A View of Platelets in Dengue

Platelets were mainly associated with coagulation and hemostasis; however, other biological effects have been attributed to platelets, including angiogenesis, extracellular matrix synthesis, inflammation, and immune response. Dengue virus infection causes 200 million cases of severe flu-like illness annually, escalating to life-threatening hemorrhagic fever or shock syndrome. Some hypotheses are postulated for immunopathogenesis of dengue, including antibody enhancement theory, T-cell activation of cross-reactive memory, and original antigenic sin. All hypotheses, to some extent, induce an overproduction or a skewed profile of cytokine release, giving rise to the term cytokine storm/cytokine tsunami. Although thrombocytopenia is typical of both mild and severe diseases, the mechanism triggering platelet reduction is incompletely understood. In dengue, platelets are one of the major cell populations affected by direct and/or indirect mechanisms of infection. It is common to observe both thrombocytopenia and platelet dysfunction in dengue, both strongly related to the clinical outcome. Thus, platelets are frequently affected in dengue, either for alteration of their own functionality, for “silent transport” of virus, or as an anti-viral immune cell. In this way, we describe some of functional aspects of platelets on dengue, observing circulating mediators, intraplatelet proteins contents, morphology, activation markers, and ability to interact with dengue virus

Selection-based design of in silico dengue epitope ensemble vaccines

Dengue virus affects approximately 130 countries. 25% of infections result in febrile, self‐limiting illness; heterotypic infection results in potentially fatal Dengue Haemorrhagic Fever or Dengue Shock Syndrome. Only one vaccine is currently available. Its efficacy is very variable. Thus, to target Dengue, we used an innovative immunoinformatic protocol to design a putative epitope ensemble vaccine by selecting an optimal set of highly‐conserved epitopes with experimentally‐verified immunogenicity. From 1597 CD4+ and MHC II epitopes, 6 MHC Class I epitopes (RAVHADMGYW, GPWHLGKLEM, GLYGNGVVTK, NMIIMDEAHF, KTWAYHGSY, WAYHGSYEV) and 9 MHC Class II epitopes (LAKAIFKLTYQNKVV, GKIVGLYGNGVVTTS, AAIFMTATPPGSVEA, AAIFMTATPPGTADA, GKTVWFVPSIKAGND, KFWNTTIAVSMANIF, RAIWYMWLGARYLEF, VGTYGLNTFTNMEVQ, WTLMYFHRRDLRLAA) were selected; this candidate vaccine achieved a world population coverage of 92.49%

In silico Strategies to Support Fragment-to-Lead Optimization in Drug Discovery.

Fragment-based drug (or lead) discovery (FBDD or FBLD) has developed in the last two decades to become a successful key technology in the pharmaceutical industry for early stage drug discovery and development. The FBDD strategy consists of screening low molecular weight compounds against macromolecular targets (usually proteins) of clinical relevance. These small molecular fragments can bind at one or more sites on the target and act as starting points for the development of lead compounds. In developing the fragments attractive features that can translate into compounds with favorable physical, pharmacokinetics and toxicity (ADMET-absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity) properties can be integrated. Structure-enabled fragment screening campaigns use a combination of screening by a range of biophysical techniques, such as differential scanning fluorimetry, surface plasmon resonance, and thermophoresis, followed by structural characterization of fragment binding using NMR or X-ray crystallography. Structural characterization is also used in subsequent analysis for growing fragments of selected screening hits. The latest iteration of the FBDD workflow employs a high-throughput methodology of massively parallel screening by X-ray crystallography of individually soaked fragments. In this review we will outline the FBDD strategies and explore a variety of in silico approaches to support the follow-up fragment-to-lead optimization of either: growing, linking, and merging. These fragment expansion strategies include hot spot analysis, druggability prediction, SAR (structure-activity relationships) by catalog methods, application of machine learning/deep learning models for virtual screening and several de novo design methods for proposing synthesizable new compounds. Finally, we will highlight recent case studies in fragment-based drug discovery where in silico methods have successfully contributed to the development of lead compounds

Discovery and mechanism of action study of anti-viral compounds for Dengue virus

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Antigenic diversity of dengue virus: implications for vaccine design

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Factors affecting the ZIKV life cycle

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus, isto é, é um vírus transmitido por artrópodes, sendo o seu principal vetor de transmissão o mosquito do género Aedes. ZIKV teve a sua origem na Floresta Zika, na República de Uganda, tendo sido isolado, em 1947, do sangue de um macaco rhesus. Em 1954, foram relatados, na Nigéria, os primeiros casos de humanos infetados com o vírus e, nos 57 anos seguintes, apenas 13 casos foram reportados. O primeiro grande surto surgiu, em 2007, no estado de Yap (Estados federados da Micronésia), atingindo a Polinésia Francesa e o Brasil no ano de 2013 e 2015, respetivamente. O facto do vírus também ser transmitido sexualmente e por transfusões sanguíneas pode promover a sua rápida dissiminação, conduzindo a uma potencial pandemia. Atualmente, a presença do ZIKV já foi documentada na maior parte dos países europeus e nos Estados Unidos da América, mas a sua maior incidência tem lugar em África, América central e do sul, bem como no Pacífico. Somente cerca de 20% das pessoas infetadas com o vírus apresenta manifestações clínicas, sendo que os principais sintomas são febre ligeira, erupções cutâneas, dores de cabeça, dores nas articulações e conjuntivite. Porém, complicações neurológicas como síndrome de Guillain-Barré (GBS) e, em recém nascidos, microcefalia têm sido associadas ao ZIKV. A sua rápida expansão e o aumento de casos de microcefalia levaram a Organização Mundial de Saúde (do inglês: World Heath Organization), em fevereiro de 2016, a declarar a infeção pelo ZIKV um estado de emergência pública. Semelhante a outros flavivírus, o ZIKV é constituído por uma nucleocápside viral composta pela proteína C associada a um genoma de RNA de cadeia simples e polaridade positiva. Esta cápside encontra-se rodeada por uma bicamada lipídica, na qual se encontram ancoradas as proteínas E e M, formando o envelope. O ciclo de vida destes flavivírus começa pela internalização das partículas virais na célula hospedeira, através de endocitose-mediada por recetores. O meio acídico dos endossomas favorece a ocorrência de alterações conformacionais e, consequentemente, na libertação do genoma viral para o citoplasma, onde é traduzido numa poliproteína. Esta poliproteína é, então, processada por enzimas virais e celulares em proteínas estruturais e não estruturais. Enquanto que as proteínas estruturais integram novas partículas virais, as não estruturais participam na replicação viral e na clivagem proteolítica da poliproteína. O ZIKV induz reorganizações do retículo endoplasmático (RE), de modo a formar os locais de replicação. Perto destes locais, as novas partículas virais são montadas e conduzidas para a via secretora, onde, na rede trans-Golgi (do inglês: trans-Golgi network), sofrem maturação e, portanto, tornam-se infeciosas. Depois das partículas virais serem maturadas, estas saem da célula por exocitose. Macroautofagia, mais conhecida por autofagia, é um processo catabólico conservado em células eucarióticas. Este processo celular é responsável pela degradação de proteínas citoplasmáticas e organelos envelhecidos ou em excesso. Deste modo, este sistema é extremamente importante para a manutenção da homeostasia e sobrevivência das células. Sendo um processo altamente regulado, tem capacidade de combater infeções virais através da sua degradação direta nos lisossomas ou estimulando respostas imunes. A relação entre vírus e autofagia ainda não está compreendida na sua totalidade. Curiosamente, vários estudos provaram que os flavivírus aumentam a atividade desta via para seu próprio benefício, promovendo diferentes passos do seu ciclo de vida. Recentemente, partículas do ZIKV foram encontradas em vesículas semelhantes a autofagossomas, associados ao RE. No entanto, a importância desta via para os diversos passos do ciclo de vida do ZIKV está ainda pouco estudada. Desta forma, pretendeu-se investigar a relevância de certos fatores, tais como, a acidificação de compartimentos endossomais-lisossomais, o tráfego de colesterol intracelular e a autofagia, para o ciclo de vida deste vírus. Neste estudo, células epiteliais provenientes de adenocarcinoma de pulmão humano (A549) foram infetadas com duas estirpes do ZIKV isoladas na Polinésia Francesa e na República de Uganda. De modo a compreender como é que a acidificação do lúmen dos endossomas e lisossomas afeta o ciclo de vida do vírus, células infetadas com as estirpes do ZIKV foram tratadas com Bafilomicina A1 (BFLA). Nesta parte do trabalho, tratamento pré-infeção (do inglês: pre-infection) e pós-infeção ( do inglês: post-infection) foram usados com o intuito de perceber como é que este composto interfere com a entrada do vírus nas células hospedeiras e com o desenrolar da infeção, respetivamente. No tratamento pré-infeção, as células foram em primeiro lugar tratadas e, duas horas mais tarde, infetadas com o vírus. Por outro lado, o tratamento pós-infeção, tal como o nome indica, consiste no tratamento das células duas horas após terem sido infetadas. BFLA é um inibidor da bomba de protões V-ATPase, impedindo a acidificação de organelos como, por exemplo, os endossomas e os lisossomas. O tratamento préinfeção impediu a entrada de ambas as estirpes do ZIKV, enquanto que, o tratamento pós-infeção conduziu à diminuição da infeção viral ao longo do tempo. Assim sendo, é possível inferir que a BFLA dificulta a endocitose-mediada por recetores e, quando a infeção já está estabelecida, a acidificação do lúmen dos endossomas e lisossomas é fulcral, tanto no início como no fim do ciclo de vida do ZIKV. Na segunda parte deste trabalho, tentou-se perceber a importância do tráfego de colesterol intracelular para a infeção do vírus. Para tal, células infetadas foram tratadas pré- e pós-infeção com U18666A (U18). U18 bloqueia o tráfego de colesterol intracelular como consequência da sua acumulação em endossomas tardios (do inglês: late endosomes) e lisossomas. Ambas as estirpes revelaram um decréscimo da infeção viral consoante o tempo e bastante semelhante entre os dois tipos de tratamentos aplicados. Contudo, os resultados não permitiram retirar conclusões acerca do passo do ciclo de vida afetado por este inibidor. Por fim, de modo a compreender a influência direta da autofagia para o ciclo de vida do ZIKV, Rapamicina (RAPA) e 3-Metiladenina (3-MA) foram utilizados para tratar células infetadas. Neste caso, apenas tratamento pós-infeção foi necessário, uma vez que estes moduladores não interferem com processos relacionados com a entrada viral. A RAPA é um ativador da autofagia, enquanto que a 3-MA previne a sua iniciação. O seu efeito parece refletir-se, maioritariamente, no aumento do nível da replicação. Tal como sugerido por Liang et al., 2016, o ZIKV aparenta necessitar da via autofágica da célula hospedeira para criar estruturas membranares para os locais de replicação. Em suma, este trabalho permitiu aprofundar a relação entre a autofagia e o ZIKV, podendo contribuir para posteriores estudos a realizar, não só com o ZIKV, mas também com outros flavivírus. Como se veio a demonstrar, a acidificação de compartimentos endosomais-lisosomais é de extrema importância para a entrada viral e para o estabelecimento da infeção. Ficou, igualmente, demonstrado que o tráfego de colesterol intracelular é requerido para poder haver uma eficiente infeção. Porém, estudos adicionais devem ser realizados para clarificar qual ou quais os passos do ciclo de vida é que são afetados. Os resultados obtidos sugerem que a atividade autofágica seja aumentada em células infetadas com o intuito de promover a replicação do ZIKV. Devido à falta de uma vacina ou de compostos específicos com atividade antiviral contra o ZIKV, aliados ao aumento de casos de GBS e microcefalia, esforços devem ser feitos na medida de melhor compreender o ciclo de vida deste flavivírus, bem como, a sua patogenicidade.The Zika virus (ZIKV) infection has spread widely, mainly in Africa, South and Central America, and South Pacific. This mosquito-borne virus had its first appearance on a rhesus monkey in the Zika forest of Uganda, in 1947. Like other flaviviruses, the ZIKV has a single-stranded positive RNA genome that encodes a polyprotein, which is processed by viral and host proteases. In the context with the epidemic in the South America, a clear correlation between the infection of pregnant women and the development of microcephaly in fetuses was observed. Thus, understanding the life cycle of the virus and discovering ways to reduce or even eradicate the infection of ZIKV has become urgent. Autophagy, as an essential process for the cellular homeostasis and survival, is responsible for the lysosomal degradation of damaged or unwanted cytoplasmic proteins and organelles. The relationship between virus and autophagy is not yet fully understood. Several reports suggest that flaviviruses lead to an increase of autophagic activity to promote different stages of the viral life cycle. The same holds true for ZIKV, as it was shown in infected fibroblasts. However, the relevance of this pathway for the numerous steps of the ZIKV life cycle is poorly studied. To investigate the relevance of autophagy, ZIKV-infected cells were treated with various chemical compounds. In this study, Bafilomycin A1, a V-ATPase inhibitor, was capable to diminish viral infection effectively. Moreover, the intracellular cholesterol transport inhibitor, U18666A, was shown to reduce the spreading of infection. 3-Methyladenine, an early autophagy inhibitor, contributed to a decrease of viral replication, whereas Rapamycin, an autophagy inducer, promoted it. This work provided new insights into the relationship between autophagy and ZIKV infection. Clearly, the acidification of endosomal-lysosomal compartments is extremely important for the entry process and for the establishment of infection. As for the importance of intracellular cholesterol trafficking, further experiments need to be performed to clarify which stages of the ZIKV life cycle are affected. These data suggest that the main influence of autophagy lies in the augmentation of viral replication

Virus-like particle secretion and genotype-dependent immunogenicity of dengue virus serotype 2 DNA vaccine

Dengue virus (DENV), composed of four distinct serotypes, is the most important and rapidly emerging arthropod-borne pathogen and imposes substantial economic and public health burdens. We constructed candidate vaccines containing the DNA of five of the genotypes of dengue virus serotype 2 (DENV-2) and evaluated the immunogenicity, the neutralizing (Nt) activity of the elicited antibodies, and the protective efficacy elicited in mice immunized with the vaccine candidates. We observed a significant correlation between the level of in vitro virus-like particle secretion, the elicited antibody response, and the protective efficacy of the vaccines containing the DNA of the different DENV genotypes in immunized mice. However, higher total IgG antibody levels did not always translate into higher Nt antibodies against homologous and heterologous viruses. We also found that, in contrast to previous reports, more than 50% of total IgG targeted ectodomain III (EDIII) of the E protein, and a substantial fraction of this population was interdomain highly neutralizing flavivirus subgroup-cross-reactive antibodies, such as monoclonal antibody 1B7-5. In addition, the lack of a critical epitope(s) in the Sylvatic genotype virus recognized by interdomain antibodies could be the major cause of the poor protection of mice vaccinated with the Asian 1 genotype vaccine (pVD2-Asian 1) from lethal challenge with virus of the Sylvatic genotype. In conclusion, although the pVD2-Asian 1 vaccine was immunogenic, elicited sufficient titers of Nt antibodies against all DENV-2 genotypes, and provided 100% protection against challenge with virus of the homologous Asian 1 genotype and virus of the heterologous Cosmopolitan genotype, it is critical to monitor the potential emergence of Sylvatic genotype viruses, since vaccine candidates under development may not protect vaccinated humans from these viruses

Aggregation of biological knowledge for immunological and virological applications

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The biogenesis of multispanning membrane proteins at the Sec61-translocon and their integration into the lipid bilayer of the endoplasmic reticulum

The key entry point of most membrane proteins into the lipid bilayer is the Sec61/SecYEG translocon, that mediates the transfer of hydrophilic sequences across the membrane and integration of mostly apolar a-helical transmembrane domains into the lipid bilayer. Three distinct integrations steps can be distinguished: (1) a first hydrophobic signal sequence targets the protein to the translocon, integrates itself into the membrane, and initiates translocation of the downstream polypeptide. (2) A subsequent hydrophobic segment laterally exits the translocon into the bilayer and thus stops further transfer. (3) The next hydrophobic sequence triggers re-integration into the translocon, re-initiating polypeptide transfer. Successive stop-transfer and reintegration sequences result in complex multispanning proteins. The major determinant of membrane topology appears to be the hydrophobicity of transmembrane domains. This has been best demonstrated for potential stop-transfer segments, suggesting a sequence-autonomous thermodynamic equilibration between the hydrophilic environment of the translocon and the apolar lipid phase.In this thesis, we analyzed in detail the hydrophobicity threshold for a potential re-integration TM domain downstream of different cytoplasmic loop sequences. Surprisingly, we discovered a strong dependence on the length of this cytoplasmic sequence. Short sequences are facilitating re-integration, while long ones seem to impede it. This demonstrates, that re-integration is not independent from the sequence-context. Further investigations revealed that loop sequences containing isolated folding domains, intrinsically disordered sequences, or sequences with a high affinity for chaperones enhance the reintegration efficiency, whereas those with low affinity to chaperones, and fragments of natural protein domains impair re-integration. We propose that the latter sequences, as they collapse to molten globules – i.e. near-native conformation of high compactness with already pronounced secondary structure and increased amount of hydrophobic residues on the surface area – compete with the translocon for interaction with the potential transmembrane segment. Our results thus define the environment of the nascent polypeptide chain when re-integration can occur and may serve as a guide in de novo membrane protein design. In a second part, we characterized the antiviral natural product cavinafungin as an inhibitor of signal peptidase for Dengue virus as well as host substrates, inhibiting biogenesis of viral proteins from a single precursor membrane polyprotein