Estimation and model selection for dynamic biomedical images

Compartment models are a frequently used tool for imaging data gained with medical and biological imaging techniques. The solutions of the differential equations derived from a compartment model provide nonlinear parametric functions, based on which the behavior of a concentration of interest over time can be described. Often, the number of compartments in a compartment model is unknown. As the model complexity itself, which is, the number of compartments, is certainly an important information, it is desirable to estimate it from the observed data. Additionally, the unknown parameters have to be estimated. Therefore, methods dealing with both the parameter estimation and model selection in compartment models are needed. The methods proposed in this thesis are motivated by two applications from the field of medical and biological imaging. In the first application, the quantitative analysis of Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) data, compartment models are used in order to gain insight into the binding behavior of molecules in living cells. As a first approach, we developed a Bayesian nonlinear mixed-effects model for the analysis of a series of FRAP images. Mixed-effect priors are defined on the parameters of the nonlinear model, which is a novel approach. With the proposed model, we get parameter estimates and additionally gain information about the variability between nuclei, which has not been studied so far. The proposed method was evaluated on half-nucleus FRAP data, also in comparison with different kinds of fixed-effects models. As a second approach, a pixelwise analysis of FRAP data is proposed, where information from the neighboring pixels is included into the nonlinear model for each pixel. This is innovative as the existing models are suitable for the analysis of FRAP data for some regions of interest only. For the second application, the quantitative analysis of dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) of the breast, we use a compartment model which describes the exchange of blood between different, well-mixed compartments. In the analysis of such data, the number of compartments allows conclusions about the heterogeneity of cancerous tissue. Therefore, an estimation and model selection approach based on boosting, with which the number of compartments and the unknown parameters can be estimated at the voxel level, is proposed. In contrast to boosting for additive regression, where smoothing approaches are used, boosting in nonlinear parametric regression as described in this thesis is a novel approach. In an extension of this approach, the spatial structure of an image is taken into account by penalizing the differences in the parameter estimates of neighboring voxels. The evaluation of the method was done in simulation studies, as well as in the application to data from a breast cancer study. The majority of the program code used in the three approaches was newly developed in the programming languages R and C. Based on that code, two R packages were built

Regularized estimation and model selection in compartment models

Dynamic imaging series acquired in medical and biological research are often analyzed with the help of compartment models. Compartment models provide a parametric, nonlinear function of interpretable, kinetic parameters describing how some concentration of interest evolves over time. Aiming to estimate the kinetic parameters, this leads to a nonlinear regression problem. In many applications, the number of compartments needed in the model is not known from biological considerations but should be inferred from the data along with the kinetic parameters. As data from medical and biological experiments are often available in the form of images, the spatial data structure of the images has to be taken into account. This thesis addresses the problem of parameter estimation and model selection in compartment models. Besides a penalized maximum likelihood based approach, several Bayesian approaches-including a hierarchical model with Gaussian Markov random field priors and a model state approach with flexible model dimension-are proposed and evaluated to accomplish this task. Existing methods are extended for parameter estimation and model selection in more complex compartment models. However, in nonlinear regression and, in particular, for more complex compartment models, redundancy issues may arise. This thesis analyzes difficulties arising due to redundancy issues and proposes several approaches to alleviate those redundancy issues by regularizing the parameter space. The potential of the proposed estimation and model selection approaches is evaluated in simulation studies as well as for two in vivo imaging applications: a dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) study on breast cancer and a study on the binding behavior of molecules in living cell nuclei observed in a fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiment

Optimal Multi-Drug Chemotherapy Control Scheme for Cancer Treatment. Design and development of a multi-drug feedback control scheme for optimal chemotherapy treatment for cancer. Evolutionary multi-objective optimisation algorithms were used to achieve the optimal parameters of the controller for effective treatment of cancer with minimum side effects.

Cancer is a generic term for a large group of diseases where cells of the body lose their normal mechanisms for growth so that they grow in an uncontrolled way. One of the most common treatments of cancer is chemotherapy that aims to kill abnormal proliferating cells; however normal cells and other organs of the patients are also adversely affected. In practice, it¿s often difficult to maintain optimum chemotherapy doses that can maximise the abnormal cell killing as well as reducing side effects. The most chemotherapy drugs used in cancer treatment are toxic agents and usually have narrow therapeutic indices, dose levels in which these drugs significantly kill the cancerous cells are close to the levels which sometime cause harmful toxic side effects. To make the chemotherapeutic treatment effective, optimum drug scheduling is required to balance between the beneficial and toxic side effects of the cancer drugs. Conventional clinical methods very often fail to find drug doses that balance between these two due to their inherent conflicting nature. In this investigation, mathematical models for cancer chemotherapy are used to predict the number of tumour cells and control the tumour growth during treatment. A feedback control method is used so as to maintain certain level of drug concentrations at the tumour sites. Multi-objective Genetic Algorithm (MOGA) is then employed to find suitable solutions where drug resistances and drug concentrations are incorporated with cancer cell killing and toxic effects as design objectives. Several constraints and specific goal values were set for different design objectives in the optimisation process and a wide range of acceptable solutions were obtained trading off among different conflicting objectives. Abstract v In order to develop a multi-objective optimal control model, this study used proportional, integral and derivative (PID) and I-PD (modified PID with Integrator used as series) controllers based on Martin¿s growth model for optimum drug concentration to treat cancer. To the best of our knowledge, this is the first PID/I-PD based optimal chemotherapy control model used to investigate the cancer treatment. It has been observed that some solutions can reduce the cancer cells up to nearly 100% with much lower side effects and drug resistance during the whole period of treatment. The proposed strategy has been extended for more drugs and more design constraints and objectives.Libyan Ministry of Higher Educatio

Model-Oriented Data Analysis; Proceedings of the 3rd International Workshop in Petrodvorets, Russia, May 25-30 1992

This volume contains the majority of papers presented at the Third Model-Oriented Data Analysis Workshop/Conference (MODA3) in Petrodvorets, Russia on 25-30 May 1992. As with the previous two workshops in 1987 and 1990, the conference covers theoretical and applied statistics with a heavy emphasis on experimental design. Under these broad headings other specialised topics can be mentioned, particularly quality improvements and optimization. This proceedings volume consists of three main parts: I. Optimal Design, II. Statistical Applications, III. Stochastic Optimization. A constant theme at MODA conferences is the subject of optimal experimental design. This was well represented at MODA3 and readers will find important contributions. In recent years the model investigated under this heading have become progressively more complex and adaptive

Cluster analysis of the signal curves in perfusion DCE-MRI datasets

Pathological studies show that tumors consist of different sub-regions with more homogeneous vascular properties during their growth. In addition, destroying tumor's blood supply is the target of most cancer therapies. Finding the sub-regions in the tissue of interest with similar perfusion patterns provides us with valuable information about tissue structure and angiogenesis. This information on cancer therapy, for example, can be used in monitoring the response of the cancer treatment to the drug. Cluster analysis of perfusion curves assays to find sub-regions with a similar perfusion pattern. The present work focuses on the cluster analysis of perfusion curves, measured by dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI). The study, besides searching for the proper clustering method, follows two other major topics, the choice of an appropriate similarity measure, and determining the number of clusters. These three subjects are connected to each other in such a way that success in one direction will help solving the other problems. This work introduces a new similarity measure, parallelism measure (PM), for comparing the parallelism in the washout phase of the signal curves. Most of the previous works used the Euclidean distance as the measure of dissimilarity. However, the Euclidean distance does not take the patterns of the signal curves into account and therefore for comparing the signal curves is not sufficient. To combine the advantages of both measures a two-steps clustering is developed. The two-steps clustering uses two different similarity measures, the introduced PM measure and Euclidean distance in two consecutive steps. The results of two-steps clustering are compared with the results of other clustering methods. The two-steps clustering besides good performance has some other advantages. The granularity and the number of clusters are controlled by thresholds defined by considering the noise in signal curves. The method is easy to implement and is robust against noise. The focus of the work is mainly the cluster analysis of breast tumors in DCE-MRI datasets. The possibility to adopt the method for liver datasets is studied as well

Antiarrhythmic and Proarrhythmic Potential of Pharmacological Agents

Antiarrhythmic therapy in general has a problem ‘especially in the treatment of ventricular arrhythmias’ that the compounds have proarrhythmic potential which is due to the same cellular mechanism that is responsible for their antiarrhythmic properties. Drug-induced arrhythmia can be attributed to either excessive conduction slowing (e.g. with class Ia or Ic Na+ channel blockers) or excessive prolongation of ventricular action potential duration (APD) (e.g. with class III antiarrhythmic agents), or both. The aim of the presents study was to investigate the antiarrhythmic and proarrhythmic potential of some pharmacological agents. We therefore thoroughly investigated and compared the kinetics of these Na+ channel blockers to provide further experimental data and to differentiate between their antiarrhythmic and proarrhythmic properties. In the present study, conventional microelectrode and patch clamp techniques were used to measure the action potential (AP) parameters and the transmembrane ionic currents underlying the AP, respectively. The results show that GS967 inhibits INaP similarly to the class Ib antiarrhythmic drug mexiletine, but with higher potency and three fold faster offset kinetics. Both GS967 and mexiletine significantly depressed V+max at high stimulation rates. Flecainide lengthened APD only at faster stimulation frequencies having cycle length (CL) shorter than 500 ms and increased the APDs of early extrasystoles noticeably. Moreover, flecainide reduced V+max in the entire frequency range exhibiting much slower offset kinetics than mexiletine. Similarly, quinidine depressed V+max use-dependently showing slower offset kinetics than mexiletine. Although, quinidine slowed the restitution kinetics of APD, however, it exhibited a reverse rate-dependent prolongation on APD90. In addition, acute desethylamiodarone (DEA) administration exerted a mild but not reverse rate-dependent APD90 prolongation and significant V+max inhibition at short CLs. Furthermore, cannabidiol lengthened APD90 significantly at the concentration of 5 µM without changing any other AP parameter significantly. These findings suggest that the frequency dependence, restitution kinetics and onset kinetics are important electrophysiological determinants which can discriminate Na+ channel blockers with proarrhythmic and antiarrhythmic potential. Moreover, the current data suggest that compounds which do not block impulse conduction at normal heart rate and have a fast recovery such as mexiletine and GS967, can be promising for future drug development. Also the interesting big APD lengthening effect on the early extrasystole observed with flecainide would be probably useful but the effect on sodium current at normal heart rate can be potentially proarrhythmic. Furthermore, the absence of an increase in dispersion of ventricular repolarization with DEA correlates with its clinically observed lower incidence of proarrhythmia. In addition, the physicians should be aware in recognizing of the deleterious effects of compounds that affect the repolarization reserve in co-morbid or polypharmacy patient

Exploring the chromenopyrazole scaffold for the modulation of the endocannabinoid system

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Química Orgánica. Fecha de lectura: 18-12-2015In the last decades, the endocannabinoid system (ECS) has emerged as a promising therapeutic target. The identification of the cannabinoid receptors CB1R and CB2R and their endogenous lipid ligands has triggered an exponential growth of studies exploring the role of the ECS in physiological and pathological processes. The potential of cannabinoids has been preclinically explored in the treatment of a wide variety of diseases such as cancer, bone-related disorders, neurodegenerative diseases, or metabolic syndromes among others. So far, however, the clinical use of synthetic and phyto-cannabinoids has been limited to pain, emesis and appetite due to their undesirable psychoactive properties. Thus, emerging strategies for exploiting cannabinoids as medicines need to be developed to overcome these side-effects. The dissertation focusses on three of these strategies: a) selective CB2R ligands; b) multitarget cannabinoids for cancer therapy; c) compounds acting on a new additional therapeutic target of the ECS. In this context, we propose to explore the chromenopyrazole scaffold for the development of novel modulators of the ECS. a) Structural modifications of the chromenopyrazole scaffold led to the synthesis of new cannabinoids allowing fine-tuning of cannabinoid receptor affinity and activity. Structural features required for CB1R/CB2R affinity and selectivity were studied by molecular modeling. In addition, bivalent chromenopyrazoles were prepared in order to explore the CB2R dimerization process. b) Multifunctional chromenopyrazoles have been designed and synthesized for cancer therapy. This approach involved the antitumor properties of cannabinoids and the redox properties characterizing quinones. The antiproliferative activity of these new compounds was successfully explored in vitro and in vivo in breast and prostate cancer models. c) Finally, the chromenopyrazole scaffold as modulator of the new target GPR55 has been explored. The design of two series of compounds followed by their synthesis was reported. Their ability to activate GPR55 was measured through an innovative label-free cell impedance assay allowing the discovery of novel GPR55 partial agonists and antagonists. To sum up, exploration of the chromenopyrazole as a versatile scaffold led to the identification of CB2R selective ligands and bivalent ligands, multifunctional antitumor agents, and GPR55 modulators. These compounds represent promising pharmacological tools and drugs for further developmentEl sistema endocannabinoide ha mostrado tener gran relevancia en la regulación de numerosos procesos fisiológicos y patológicos. Hasta el momento se han identificado dos tipos de receptores cannabinoides: tipo 1 (CB1), predominantes en el sistema nervioso central, y tipo 2 (CB2), ubicados principalmente en el sistema inmune entre otros órganos y tejidos. Asimismo, se han identificado los ligandos endógenos de estos receptores y las enzimas implicadas en su síntesis, recaptación y degradación. Otros receptores acoplados a proteínas G, como GPR55, también se han propuesto como posibles miembros del sistema endocannabinoide. Sin embargo, esta categorización aún no ha sido confirmada debido a la falta de herramientas farmacológicas que permitan caracterizar apropiadamente las funciones biológicas de GPR55. El potencial terapéutico de los ligandos cannabinoides ha sido evaluado a nivel preclínico para el tratamiento de numerosas enfermedades y síntomas como el dolor, la inflamación, el cáncer y la hipertensión, así como patologías metabólicas y neurodegenerativas. El problema fundamental asociado al tratamiento con cannabinoides radica en la imposibilidad actual de separar los efectos terapéuticos de la acción psicoactiva. Hoy en día, los únicos cannabinoides utilizados en la clínica son el tetrahidrocannabinol, su análogo sintético nabilona y el cannabidiol; se emplean para el tratamiento del dolor, la emesis y la mejora del apetito. Estos compuestos actúan sobre ambos receptores CB1 y CB2 provocando efectos psicoactivos asociados a la modulación del receptor CB1 en el cerebro. Por tanto, es de gran interés la identificación de nuevos cannabinoides sintéticos con efectos secundarios reducidos. En este contexto, nos propusimos explorar el potencial del esqueleto de cromenopirazol (figura 1) en el desarrollo de nuevas moléculas capaces de modular el sistema endocannabinoide. Para ello, este proyecto se ha estructurado en tres capítulos atendiendo a criterios químicos y farmacológico

Development and application of (bio)analytical methodologies in capillary electrophoresis. Enantioselectivity considerations

El desarrollo de nuevos fármacos es un proceso largo, complejo y costoso que incluye la evaluación en diferentes etapas de propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la nueva molécula. En las primeras etapas del desarrollo de un fármaco es habitual el uso de métodos in vitro para el cribado de alto rendimiento de las propiedades de nuevas moléculas, con el objetivo de obtener datos preliminares sobre la potencial actividad farmacológica de una molécula y sobre su farmacocinética. Cuando se emplean moléculas quirales, tanto sus propiedades farmacocinéticas como las farmacodinámicas pueden presentar un cierto grado de enantioselectividad debido a la interacción con biomacromoléculas ópticamente activas (Brocks, 2006), por lo que los métodos aplicados en estas primeras etapas preclínicas deben permitir la evaluación de estas propiedades de una manera enantioselectiva. Esta necesidad proviene del creciente interés de la industria farmacéutica en el desarrollo de formulaciones enantioméricamente puras, y también de las normativas en torno a medicamentos racémicos, que indican que el control de calidad realizado sobre estos fármacos también debe ser enantioselectivo (Food and Drug Administration, 1992; European Medicines Agency, 1993). La electroforesis capilar (CE, del inglés capillary electrophoresis) es una técnica analítica conveniente para abordar estos estudios preclínicos. Proporciona ventajosas posibilidades para el análisis quiral de moléculas pequeñas y para la evaluación en línea de numerosos procesos farmacocinéticos y farmacodinámicos, como la unión de fármacos a las proteínas plasmáticas o su comportamiento en diferentes reacciones enzimáticas. Sus principales características, extremadamente interesantes para estas aplicaciones, son rapidez de análisis, bajo consumo de reactivos y muestras, facilidad de automatización, elevadas eficacias de pico y bajo impacto medioambiental (Lin y col., 2003). El principal objetivo de esta Tesis es el desarrollo y aplicación de metodologías electroforéticas para la evaluación enantioselectiva in vitro de propiedades farmacológicas de medicamentos, con el fin de proporcionar a la industria farmacéutica alternativas rápidas y fiables en las fases preclínicas del desarrollo de nuevos fármacos. Esta Tesis se divide en tres bloques principales: desarrollo de métodos y estudios teóricos para la separación quiral de xenobióticos mediante electroforesis capilar (Artículos I-IV), evaluación de la unión enantioselectiva de fármacos a las proteínas plasmáticas (Artículos V-VII) y estudio de reacciones enzimáticas empleando microanálisis mediante electroforesis (EMMA, del inglés electrophoretically mediated microanalysis) (Artículos VIII-X). Los dos primeros trabajos incluidos en esta Tesis son estudios teóricos sobre la capacidad de enantioreconocimiento de la β-ciclodextrina altamente sulfatada (HS-β-CD, del inglés highly sulfated β-cyclodextrin), potente selector quiral que se ha utilizado en una gran parte de las separaciones quirales desarrolladas en esta Tesis. En el Artículo I se han estimado constantes de unión aparentes entre la HS-β-CD y los enantiómeros de ocho fármacos psicoactivos empleando cromatografía electrocinética y la técnica del llenado completo del capilar (EKC-CFT, del inglés electrokinetic chromatography-complete filling technique). Los datos experimentales de movilidad electroforética de ambos enantiómeros se representaron frente a la concentración de ciclodextrina empleando un modelo de ajuste no lineal que permite la estimación de constantes de unión aparentes y movilidades límite. A partir de estas estimaciones se calcularon las enantioselectividades termodinámica (αt) y electroforética (αe) del proceso de separación. Los resultados mostraron que esta ciclodextrina se une fuertemente a los enantiómeros de los ocho fármacos básicos seleccionados, con elevada enantioselectividad en la mayoría de los casos. Las constantes aparentes de unión de la HS-β-CD a los fármacos estudiados son iguales o mayores que las descritas en la bibliografía para otros compuestos (Vaccher y col., 2005, Lipka y col., 2007). Ambas enantoselectividades, termodinámica (relacionada con las diferencias entre las constantes de unión aparentes de ambos enantiómeros) y electroforética (debida a las diferentes movilidades de los complejos enantiómero-ciclodextrina), resultaron ser responsables de la separación quiral con HS-β-CD, aunque con una mayor contribución de αt. Sin embargo, en uno de los casos en el que no se vio enantioselectividad termodinámica, los enantiómeros se resolvieron completamente debido únicamente a la enantioselectividad electroforética. Por otro lado, el uso de la técnica del llenado completo del capilar para la evaluación de constantes de unión se presenta en esta Tesis como una alternativa a la cromatografía electrocinética convencional con un ahorro en selector quiral en torno al 99%. El segundo Artículo incluido en esta Tesis es un estudio de relación cuantitativa estructura-actividad que modela la capacidad de enantioreconocimiento de la HS-β-CD para compuestos básicos en EKC, relacionando la resolución obtenida para cuarenta xenobióticos (fármacos y plaguicidas) con algunas de sus propiedades estructurales. Este trabajo proporciona a los investigadores en el campo de las separaciones quirales una alternativa a los procedimientos habituales de ensayo y error para el desarrollo de métodos enantioselectivos. Se llevó a cabo una regresión de mínimos cuadrados parciales discriminante sobre una variable respuesta (DPLS1, del inglés discriminant-partial least squares) empleando como vector y un valor categórico de resolución (Rs) y como matriz X las propiedades estructurales de los xenobióticos. Únicamente se seleccionaron cuatro variables estructurales como significativas en el modelo final: logaritmo del coeficiente de partición octanol-agua estimado a pH 7,4 (lgD), área superficial polar (PSA), número de dadores (HBD) y aceptores (HBA) de enlaces de hidrógeno. A partir de los coeficientes no escalados del modelo, se obtuvo una ecuación explícita que relaciona el valor categórico de Rs con las cuatro variables estructurales seleccionadas: Rs = 2,354 + 0,095lgD – 0,008PSA – 0,159HBD – 0,137HBA. El modelo seleccionado presentó una varianza explicada del 72,4%. Para aquellos xenobióticos cuya Rs predicha no es muy elevada, que puede interpretarse como posible separación quiral pero sólo en determinadas condiciones experimentales, se propuso una optimización multivariante de las tres condiciones experimentales más influyentes en la enantioseparación (concentración de ciclodextrina, pH del tampón de separación (BGE, del inglés background electrolyte) y temperatura del capilar), a través de un diseño experimental Box-Behnken y un ajuste posterior de los resultados experimentales a un modelo PLS2, que permite la estimación del tiempo de migración y la resolución para cada conjunto de condiciones experimentales. El Artículo III es una aplicación de la enantioseparación del antidepresivo fluoxetina con HS-β-CD al análisis quiral de tres formulaciones farmacéuticas. Las condiciones de separación se optimizaron para evitar una interferencia de la matriz y se obtuvo un método de separación adecuado mediante EKC-CFT que permite la cuantificación de ambos enantiómeros de fluoxetina en menos de 2 minutos con un valor de Rs de 2,4. Se llevó a cabo una validación parcial del método quiral siguiendo las indicaciones de la International Conference on Harmonization (ICH) y de la US Pharmacopeia sobre identidad, linearidad, precisión y exactitud. Se obtuvieron buenas características analíticas: coeficientes de determinación (R2) de 0,996 para las curvas de calibrado de ambos enantiómeros, desviaciones estándar relativas (RSD, del inglés relative standard deviation) inferiores al 20%, obtenidas en condiciones de precisión intermedia, y recuperaciones de 92 ± 13 y 105 ± 6 % para el primer y segundo enantiómero eluídos, respectivamente. Para todas las muestras se obtuvo un contenido en fluoxetina racémica dentro de las especificaciones de la US Pharmacopeia (20 mg ± 15%), con relaciones estereoisoméricas en torno a 1. Así pues, en esta Tesis se ha demostrado la idoneidad de la HS-β-CD para la enantioseparación de fármacos básicos, no sólo con estudios teóricos sino también con una aplicación al análisis quiral de productos farmacéuticos. En el Artículo IV se describe una aplicación de la electroforesis capilar no acuosa (NACE, del inglés non-aqueous capillary electrophoresis) a la separación quiral de fármacos, llevada a cabo durante una estancia de investigación en la Katholieke Universiteit of Leuven. Este trabajo responde al interés en desarrollar metodologías basadas en sistemas no acuosos que sean capaces de disolver y analizar nuevos principios activos que sean insolubles en medios acuosos o metanólicos. Muchos fármacos en desarrollo sugeridos por aplicación de la química combinatoria presentan baja solubilidad en agua debida a un elevado peso molecular. Si una molécula objetivo poco soluble en medios acuosos presenta buena potencia y baja toxicidad, puede resultar de interés continuar en fase de desarrollo a pesar de esta baja solubilidad y en estos casos se requieren métodos de análisis quiral para su control analítico. En este trabajo se propuso el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) como alternativa a los BGEs de naturaleza alcohólica más comúnmente empleados, debido a su baja volatilidad y toxicidad y mejores propiedades disolventes para moléculas poco polares. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la enantioseparación en DMSO se encuentra desfavorecida debido a que las fuerzas intermoleculares responsables del enantioreconocimiento son más débiles en medios orgánicos (Chankvetadze y Blaschke, 2001). Se llevó a cabo la separación quiral de tres fármacos, verapamilo, pindolol y fenfluramina, mediante NACE y empleando una optimización univariante para la selección de las mejores condiciones experimentales. Finalmente, se seleccionaron BGEs basados en DMSO y que contenían proporciones variables de metanol (0-30%), HAc 0,5-1 M, NH4Ac 125 mM y carboximetil-γ-ciclodextrina 40 mM, con una temperatura de separación de 15 ºC y un potencial aplicado de 30 kV. Empleando estas condiciones se obtuvieron valores de Rs de 1,5; 2,0 y 1,2 para verapamilo, pindolol y fenfluramina, respectivamente. La corriente fue estable durante todas las separaciones llevadas a cabo, a pesar de que uno de los principales problemas de NACE son los frecuentes cortes de corriente. Los Artículos V-VII de esta Tesis se refieren a la evaluación enantioselectiva de una importante propiedad farmacocinética al nivel de la distribución de fármacos, la unión a proteínas plasmáticas. La cantidad de un fármaco que se une a las proteínas plasmáticas, así como la fuerza de esta unión, influyen considerablemente en la disponibilidad de los fármacos para alcanzar órganos diana y también para su eliminación. Dado que las proteínas plasmáticas son moléculas ópticamente activas, los fármacos quirales pueden presentar diferencias en las propiedades de unión de sus enantiómeros a éstas. Así pues, el desarrollo de metodologías rápidas y fiables para la evaluación in vitro de la unión enantioselectiva de fármacos a las proteínas plasmáticas resulta de gran interés para la investigación en la industria farmacéutica. La proteína más abundante en el plasma humano es la albúmina (HSA, del inglés human serum albumin), que presenta un elevado grado de enantioselectividad en su unión a fármacos. En esta Tesis se ha evaluado la unión enantioselectiva de fármacos a HSA y al total de las proteínas plasmáticas mediante ultrafiltración seguida de análisis quiral mediante EKC. En la ultrafiltración se filtra una mezcla pre-equilibrada de fármaco y proteína a través de una membrana que retiene la proteína y sólo permite el paso de la fracción libre de fármaco. Esta fracción libre se analiza posteriormente, en este caso empleando EKC quiral. El Artículo V destaca algunos aspectos débiles de las metodologías experimentales y modelos matemáticos previamente publicados para el estudio de la unión a proteínas plasmáticas (Katrahalli y col., 2010; Fielding y col., 2005), y propone una estrategia novedosa para una evaluación fiable de la unión a proteínas. Se lleva a cabo una amplia discusión acerca de los diferentes modelos matemáticos de unión a proteínas, empleando como ejemplo la unión enantioselectiva del antidepresivo fluoxetina a HSA. El análisis enantioselectivo de fluoxetina se realizó empleando HS-β-CD como selector quiral en el modo de llenado completo del capilar, en un tampón fosfato 30 mM de pH 7,0. La temperatura y el potencial de separación se fijaron a 30 ºC y 15 kV respectivamente. La estrategia propuesta implica trabajar en condiciones cercanas a las fisiológicas, por tanto, manteniendo el cociente entre la concentración de fármaco (D) y la de proteína (P) por debajo de 0,5; y P cerca del nivel fisiológico (en torno a 475 μM). En estas condiciones, se puede emplear un modelo simple de unión que considera que sólo se ocupa un tipo de sitio de unión en la molécula de proteína y que la estequiometría de dicha unión es 1:1, siempre y cuando estas consideraciones se confirmen a través de otras ecuaciones. Además, los datos fueron evaluados con el fin de detectar y eliminar valores anómalos que pudieran afectar a la fiabilidad de las estimaciones. Se estimaron para ambos enantiómeros de fluoxetina constantes de unión enantiómero-proteína (K1), así como la enantioselectividad en el proceso de unión, definida como el cociente entre ambas constantes. Finalmente, se estimó para ambos enantiómeros el porcentaje de unión a proteína (PB%, del inglés protein binding), que es un parámetro interesante desde un punto de vista farmacocinético. Se obtuvieron porcentajes de 95,2 y 90,0% para el primero y segundo enantiómero eluídos, respectivamente. Se obtuvo una enantioselectividad en torno a 2 en favor del primer enantiómero eluído. Todavía en el campo de las interacciones enantioselectivas fármaco-proteína, los Artículos VI y VII estudian la unión enantioselectiva del hipnótico zopiclona y del antidepresivo nomifensina a HSA y al total de las proteínas plasmáticas, de nuevo mediante ultrafiltración y EKC quiral. En el Artículo VI, la enantioseparación de zopiclona con carboximetil-β-ciclodextrina (CM-β-CD) se ajustó para el análisis de la fracción de fármaco libre post-ultrafiltración. Se empleó como selector quiral una disolución de CM-β-CD 30 mM en tampón Tris 50 mM de pH 6,0, que se inyectó en el modo de llenado parcial del capilar aplicando una presión de 0,5 psi durante 99 s antes de la inyección de muestra. La separación quiral se llevó a cabo a 25 ºC aplicando un potencial de 15 kV. Los modelos matemáticos y diseños experimentales desarrollados en el Artículo V se aplicaron aquí para el cálculo de las constantes de unión, enantioselectividad y porcentaje de unión a las proteínas plasmáticas. Los valores de PB% a HSA fueron 47 y 36% para S- y R-zopiclona, respectivamente, mientras que los valores de PB% al total de las proteínas plasmáticas fueron 45 y 49%, respectivamente. Estos valores concuerdan con el PB% descrito en la bibliografía para zopiclona racémica, en torno al 45% (Gaillot y col., 1983; Agencia Española del Medicamento, 2011). La unión enantioselectiva de nomifensina a HSA y al total de las proteínas plasmáticas se evaluó en el Artículo VII, en este caso usando heptakis-(2,3,6-O-metil)-β-ciclodextrina 30 mM como selector quiral en el modo de llenado completo del capilar, con el mismo BGE y potencial de separación del Artículo VI pero con una temperatura del capilar de 50 ºC. El diseño experimental para la obtención de curvas de calibrado y análisis de muestras se repitió en dos sesiones independientes con el fin de evaluar la precisión inter-día del procedimiento. Como no se encontraron diferencias significativas entre los datos de ambas sesiones de trabajo, todos los datos se emplearon en conjunto para realizar las estimaciones. El PB% a HSA estimado fue de 40 y 63% para el primer y segundo enantiómero eluídos, respectivamente. Para la unión al total de proteínas plasmáticas, los valores estimados fueron de 63 y 64% respectivamente. Comparando estos valores, puede concluirse que el segundo enantiómero eluído de la nomifensina se une principalmente a la HSA, mientras que el primero se une también a otras proteínas plasmáticas. El diseño experimental y los modelos matemáticos propuestos en esta Tesis para una estimación fiable de la unión enantioselectiva de fármacos a las proteínas plasmáticas mediante ultrafiltración y EKC han demostrado ser una herramienta robusta que permite la obtención de buenas estimaciones in vitro en condiciones cercanas a las fisiológicas, proporcionando por lo tanto datos valiosos desde un punto de vista farmacocinético. En esta Tesis se han estimado datos de unión enantioselectiva de fluoxetina, zopiclona y nomifensina a las proteínas plasmáticas, completando la información disponible en la bibliografía sobre estos fármacos. La tercera parte de esta Tesis se dedica al desarrollo de reacciones enzimáticas en el interior del capilar empleando la metodología EMMA. En EMMA los reactivos se introducen secuencialmente en el capilar electroforético y se dejan mezclar y reaccionar durante un tiempo determinado. Después se lleva a cabo la separación de sustratos, enzimas y productos mediante electroforesis. La principal ventaja de la metodología EMMA es que la reacción tiene lugar a escala de nanolitros, por lo que el consumo de reactivos y muestras es extremadamente bajo. Además, es una metodología completamente automatizada, ya que la reacción y la separación tienen lugar en una única etapa en el interior del capilar, lo que constituye otra importante ventaja para su empleo en procedimientos de cribado. En el Artículo VIII se desarrolla una metodología de cribado mediante EMMA para la evaluación de inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChE), y se aplica al estudio de cinco fármacos de actividad inhibidora conocida. Para la optimización de condiciones del método se empleó tacrina como fármaco modelo. El avance de la reacción enzimática de hidrólisis de acetiltiocolina en presencia de AChE y de los diferentes inhibidores se determinó midiendo el área de pico del producto de reacción tiocolina. Se llevó a cabo una inyección en “sándwich”, introduciendo una zona de sustrato entre dos zonas de enzima. El mezclado de las zonas se llevó a cabo mediante difusión simple, con un tiempo de incubación de 2 minutos. El tampón empleado para la reacción y la separación fue borato-fosfato 30 mM a pH 8,0; la temperatura del capilar se fijó a 37 ºC y el potencial de separación a 15 kV. Debido a la dilución de los solutos en la metodología EMMA, se realizó una corrección en los cálculos para obtener una buena exactitud en los resultados. Se estimó un factor de dilución comparando la potencia inhibitoria de la tacrina calculada en este trabajo con la descrita en la bibliografía empleando el método de referencia (Andrisano y col., 2001). Dicho factor se aplicó posteriormente a todos los cálculos realizados. La metodología de cribado propuesta ha demostrado ser de utilidad para la estimación de constantes de inhibición, potencia inhibitoria, una aproximación cualitativa al mecanismo de inhibición y el porcentaje de inhibición de tacrina, edrophonium, neostigmina, piridostigmina y eserina. Los resultados del cribado muestran que, de acuerdo con su porcentaje de inhibición en condiciones prefijadas, el orden de potencia inhibitoria para estos compuestos es tacrina > edrophonium > neostigmina > eserina > piridostigmina. Esta metodología de cribado, con un tiempo de análisis inferior a 5 minutos, puede ser empleada para la evaluación de nuevas moléculas que sean inhibidores potenciales de la AChE. Continuando con el uso de la metodología EMMA para la evaluación de interacciones fármaco-enzima, los Artículos IX y X son estudios de metabolismo enantioselectivo empleando diferentes isoformas del citocromo P450. En estos estudios, el capilar actúa simultáneamente como reactor y como sistema de separación quiral, de modo que proporciona información enantioselectiva a través de un ensayo rápido y completamente automatizado. La separación quiral se lleva a cabo en ambos casos usando HS-β-CD y la técnica del llenado parcial del capilar. El Artículo IX hace referencia al metabolismo enantioselectivo de verapamilo, bloqueante de canales de Ca+2, mediante CYP3A4, la isoforma más importante del citocromo P450 en humanos. En este artículo se consideraron diferentes posibilidades para el ensayo mediante EMMA y se optimizaron variables experimentales previamente al cálculo de los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten para el metabolismo enantioselectivo del verapamilo. Las condiciones experimentales seleccionadas incluyeron una inyección tipo “sándwich” de la zona de sustrato entre dos zonas de enzima, y la inyección de dos zonas de tampón de incubación antes y después del “sándwich” con el fin de proporcionar a la enzima su medio de reacción adecuado. El mezclado de las zonas se llevó a cabo mediante difusión simple durante un tiempo de incubación de 5 min. A continuación se llevó a cabo la separación de toda la mezcla de reacción incluyendo los enantiómeros del verapamilo y su metabolito principal norverapamilo en el mismo capilar, empleando las siguientes condiciones experimentales: fosfato 50 mM de pH 8,8 como BGE, HS-β-CD al 2,5% inyectada a 10 psi/2 min, 25 ºC y separación a 20 kV con una pequeña presión de 0,2 psi con el fin de acortar los tiempos de migración. El resultado es una metodología completamente automatizada