Metabolic network modeling of redox balancing and biohydrogen production in purple nonsulfur bacteria

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Purple nonsulfur bacteria (PNSB) are facultative photosynthetic bacteria and exhibit an extremely versatile metabolism. A central focus of research on PNSB dealt with the elucidation of mechanisms by which they manage to balance cellular redox under diverse conditions, in particular under photoheterotrophic growth.</p> <p>Results</p> <p>Given the complexity of the central metabolism of PNSB, metabolic modeling becomes crucial for an integrated analysis of the accumulated biological knowledge. We reconstructed a stoichiometric model capturing the central metabolism of three important representatives of PNSB (<it>Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides </it>and <it>Rhodopseudomonas palustris)</it>. Using flux variability analysis, the model reveals key metabolic constraints related to redox homeostasis in these bacteria. With the help of the model we can (i) give quantitative explanations for non-intuitive, partially species-specific phenomena of photoheterotrophic growth of PNSB, (ii) reproduce various quantitative experimental data, and (iii) formulate several new hypotheses. For example, model analysis of photoheterotrophic growth reveals that - despite a large number of utilizable catabolic pathways - substrate-specific biomass and CO₂yields are fixed constraints, irrespective of the assumption of optimal growth. Furthermore, our model explains quantitatively why a CO₂fixing pathway such as the Calvin cycle is required by PNSB for many substrates (even if CO₂is released). We also analyze the role of other pathways potentially involved in redox metabolism and how they affect quantitatively the required capacity of the Calvin cycle. Our model also enables us to discriminate between different acetate assimilation pathways that were proposed recently for <it>R. sphaeroides </it>and <it>R. rubrum</it>, both lacking the isocitrate lyase. Finally, we demonstrate the value of the metabolic model also for potential biotechnological applications: we examine the theoretical capabilities of PNSB for photoheterotrophic hydrogen production and identify suitable genetic interventions to increase the hydrogen yield.</p> <p>Conclusions</p> <p>Taken together, the metabolic model (i) explains various redox-related phenomena of the versatile metabolism of PNSB, (ii) delivers new hypotheses on the operation and relevance of several metabolic pathways, and (iii) holds significant potential as a tool for rational metabolic engineering of PNSB in biotechnological applications.</p

Modeling the Interplay between Photosynthesis, CO2 Fixation, and the Quinone Pool in a Purple Non-Sulfur Bacterium

Rhodopseudomonas palustris CGA009 is a purple non-sulfur bacterium that can fix carbon dioxide (CO 2) and nitrogen or break down organic compounds for its carbon and nitrogen requirements. Light, inorganic, and organic compounds can all be used for its source of energy. Excess electrons produced during its metabolic processes can be exploited to produce hydrogen gas or biodegradable polyesters. A genome-scale metabolic model of the bacterium was reconstructed to study the interactions between photosynthesis, CO2 fixation, and the redox state of the quinone pool. A comparison of model-predicted flux values with available Metabolic Flux Analysis (MFA) fluxes yielded predicted errors of 5–19% across four different growth substrates. The model predicted the presence of an unidentified sink responsible for the oxidation of excess quinols generated by the TC A cycle. Furthermore, light-dependent energy production was found to be highly dependent on the quinol oxidation rate. Finally, the extent of CO2 fixation was predicted to be dependent on the amount of ATP generated through the electron transport chain, with excess ATP going toward the energy-demanding Calvin-Benson-Bassham (CBB) pathway. Based on this analysis, it is hypothesized that the quinone redox state acts as a feed-forward controller of the CBB pathway, signaling the amount of ATP available

Improving photofermentative hydrogen production through metabolic engineering and DOE (Design of Experiments)

A l’heure actuelle, les biocarburants renouvelables et qui ne nuit pas à l'environnement sont à l'étude intensive en raison de l'augmentation des problèmes de santé et de la diminution des combustibles fossiles. H2 est l'un des candidats les plus prometteurs en raison de ses caractéristiques uniques, telles que la densité d'énergie élevée et la génération faible ou inexistante de polluants. Une façon attrayante pour produire la H2 est par les bactéries photosynthétiques qui peuvent capter l'énergie lumineuse pour actionner la production H2 avec leur système de nitrogénase. L'objectif principal de cette étude était d'améliorer le rendement de H2 des bactéries photosynthétiques pourpres non sulfureuses utilisant une combinaison de génie métabolique et le plan des expériences. Une hypothèse est que le rendement en H2 pourrait être améliorée par la redirection de flux de cycle du Calvin-Benson-Bassham envers du système de nitrogénase qui catalyse la réduction des protons en H2. Ainsi, un PRK, phosphoribulose kinase, mutant « knock-out » de Rhodobacter capsulatus JP91 a été créé. L’analyse de la croissance sur des différentes sources de carbone a montré que ce mutant ne peut croître qu’avec l’acétate, sans toutefois produire d' H2. Un mutant spontané, YL1, a été récupéré qui a retenu l'cbbP (codant pour PRK) mutation d'origine, mais qui avait acquis la capacité de se développer sur le glucose et produire H2. Une étude de la production H2 sous différents niveaux d'éclairage a montré que le rendement d’YL1 était de 20-40% supérieure à la souche type sauvage JP91. Cependant, il n'y avait pas d'amélioration notable du taux de production de H2. Une étude cinétique a montré que la croissance et la production d'hydrogène sont fortement liées avec des électrons à partir du glucose principalement dirigés vers la production de H2 et la formation de la biomasse. Sous des intensités lumineuses faibles à intermédiaires, la production d'acides organiques est importante, ce qui suggère une nouvelle amélioration additionnel du rendement H2 pourrait être possible grâce à l'optimisation des processus. Dans une série d'expériences associées, un autre mutant spontané, YL2, qui a un phénotype similaire à YL1, a été testé pour la croissance dans un milieu contenant de l'ammonium. Les résultats ont montré que YL2 ne peut croître que avec de l'acétate comme source de carbone, encore une fois, sans produire de H2. Une incubation prolongée dans les milieux qui ne supportent pas la croissance de YL2 a permis l'isolement de deux mutants spontanés secondaires intéressants, YL3 et YL4. L'analyse par empreint du pied Western a montré que les deux souches ont, dans une gamme de concentrations d'ammonium, l'expression constitutive de la nitrogénase. Les génomes d’YL2, YL3 et YL4 ont été séquencés afin de trouver les mutations responsables de ce phénomène. Fait intéressant, les mutations de nifA1 et nifA2 ont été trouvés dans les deux YL3 et YL4. Il est probable qu'un changement conformationnel de NifA modifie l'interaction protéine-protéine entre NifA et PII protéines (telles que GlnB ou GlnK), lui permettant d'échapper à la régulation par l'ammonium, et donc d'être capable d'activer la transcription de la nitrogénase en présence d'ammonium. On ignore comment le nitrogénase synthétisé est capable de maintenir son activité parce qu’en théorie, il devrait également être soumis à une régulation post-traductionnelle par ammonium. Une autre preuve pourrait être obtenue par l'étude du transcriptome d’YL3 et YL4. Une première étude sur la production d’ H2 par YL3 et YL4 ont montré qu'ils sont capables d’une beaucoup plus grande production d'hydrogène que JP91 en milieu d'ammonium, qui ouvre la porte pour les études futures avec ces souches en utilisant des déchets contenant de l'ammonium en tant que substrats. Enfin, le reformage biologique de l'éthanol à H2 avec la bactérie photosynthétique, Rhodopseudomonas palustris CGA009 a été examiné. La production d'éthanol avec fermentation utilisant des ressources renouvelables microbiennes a été traitée comme une technique mature. Cependant, la plupart des études du reformage de l'éthanol à H2 se sont concentrés sur le reformage chimique à la vapeur, ce qui nécessite généralement une haute charge énergetique et résultats dans les émissions de gaz toxiques. Ainsi le reformage biologique de l'éthanol à H2 avec des bactéries photosynthétiques, qui peuvent capturer la lumière pour répondre aux besoins énergétiques de cette réaction, semble d’être plus prometteuse. Une étude précédente a démontré la production d'hydrogène à partir d'éthanol, toutefois, le rendement ou la durée de cette réaction n'a pas été examiné. Une analyse RSM (méthode de surface de réponse) a été réalisée dans laquelle les concentrations de trois facteurs principaux, l'intensité lumineuse, de l'éthanol et du glutamate ont été variés. Nos résultats ont montré que près de 2 moles de H2 peuvent être obtenus à partir d'une mole d'éthanol, 33% de ce qui est théoriquement possible.Currently, renewable and environmentally friendly biofuels are under intensive study due to increasing health concerns and diminishing fossil fuels. H2 is one of the most promising candidates due to its unique characteristics, such as a high energy density and low to non-existent generation of pollutants. One attractive way to produce H2 is through photosynthetic bacteria which can capture light energy to drive H2 production with their nitrogenase system. The major aim of this study was to improve H2 yield of the purple non-sulfur photosynthetic bacteria using a combination of metabolic engineering and design of experiments. One hypothesis was that H2 yield could be improved by redirection of Calvin-Benson-Bassham cycle flux to the nitrogenase system which catalyzes the reduction of protons to H2. Thus, a PRK, phosphoribulose kinase, knock out mutant of Rhodobacter capsulatus JP91 was created. Analysis of growth with different carbon sources showed that this mutant could only grow in acetate medium without, however, producing any H2. A spontaneous mutant, YL1, was recovered which retained the original cbbP (encoding PRK) mutation, but which had gained the ability to grow on glucose and produce H2. A study of H2 production under different illumination levels showed that the yield of YL1 was 20-40% greater than the wild type JP91 strain. However, there was no appreciable improvement of the H2 production rate. A kinetic study showed that growth and hydrogen production are strongly linked with electrons from glucose being mostly directed to H2 production and biomass formation. Under low to intermediate light intensities, the production of organic acids was significant, suggesting further improvement of H2 yield is possible by process optimization. In a related series of experiments, another spontaneous mutant, YL2, which has a similar phenotype to YL1, was tested for growth in ammonium-containing media. The results showed that YL2 could only grow with acetate as carbon source, again, without producing any H2. Prolonged incubation in media not supporting growth of YL2 enabled the isolation of two interesting secondary spontaneous mutants, YL3 and YL4. Western blot analysis showed that both strains had constitutive nitrogenase expression under a range of ammonium concentrations. The genomes of YL2, YL3 and YL4 were sequenced in order to find the mutations responsible for this phenomenon. Interestingly, mutations of nifA1 and nifA2 were found in both YL3 and YL4. It is likely that a conformational change of NifA alters the protein-protein interaction between NifA and PII proteins (such as GlnB or GlnK), enabling it to escape regulation by ammonium and thus to be capable of activating nitrogenase transcription in the presence of ammonium. It is not clear how the synthesized nitrogenase is able to maintain its activity since in theory it should also be subject to posttranslational regulation by ammonium. Further evidence could be obtained by studying the transcriptome of YL3 and YL4. An initial study of H2 production by YL3 and YL4 showed that they are capable of much greater hydrogen production than JP91 in ammonium medium, which opens the door for future studies with these strains using ammonium-containing wastes as substrates. Finally, the biological reformation of ethanol to H2 with the photosynthetic bacterium, Rhodopseudomonas palustris CGA009 was examined. Ethanol production with microbial fermentation using renewable resources has been treated as a mature technique. However, most studies of the reformation of ethanol to H2 have focused on chemical steam reforming, which usually requires a high energy input and results in toxic gas emission. Thus biological reformation of ethanol to H2 with photosynthetic bacteria, which can capture light to meet the energy requirement of this reaction, seems to be more promising. A previous study had demonstrated hydrogen production from ethanol, however, the yield or the duration of this reaction were not examined. A RSM (response surface methodology) analysis was carried out in which three key factors, light intensity, ethanol and glutamate concentrations were varied. Our results showed that nearly 2 moles of H2 could be obtained from one mole of ethanol, 33% of what is theoretically possible

Metabolic Engineering to Improve Biohydrogen Production by Rhodobacter capsulatus JP91

La demande pour l'énergie augmente de jour en jour, ce qui se traduit par une attention mondiale à l'égard d'autres carburants respectueux de l'environnement parce que les combustibles fossiles nuisent à l'environnement. La production biologique d'hydrogène est une méthode alternative pour la production d'hydrogène, grâce à laquelle elle est produite dans des conditions douces, respectueux de l'environnement. La production photo-biologique d'hydrogène par les bactéries photosynthétiques pourpres non sulfureuses est un processus prometteur dans lequel les bactéries peuvent capturer de l'énergie lumineuse pour conduire la production d'H2 avec leur système de nitrogénase. Cependant, certaines voies métaboliques, tel que la fixation du CO2 et la biosynthèse du PHB, rivalisent avec la nitrogénase pour les électrons. Récemment, l'génie la métabolique a été appliqué pour améliorer le taux et le rendement de production d'H2. Le but de la présente étude était d'améliorer le rendement de la production d'H2 pendant la Photosynthèse par Rhodobacter capsulatus JP91 en utilisant des approches d'ingénierie métabolique. Notre hypothèse était que l'inactivation de PHB synthase (phbC) arrêterait la biosynthèse de PHB et dirigerait plus de flux des électrons dérivés du substrat vers la nitrogénase pour catalyser la production d’H2. Dans des études antérieures, des mutants dans la PHB synthase ont été développés dans d'autres bactéries photosynthétiques, y compris R. sphearoides et Rhodopseudomonas palustris mais pas Rhodobacter capsulatus. Dans cette étude, nous avons développé une nouvelle souche R. capsulatus RS15 doublement mutée (hupˉ, phbCˉ) qui était dérivée de R. capsulatus JP91 (hupˉ). Nos résultats montrent que la nouvelle souche, R. capsulatus RS15 pourrait croître dans différentes sources de carbone et d'azote. Notre mutant a une longue phase de décalage. Cependant, une foi démarrée, lorsqu'elle atteignait la phase logarithmique, sa croissance était similaire à ce de la souche parentale. À partir des résultats de la production d’hydrogène, la souche RS15 nouvellement développée est capable de convertir l'acétate, le lactate et le glucose en hydrogène l’acétate semble d’être la meilleure source de carbone pour la production de H2 par RS15 mais pas pour sa croissance. Surtout, R. capsulatus RS15 (hup-, phbC-) semble d’être un candidat prometteur pour le système hybride à deux niveaux puisque les principaux effluents de fermentation sombre sont l'acétate et le butyrate. Donc, ce processus peut potentiellement rendre la technologie de production de bio hydrogène possible à l’échelle industrielle.Energy demand is increasing day by day, resulting in global attention towards alternative eco- friendly fuels. Biohydrogen is considered the most promising energy carrier to replace conventional fossil fuels because its production and combustion is not harmful to the environment. Biological hydrogen production is an alternative method for hydrogen production, by which hydrogen is produced under mild conditions, making it environmentally friendly. Photo- biological hydrogen production by purple non-sulfur photosynthetic bacteria is a promising process in which bacteria can capture light energy to drive H2 production with their N2ase system. Some metabolic pathways, such as CO2 fixation and PHB biosynthesis, compete with nitrogenase for electrons (reducing equivalents). Recently, in attempts to improve the yield of H2, metabolic engineering has been applied to increase electron flow to N2ase. The purpose of the present study was to improve the yield of photosynthetic H2 production by Rhodobacter capsulatus JP91 using a metabolic engineering approach. The hypothesis was that inactivation of PHB synthase (phbC) would block PHB biosynthesis, thus directing more electron flux towards nitrogenase to catalyze increased H2 production. In previous studies, PHB synthase mutants were developed in other photosynthetic bacteria, including R. sphearoides and Rhodopseudomonas palustris but not Rhodobacter capsulatus. In this study, a new doubly mutated R. capsulatus strain RS15 (hup‾, phbC‾), a derivative of R. capsulatus JP91 (hup‾) was created. The results show that the newly created strain, R. capsulatus RS15, could grow in different carbon and nitrogen sources. This mutant has a long lag phase. However, once it reached log phase, growth was similar to the parental strain. From hydrogen production studies, the new developed strain RS15 is able to convert acetate, lactate, and glucose to hydrogen. Acetate was shown to be the best carbon source for H2 production by RS15 but not for its growth. Overall, R. capsulatus RS15 (hup‾, phbC‾) seems to be a promising candidate for use in two - stage hybrid systems since the main dark fermentation effluents are acetate and butyrate. Such a process could potentially make biohydrogen production technology feasible on an industrial scale

Cultivation of purple non-sulfur bacteria in a stirred tank bioreactor under dark conditions with different carbon sources

Ljubičaste bakterije se kroz zadnjih nekoliko desetljeća prezentiraju kao modelni organizmi za istraživanje i shvaćanje fotosintetskih prokariota zahvaljujući njihovoj iznimnoj sposobnosti prilagodbe raznim uvjetima okoline. Također, ljubičaste nesumporne bakterije su naročito zanimljive s komercijalnog aspekta s obzirom na činjenicu da proizvode veliki niz proizvoda kao što su vodik, pigmenti, biokemikalije, biopolimeri i mnoge druge. U ovom radu se ispitivao aerobni kemoheterotrofni rast, potrošnja supstrata, te sinteza pigmenata bakterija Rhodobacter azotoformans JCM 9340 i Rhodovulum adriaticum DSM 2781 u bioreaktoru s miješalom bez prisutnosti svjetla uz različite izvore ugljika. Kao izvori ugljika su se koristile glukoza i ksiloza, te hidrolizat lignocelulozne biomase dobiven kiselinskom predobradom u visokotlačnom reaktoru. Uzgoj Rhodobacter azotoformans JCM 9340 je pokazao slabiji rast, te sintezu pigmenata tijekom uzgoja na glukozi i ksilozi, dok je Rhodovulum adriaticum DSM 2781 najveću produktivnost 0,154 g L-¹h-¹ procesa postigao tijekom uzgoja na predobrađenoj lignoceluloznoj biomasi. Također, tijekom tog procesa se postigao i najveći prinos biomase bakterije 3,7 g L-¹. Najviše vrijednosti koncentracije pigmenata, prikazane kao vrijednosti bakterioklorofila a, su postignute tijekom uzgoja Rhodovulum adriaticum DSM 2781 na glukozi i ksilozi 8,599 mg L-¹.In the last couple of decades, purple non-sulfur bacteria have presented themselves as a model organism for researching and understanding of photosynthetic prokaryotes thanks to their excellent capability of adapting to different environmental conditions. These bacteria are also interesting in a commercial aspect due to their capability of producing a grand array of products such as biohydrogen, pigments, biochemicals, biopolymers etc. In this thesis, aerobic chemoheterotrophic growth, substrate consumption and pigment biosynthesis of bacteria Rhodovulum adriaticum DSM 2781 and Rhodobacter azotoformans JCM 9340 in a stirred tank bioreactor under dark conditions with different carbon sources, was studied. Glucose, xylose and lignocellulosic hydrolysates, obtained by acidic pretreatment in highpressure reactor, were used as carbon sources for cultivation. Results obtained by Rhodobacter azotoformans JCM 9340 showed poor growth and photosynthetic pigments synthesis on glucose and xylose, while results obtained by Rhodovulum adriaticum DSM 2781 showed great success. The highest bioprocess productivity of 0.154 g L-¹ h-¹ was observed during cultivation on pretreated lignocellulosic biomass. During that process, the highest yield of biomass of 3.7 g L-¹ was achieved, as well. The most successful medium for pigment biosynthesis, shown as bacteriochlorophyll a concentration, was glucose/xylose medium reaching 8.599 mg L-¹ of bacteriochlorophyll a

Nonlinear dynamics of Poly(hydroxyalkanoate) production in Ralstonia eutropha and Rhodospirillum rubrum

Magdeburg, Univ., Fak. für Elektrotechnik und Informationstechnik, Diss., 2015von André Fran

Development and application of a method for quantitative metabolome analysis of various production strains

Im Rahmen der Dissertation wurde eine Methode zur Quantifizierung der Metabolite des zentralen Kohlenstoffwechsels von Mikroorganismen entwickelt. Die Methode wurde genutzt um das Metabolom verschiedenster Produktionsstämme im nanomolaren Bereich zu analysieren. Bei der Analyse der Daten wurden Ergebnisse aus Metabolom- und Fluxomforschung kombiniert, um einen ganzheitlichen Ansatz zu schaffen. Auf diese Weise konnte unter anderem der Einfluss verschiedener Kultiverungsverfahren auf das Energielevel von E. coli untersucht werden. Weitere Messungen untersuchten den Einfluss von genetischen Veränderungen, Stress und unterschiedlichen C-Quellen auf den zentralen Kohlenstoffwechsel von weiteren Mikroorganismen.The present work describes the development of a analytical method to quantify the metabolites of the central carbon metabolism of microorganisms. The method was used to analyze the metabolome of various production strains in the nanomolar range. The combination of metabolome and fluxome data allowed a wholistic analysis of the measured data. The apporach was used to analyze the influence of different cultivation modes on the adenylate energy charge of E. coli. Furthermore, the influence of genetic modifications, stress or different carbon sources on the central carbon metabolism of other production strains was analyzed by applcation of the developed method

Tecnologías de vanguardia para la producción de bioplásticos a partir de residuos complejos

El aumento de la población y de la demanda de productos, combinado con la escasa gestión de los residuos generados desde la industrialización, ha promovido la acumulación de una cantidad devastadora de desechos generando una huella ecológica imborrable en nuestro planeta. Un ejemplo especialmente relevante es el aumento de los residuos plásticos de origen petroquímico, así como todos los problemas medioambientales derivados del uso de combustibles fósiles en su producción, y los problemas de contaminación que generan debido a su resistencia a la biodegradación. Como consecuencia, se ha promovido un cambio de paradigma en la manera de producir y gestionar los residuos, estableciendo estrategias basadas en la economía circular. Específicamente en el caso de los materiales plásticos, se plantean dos objetivos principales: (I) cambiar la gestión de los residuos de los plásticos de origen petroquímico, (II) y tornar la producción hacia alternativas sostenibles basadas en la obtención de materiales plásticos biodegradables a través de la revalorización de residuos y la utilización de materias primas renovables. Esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo en el contexto del proyecto europeo “AFTERLIFE” (Advanced Filtration TEchnologies for the Recovery and Later conversion of relevant Fractions from wastEwater), donde se propone el desarrollo de un proceso flexible y eficiente a través del cual se puedan recuperar y revalorizar diferentes fracciones del agua residual de origen agro-industrial. En este contexto, y en el primer capítulo de esta memoria, Cupriavidus necator H16 ha sido seleccionada para la transformación de ácidos grasos volátiles (VFAs), derivados de la digestión anaerobia (AD) de las aguas residuales, en bioplásticos de origen bacteriano o polihidroxialcanoatos (PHA)..

Untersuchungen zum biotechnologischen Potenzial des fakultativ photosynthetischen Bakteriums Rhodospirillum rubrum und dessen Zentralstoffwechsel

Magdeburg, Univ., Fak. für Naturwiss., Diss., 2013von Christiane Rudol