.000 genes diferencialmente expressos, sobre- ou sub-expressos ao comparar os estados metamórficos com o juvenil. A maioria dos genes diferencialmente expressos não são responsivos às THs. Utilizando uma base de dados “in house” foram identificados seis grupos (clusters) diferentes de genes responsivos baseados no seu padrão de expressão durante a metamorfose. A maioria dos 145 genes responsivos às hormonas da tiróide encontram-se sub-expressos quando comparados com o juvenil após a metamorfose. Estes genes responsivos estão associados a diferentes “gene networks”, cascatas de sinalização “signalling cascades” e factores de transcrição que devem liderar as alterações no desenvolvimento e maturação dos tecidos durante a metamorfose. Durante a análise do transcriptoma foram identificados dois transcriptos diferentes que correspndem à deiodinase 3 (Dio3). A Dio3 é uma enzima que desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento dos vertebrados, através do controlo da disponibilidade das THs nos vários tecidos. O segundo objectivo da presente tese foi avaliar qual é o papel destes dois transcriptos dio3 durante a metamorfose do alabote do Atlântico (Capítulo 3). Análises bioinformáticas permitiram concluir que estes dois transcriptos correspondem a genes duplicados (posteriormente designados de dio3a e dio3b) e que é comum à maioria dos peixes teleósteos. A expressão destes dois genes na pele foi divergente entre os lados ocular e não-ocular durante a metamorfose. Os resultados obtidos da expressão génica indicaram que o gene dio3b pode estar associado à maturação divergente dos dois lados da pele. Larvas expostas ao bloqueador de produção de THs, o MMI, resultou numa sobre-expressão de dio3b no lado ocular da pele, sugerindo que as THs geralmente inibem a expressão deste gene durante esta fase do desenvolvimento. Os resultados indicam que a expressão divergente de dio3 nos lados ocular e não-ocular da pele durante a metamorfose pode contribuir para o desenvolvimento assimétrico em resposta às THs. A pele nos vertebrados é um órgão multifuncional e corresponde à principal barreira entre o animal e o seu meio ambiente. Durante a metamorfose, a pele do Hippoglossus hippoglossus muda de um simples epitélio para um tecido composto estratificado em várias camadas após a metamorfose. A epiderme fica composta por vários tipos de células com diferentes funções e a disponibilidade das THs na pele durante a metamorfose é regulada pela acção coordenada das deiodinases. Por estas razões a pele representa um interessante alvo de estudo para a acção das THs durante a metamorfose. Os capítulos 4 e 5 foram dirigidos à pele em especial às suas funções como barreira primária, osmoregulação e pigmentação, e a sua possível relação com as hormonas da tiróide durante a metamorfose do alabote do Atlântico. A combinação de técnicas de histologia, histoquímica e electrofisiologia permitiu estudar as funções de barreira e osmorregulação da pele, através da análise ontogénica das células goblet (secreção de mucinas) e dos ionócitos (presença da Na+,K+-ATPase) na pele ocular e não-ocular (Capítulo 4). A integridade do epitélio e as propriedades electrofisiológicas foram avaliadas por electrofisiologia na pele no lado ocular. As mucinas neutras são as principais glicoproteínas produzidas pelas células goblet da pele durante a metamorfose, e a sua abundância aumenta durante o processo metamórfico. Nos estágios metamórficos 8 a 9B estas células bem como o número de mucinas é mais abundante no lado ocular da pele. Este aumento e a sua abundância assimétrica entre os dois lados da pele é concomitante com o aumento das THs, sugerindo-se que o seu desenvolvimento encontra-se sob o controlo destas hormonas. Ao contrário das goblet cells (mucinas), o número de ionócitos com imunoreactividade positiva para a Na+,K+-ATPase (NKA) decresce ao longo da metamorfose e a distribuição é simétrica entre os dois lados da pele. As alterações morfológicas observadas têm um efeito demonstrado na função de barreira da pele tal como reflectido pelas propriedades electrofisiológicas do epitélio (resistência transepitelial/potencial e “short circuit current”). No entanto, a maturação das características funcionais ocorreu no estágio 8, antes da maturação completa da pele e do clímax da metamorfose. Estes resultados indicam estudo que há um desenvolvimento assimétrico da pele e que este está associado com a metamorfose. No entanto, o estabelecimento das suas propriedades funcionais ocorre cedo e é independente da metamorfose. No capítulo 5 foi utilizada uma abordagem molecular para avaliar a resposta assimétrica dos dois lados da pele às THs e sua relação com a pigmentação. Neste estudo, foi avaliada a expressão de genes relacionados com o transporte, metabolismo e acção das THs, e de genes envolvidos na melanogénese e na regulação da pigmentação na pele ocular e não-ocular durante a metamorfose do alabote do Atlântico. Foi também avaliada o possivel “cross-talk” entre os eixos da tiróide e stress durante a maturação da pele e pigmentação. A expressão dos receptores da tiróide e deiodinases (dio1, dio2, dio3a, dio3b, trαa and trβ) foi simétrica entre os lados ocular e não-ocular da pele. No entanto, a expressão dos transportadores das THs (mct8, mct10) foi assimétrica nos dois lados da pele durante a metamorfose. Genes envolvidos na melanogénese (tyrp1, dct) e regulação da pigmentação (sox10) tiveram uma expressão semelhante aos transportadores das THs. Este estudo contribui para uma melhor compreensão das bases moleculares da assimetria na pigmentação observada durante a metamorfose do alabote do Atlântico, e revela um papel central para o eixo da tiróide. A hipótese da existência de um “cross talk” entre o eixo da tiróide e do cortisol durante a metamorfose onde as THs e o cortisol actuam de forma sinergética na modulação das alterações na pele durante a metamorfose do alabote do Atlântico foi demonstrada neste capítulo. A presente tese permitiu gerar novo conhecimento sobre os efeitos das THs no desenvolvimento dos “peixes chatos” em especial na cabeça, pele e trato gastrointestinal. Esta tese contribuiu também para entender melhor acerca do desenvolvimento assimétrico dos lados ocular e não-ocular da pele e como as THs se encontram envolvida neste processo

Structural insights into the human multifunctional protein RuvBL2

"RuvB-Like transcription factors, RuvBL1 and RuvBL2, function in cell cycle regulation and development. They have been attributed the functions of chaperone, transcription regulator and helicase, sometimes in an ATP-dependent fashion, but just how these functions are regulated in each protein is still a mystery, that many groups have been working to understand. There is already a vast, albeit scattered amount of knowledge gathered about RuvBL1 and RuvBL2 proteins.(...)

Fibronectin cues during somite formation

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013The formation of the string of individual somite segments is a hallmark morphogenetic event during embryonic development, establishing the basic foundations of the vertebrate body. Somites pinch off from the mesenchymal presomitic mesoderm on either side of the neural tube, as epithelial blocks of cells, with a strict chronological sequence in a rostral to caudal fashion. In recent decades, the intense scrutiny and investigation on the temporal and spatial regulation of somitogenesis has produced a fascinating picture on the mechanisms underlying vertebrate embryo segmentation. However, our knowledge regarding the cellular performance involved in the detachment and individualization of the somitic segment remains quite obscure. The extracellular matrix molecule fibronectin has been implicated in somitogenesis since its discovery and its role was reinforced with the genetic deletion in the mouse embryo, but how fibronectin participates in the formation of the epithelial somite is still unclear. The aim of this thesis is to investigate how the interaction between the presomitic mesoderm cells and the fibronectin matrix contributes to the detachment of the somite sphere of epithelial cells, using the chicken embryo as a model. In Chapter 2 we first resolve the disputed role of the ectoderm overlying the presomitic mesoderm, showing that is serves as a source of fibronectin, which becomes assembled as a fibrillar matrix around the presomitic mesoderm, supporting somite formation. Through microsurgical explant collection and culture we show for the first time that a presomitic mesoderm isolated from all surrounding tissues can undergo somitogenesis provided that the original fibrillar fibronectin sleeve is preserved. In Chapter 3 and 4 we adopt a three-dimensional view of somite formation, evaluating in detail the cellular rearrangements underlying somitogenesis (Chapter 3) and the architecture of the fibronectin matrix along the full extent of the presomitic mesoderm and somites (Chapter 4). The combination of time-lapsed movies and explant culture analysis presented in Chapter 3 revealed that intersomitic cleft formation is mostly driven by the cells in the rostral border and that mesenchymal cells from the central locations contribute to the outer epithelial layer of somites. The high-resolution analysis of the extracellular matrix displayed in Chapter 4 revealed that an increased fibrillar complexity of the fibronectin matrix accompanies presomitic mesoderm maturation, preluding somite formation. We co-analyzed the distribution of the epithelium-associated extracellular molecule laminin and found, together with our observations in Chapter 2 that it does not contribute to the epithelialization of the somite. The thorough analysis in this Chapter is also one of the few detailed evaluations of extracellular matrix component assembly in a complex three-dimensional in vivo tissue. In the final chapter, Chapter 5, we investigate the role of cell tension, elicited by the cell attachment to its milieu, in the epithelialization and detachment of somites. The epithelialization process is abrogated by specific cell tension inhibitors, but already formed somites can partially maintain their epithelial organization. Remarkably, these inhibitors also interfere with the spatial regulation of Meso1 expression, a key gene underlying both the location of the future somite boundary and the establishment of the rostral-caudal polarity of the somite segment. In combination with the previous chapters, these results indicate that the assembly of a fibronectin matrix along the caudal-rostral axis of the presomitic maturation is a part of the maturation process: the increased fibrillar complexity provides the tensional support for both the cell rearrangements essential for somite detachment, epithelialization of the peripheral cells and apparently also as a spatial cue influencing the developmental programs of the presomitic mesoderm. Overall, this thesis demonstrates the prominent role of the fibronectin extracellular matrix during somitogenesis in the chicken embryo. The results obtained highlight that the extracellular matrix dimension is a worthy player during embryonic development.O esquema geral do desenvolvimento embrionário dos Vertebrados é marcado por duas conspícuas fileiras de elementos repetidos, situadas em ambos os lados do tubo neural, localizado numa posição axial. Estas estruturas repetidas, chamadas sómitos, vão originar os elementos ósseos que compõem o esqueleto axial, as vértebras, de onde deriva o nome deste sub-filo. Os sómitos dão também origem à musculatura esquelética do tronco e membros, assim como à derme das costas, entre outros tecidos. Os sómitos são originários de um tecido mesodérmico não-segmentado, de forma cilíndrica, situado em ambos os lados do tubo/placa neural, tecido esse que é denominado mesoderme pré-somítica (MPS). Em conjunto, os sómitos e as MPS compõem a mesoderme paraxial (i.e. a mesoderme imediatamente lateral ao eixo central). Cada par de sómitos destaca-se, de um modo temporal e espacialmente regulado, da extremidade mais rostral da MPS, originando um gradiente caudo-rostral de crescente maturação somítica. Ao mesmo tempo, o embrião continua a alongar-se no sentido caudal, e a gastrulação que decorre no botão caudal acrescenta celulas à MPS mesenquimatosa A formação de cada sómito epitelial é acompanhada por um processo de transição mesênquima epitélio, resultando na formação de uma esfera de células epiteliais rodeando um núcleo de células mesenquimatosas. A formação dos sómitos não só é importante para a formação das vértebras e outros tecidos que deles directamente derivam, mas também são responsáveis pela imposição do arranjo segmentado do sistema nervoso periférico. Embora a formação dos sómitos intrigue observadores desde tempos longínquos, as mais recentes décadas foram fundamentais para elucidar alguns dos aspectos mais intrigantes deste fenómeno. Dada a importância estrutural dos sómitos em todo o desenvolvimento embrionário subsequente, a estrita regulação temporal e espacial da somitogénese foi alvo de um interesse superior, que culminou com a descoberta da primeira evidência da regulação temporal. Genes com um comportamento transcripcional cíclico, adequadamente denominados “genes cíclicos”, dos quais Hairy1 foi o primeiro descrito, evidenciaram a existência de um mecanismo metrónomo (oscilador), essencial para a regulação temporal da somitogénese em embriões de galinha. Posteriormente foi descoberta a existência de um gradiente de maturação caudo-rostral ao longo da MPS que balizava, a um nível hipotético do gradiente, a actividade do oscilador, transformando-a num localização espacial na MPS, coincidente com a formação de um segmento somítico. Estas evidências despoletaram toda uma nova compreensão do fenómeno, não só do ponto de vista conceptual como mecanístico, não obstante o mecanismo de oscilador-gradiente para a produção regular de segmentos já tivesse sido postulado anteriormente por modelos matemáticos. Embora nos dias de hoje já tenhamos uma ideia bastante robusta de como a somitogénese é regulada, ainda são numerosas as questões basilares cujas respostas ainda permanecem pouco claras. Nesta tese pretendemos abordar o fenómeno da somitogénese num dos aspectos que tem sido mais negligenciado: a formação morfológica de estruturas epiteliais, individuais, discretas – os sómitos -, a partir de um tecido mesenquimatoso, uniforme e não-segmentado – a MPS. Durante a somitogénese as células da MPS rostral rearranjam-se de um modo rápido e dramático, formando uma fenda transversal, e destacando-se da MPS remanescente sob a forma de uma esfera epitelial. A formação de sómitos é um fenómeno extremamente robusto, ocorrendo mesmo quando genes envolvidos na regulação espácio-temporal são geneticamente removidos. Embora os mecanismos envolvidos na formação dos sómitos ainda sejam pouco claros, a investigação de outros fenómenos morfogenéticos embrionários têm revelado que o seu enquadramento extracelular é essencial na orquestração dos comportamentos celulares subjacentes à criação de novas formas. Nesta tese procurámos aprofundar a compreensão da formação dos sómitos no embrião de galinha, explorando a interacção entre as células das MPS e os componentes não-celulares presentes no espaço extracelular, conjuntamente denominados matriz extracelular (MEC). Em particular, investigámos o papel da fibronectina, uma glicoproteína da MEC, durante a formação do sómito epitelial. De entre as várias moléculas que compõem a MEC, a fibronectina encontra-se presente de um modo ubíquo durante a embriogénese mas também em tecidos adultos. A fibronectina é polimerizada numa complexa rede de fibrilhas num processo totalmente dependente de uma acção celular. Décadas de investigação em células em cultura revelaram que a fibronectina é secretada como um dímero numa conformação compacta, e a molécula é estendida através de ligações às células, expondo locais essenciais para a polimerização. A fibronectina é uma molécula de adesão por excelência, regularmente associada a fenómenos de fixação, num contexto de migração e dispersão celular. Assim como a fibronectina, outros componentes da MEC não só albergam passivamente as células, mas também desempenham um papel instrutivo na regulação do comportamento celular. A laminina, uma outra glicoproteína da MEC estudada nesta tese, é um componente essencial da membrana basal, uma MEC especializada, crítica para a formação e manutenção de tecidos epiteliais. As células obtêm a informação sobre a MEC circundante através de receptores transmembranares denominados integrinas. Estes receptores heterodiméricos são transductores de sinais importantíssimos, que, embora não sejam transmissores de sinais per se, interagem com inúmeras moléculas de variadas vias sinalizadoras. As integrinas servem também como o elo de ligação físico entre o cito-esqueleto das células e a MEC, participando assim não só na avaliação bioquímica da MEC, como também das suas propriedades mecânicas. A interacção célula-MEC na regulação do comportamento celular tem sido alvo de investigação particularmente em células em cultura e num contexto patológico, sendo que o seu papel no desenvolvimento embrionário ainda não mereceu a devida atenção. Embora a deleção de vários genes para componentes da MEC tenham demonstrado claramente o seu papel fundamental nos estádios iniciais de desenvolvimento, os pormenores do papel da respectiva MEC em fenómenos mais particulares carecem de explicação. Notoriamente, a deleção do gene que codifica a fibronectina resulta numa letalidade embrionária precoce, e na completa ausência de sómitos embora a mesoderme paraxial seja formada normalmente, um fenótipo singular de entre as inúmeras deleções genéticas afectando a somitogénese. No entanto, e apesar de a fibronectina ter sido implicada na somitogénese noutros vertebrados-modelo, pouco se sabe do papel da matriz de fibronectina neste evento morfogenético. Numa primeira fase, esta tese pretendeu resolver uma série de observações respeitantes à capacidade da MPS de formar sómitos na presença ou ausência de tecidos circundantes, nomeadamente, a ectoderme, colocada dorsalmente à mesoderme paraxial. No capítulo 2 desta tese evidenciamos que a somitogénese ocorria em MPS isoladas de todos os tecidos circundantes, ao contrário das numerosas observações anteriores, mas apenas se a matriz de fibronectina original for mantida. Neste capítulo demonstramos que a ectoderme serve a formação de sómitos como um parceiro na formação da matriz de fibronectina e não como uma fonte de factores parácrinos. Em combinação com o capítulo 4, esta tese revela que a ectoderme é uma importante fonte de produção de fibronectina, e que conformações globulares de fibronectina estão localizadas no seu lado basal. Este capítulo 2 não só clarifica a função da ectoderme, indicando como certas idiossincrasias metodológicas resultaram nas observações anteriores, como também reforça a noção da autonomia do programa genético na MPS mais rostral. Dado a complexidade de um tecido embrionário que se estende em todas as direccões, no capítulo seguinte investigamos o fenómeno da formação da fenda intersomitica de um ponto de vista tridimensional. Aprimorando a visualização in vivo e em “time-lapse” da somitogénese, constatámos a complexidade dos movimentos celulares envolvidos na formação da fenda e no rearranjo de um novo sómito. Neste capítulo 3 foi dado um enorme passo na compreensão da somitogénese numa perspectiva tri-dimensional de primeira linha. Esta nova perspectiva e a respectiva melhoria tecnológica e metodológica derivados deste trabalho possibilitaram e levaram a uma avaliação detalhada da ECM explanada no capítulo seguinte. No capítulo 4, foi feito um extenso mapeamento da MEC ao longo do eixo caudal-rostral da mesoderme paraxial. Esta abordagem não só acompanhou as alterações da matriz de fibronectina e laminina durante o desenvolvimento deste tecido, como também evidenciou pela primeira vez, os passos iniciais na formação in vivo e em 3D destas matrizes. Uma vez que na sua extremidade caudal, a MPS mesenquimatosa é o resultado directo da gastrulação, onde a MEC original é degradada, o eixo caudal-rostral reflecte a formação de novo da matriz de fibronectina e laminina. Ao longo da mesoderme paraxial, a fibronectina torna-se crescentemente mais densa e fibrilar, mas após a formação do sómito a laminina passa a ocupar o espaço junto das células e a matriz de fibronectina fica claramente exterior à membrana basal. Neste capítulo reforçamos a importância de uma matriz densa e fibrilar de fibronectina durante a formação do sómito epitelial, tal como demonstrado no capítulo 2, mas não da laminina, quase ausente. Adicionalmente, o acompanhamento da matriz de laminina revelou que a sua montagem ocorre de um modo fragmentado e disperso. Inesperadamente, observámos que os fragmentos de laminina crescem e coalescem, mas sem nunca formarem uma membrana basal contínua rodeando o sómito epitelial ou o seu derivado epitelial, o dermomiótomo. No capítulo experimental final (capítulo 5) investigamos o papel da tensão celular na somitogénese, assumindo o princípio provável que a MEC rodeando a mesoderme paraxial serve como um suporte físico para as células da MPS e dos sómitos. Neste capítulo foram utilizados inibidores de tensão celular, prevenindo a capacidade das células não só de usarem mecanicamente a MEC, como de percepcionar as características mecânicas da MEC. Este trabalho revelou que o carácter epitelial dos sómitos normalmente surge imediatamente após o seu descolamento da MPS rostral, reforçando a integridade do segmento. Na presença de inibidores da tensão celular, o carácter epitelial em aquisição é perdido, mas os sómitos epiteliais mantêm pelo menos parcialmente a sua forma, demonstrando alguma robustez. A presença de inibidores de tensão, em particular, inibidores de vias próximas da sinalização mediada por integrinas, alteraram também o programa genético na MPS, revelando uma possível regulação mecanosensitiva da resposta aos gradientes subjacentes à determinação da MPS rostral. Em conjunto, esta tese evidenciou que a contínua montagem de uma matriz de fibronectina, numa conjugação de esforços pela ectoderme e pela MPS, acompanha o desenvolvimento da mesoderme paraxial, levando ao estabelecimento de uma matriz madura, capaz de suportar a formação de sómitos e de manter os segmentos separados. Mostramos também que a complexa orquestração dos movimentos celulares durante a somitogénese requer um sinal polarizador da fibronectina (provavelmente com um valor mecânico), efectuador da epitelização do sómito e no processo separador da fenda intersomítica. São lançadas também hipóteses de como a matriz de fibronectina se integra noutros mecanismos durante a formação da fenda, e na regulação tenso- mecânica da integração dos gradientes que definem espacialmente a MPS determinada mais rostral.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/37423/207, projectos PPCDT/BIA-BCM/59201/2004, PTDC/SAU-OBD/103771/2008) e European Union FP6 Network of Excellence ‘Cells into Organs’ (2004-2009