Glicômica da resposta imune: o universo de glicanos e lectinas em microambientes inflamatórios e neoplásicos

Las galectinas, una familia de lectinas que reconocen glico-conjugados específicos en la superficie celular y la matriz, participan en diversos procesos biológicos como reguladores de la ho-meostasis de la respuesta inmune y de la progresión tumoral. Considerando el papel inmunomodulador de Galectina-1 (Gal-1) en modelos de inflamación crónica y su contribución a la creación de microambientes tolerogénicos, durante los últimos años exploramos el impacto de esta proteína sobre el balance de células T y la funcionalidad de células dendríticas (CDs). Mientras las células Th1 y Th17 poseen el repertorio de glicanos necesarios para la unión de Gal-1, los linfocitos Th2 son resistentes a la unión de esta proteína, lo cual explicaría el incremento en la susceptibilidad de los linfocitos Th1 y Th17 a la apoptosis inducida por Gal-1 y la consecuente desviación en el balance de la respuesta inmune hacia un perfil Th2. Además, identificamos un circuito tolerogénico en el que Gal‐1 induce la diferenciación de CDs tolerogénicas productoras de IL‐27, la consecuente expansión de células T regulatorias productoras de IL‐10 y la supresión de la inflamación mediada por células Th1 y Th17. Postulamos un nuevo mecanismo de regulación homeostática de la respuesta inmune basado en la interacción entre Gal‐1 y sus gli-canos específicos, el cual permite anticipar nuevos horizontes terapéuticos, en los que la modulación de la expresión de Gal‐1 o sus glicanos nos permitiría regular la respuesta inmune.Galectins, a family of endogenous glycan-binding proteins able to recognize specific glycoconjugates on cell surface and extracellular matrix, control critical immunological processes involved in immune homeostasis and tumor progression. Given the immunosuppressive role of Galectin-1 (Gal-1) in different models of chronic inflammation and its contribution to the creation of tolerogenic microenvironments in cancer and pregnancy models, the impact of this protein on T helper cell balance and dendritic cells (DCs) functionality was explored. A novel mechanism, based on the differential glycosylation of T helper cell subsets, by which Gal-1 preferentially eliminates antigen-specific Th1 and Th17 cells, leading to a shift toward a Th2 profile was identified. While Th1- and Th-17-differentiated cells expressed the repertoire of cell surface glycans that are critical for Gal-1-induced cell death, Th2 cells are protected from Gal-1 through differential sialylation of cell surface glycoproteins. More recently, the ability of Gal-1 to trigger the differentiation of tolerogenic dendritic cells (DCs), which promote resolution of autoimmune inflammation, was demonstrated. A tolerogenic circuit linking Gal-1 signaling, IL-27-producing DCs and IL-10-secreting T cells was identified. It can be postulated that molecular interactions between endogenous galectins and specific glycans constitute a novel mechanism of homeostatic regulation of immune responses. Understanding the role of protein-glycan interactions in the establishment of tolerogenic or inflammatory programs will enable the design of more rational immunotherapeutic strategies with broad biomedical implications.As galectinas, uma família de lectinas que reconhecem gli-coconjugados específicos na superfície celular e a matriz, participam em diversos processos biológicos como reguladores da homeostase da resposta imune e da progressão tu-moral. Considerando o papel imunomodulador de Galec-tina-1 (Gal-1) em modelos de inflamação crônica e sua contribuição à criação de microambientes tolerogênicos, durante os últimos anos exploramos o impacto desta proteína sobre o balanço de células T e a funcionalidade de células dendríticas (CDs). Enquanto as células Th1 e Th17 possuem o repertório de glicanos necessários para a união de Gal-1, os linfócitos Th2 são resistentes à união desta proteína, o qual explicaria o incremento na suscetibilidade dos linfóci-tos Th1 e Th17 à apoptose induzida por Gal-1 e o conse-guinte desvio no balanço da resposta imune para um perfil Th2. Além disso, identificamos um circuito tolerogênico no qual Gal‐1 induz a diferenciação de CDs tolerogênicas pro-dutoras de IL‐27, a conseguinte expansão de células T re-gulatórias produtoras de IL‐10 e a supressão da inflamação mediada por células Th1 e Th17. Postulamos um novo mecanismo de regulação homeostática da resposta imune ba-seado na interação entre Gal‐1 e seus glicanos específicos, que permite antecipar novos horizontes terapêuticos, nos quais a modulação da expressão de Gal‐1 ou seus glicanos nos permitiria regular a resposta imune.Fil: Sundblad, Victoria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Cerliani, Juan Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Compagno, Daniel Georges. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Croci Russo, Diego Omar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: D'alotto Moreno, Tomas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Dergan Dylon, Leonardo Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Di Lella, Santiago. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Gatto, Claudia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular; ArgentinaFil: Gentilini, Lucas Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Giribaldi, María Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Cs.exactas y Naturales. Departamento de Quimica Biologica. Laboratorio de Analisis Biologicos E Inmunoquimica; ArgentinaFil: Guardia, Carlos Manuel Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Ilarregui, Juan Martin. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Laderach, Diego Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Martínez Allo, Verónica Candela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Mascanfroni, Ivan Darío. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Mendez Huergo, Santiago Patricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Salatino, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Stupirski, Juan Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Toscano, Marta Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; ArgentinaFil: Rabinovich, Gabriel Adrian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina; Argentin

Specific pathogenic mechanisms of mucosal protozoans : Entamoeba histolytica, Giardia lamblia and Trichomonas vaginalis

Entamoeba histolytica e Giardia lamblia são protozoários que podem parasitar a mucosa intestinal, causando principalmente diarreia. Trichomonas vaginalis coloniza a mucosa vaginal causando tricomonose, a doença sexualmente transmissível não viral mais comum no mundo. Embora coletivamente estes parasitos infectem mais de um bilhão de pessoas a cada ano, seus mecanismos de patogenicidade ainda não estão totalmente esclarecidos. Assim, esta revisão reúne os principais mecanismos envolvidos na patogenicidade destes protozoários, bem como os fatores do microambiente que podem interferir no sucesso da colonização. A patogênese da E. histolytica envolve adesão, lise, fagocitose de células epiteliais e bactérias, invasão tecidual por ação de enzimas e evasão da resposta imune do hospedeiro. A lectina Gal/GalNAc, os amebaporos e as cisteína proteases são as principais moléculas envolvidas nesses processos. O estabelecimento da giardiose depende de diversos mecanismos patogênicos e de virulência desenvolvidos pela G. lamblia, tais como as moléculas envolvidas na adesão, encistamento e variação antigênica. Para o sucesso da colonização da mucosa vaginal, o T. vaginalis expressa moléculas como as adesinas de superfície, lipofosfoglicanos e galectina, envolvidas na adesão às células epiteliais vaginais e alteração da expressão gênica, tanto do parasito como do hospedeiro.Entamoeba histolytica and Giardia lamblia are protozoans that may parasitize the intestinal mucosa, mainly causing diarrhea. Trichomonas vaginalis colonizes the vaginal mucosa causing trichomonosis, the most common non-viral sexually transmitted disease in the world. Although collectively these parasites infect over a billion people each year, their pathogenic mechanisms have not been completely understood so far. Hence, this review of the literature demonstrates the main mechanisms involved in the pathogenicity of these protozoans, as well as the microenvironmental factors that can interfere with successful colonization. The pathogenesis of E. histolytica involves adhesion, lysis, phagocytosis of epithelial cells and bacteria, tissue invasion by enzymatic action, and evasion of host immune response. Lectin Gal/GalNac, amoebapores, and cysteine proteases are the main molecules involved in these processes. The establishment of giardiosis depends on several pathogenic mechanisms and virulence developed by G. lamblia, such as molecules involved in adhesion, encystation and antigenic variation. For successful colonization of vaginal mucosa, T. vaginalis express molecules like adhesins on the surface and galectin and lipophosphoglycan, involved in the adherence to vaginal epithelial cells and altered gene expression of both the parasite and the host

Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad

La diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune en la que las células β de los islotes de Langerhans son selectivamente destruidas por linfocitos T autorreactivos específicos para antígenos propios de estas células (autoantígenos), disminuyéndose gravemente la cantidad de insulina secretada, lo que conduce a la patogenia de la enfermedad. Estos linfocitos T autorreactivos pueden haber sido generados por alteraciones en la tolerancia central y/o en la tolerancia periférica. Por todo ello en este trabajo de tesis nos hemos propuesto i) clonar, expresar y purificar autoantígenos importantes en la diabetes tipo 1 para desarrollar sistemas de detección de autoanticuerpos específicos contra ellos; ii) identificar los epitopos derivados del autoantígeno S100β procesados y presentados de manera natural a linfocitos T por moléculas de histocompatibilidad que confieren susceptibilidad a padecer la enfermedad (HLA-DRB1*04:01 y HLA-A*02:01); y iii) estudiar la síntesis de galectinas en sujetos sanos y pacientes con diabetes tipo 1, ya que estas proteínas desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la tolerancia central y periférica. En el presente trabajo se han clonado, expresado y purificado los autoantígenos IGRP (subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa específica de los islotes), GFAP (proteína ácida de la glía) y S100β, las dos últimas en cantidades y pureza suficientes como para llevar a cabo los experimentos subsiguientes. Se han desarrollado dos sistemas de ELISA para la detección de autoanticuerpos contra GFAP y S100β: en el caso de GFAP la sensibilidad del ensayo es de 24,6% con una especificidad del 98,9% y un valor predictivo del 94,7%, existiendo diferencias significativas en la frecuencia de individuos positivos en pacientes con diabetes tipo 1 respecto de controles sanos, además de poseer aquéllos títulos de anticuerpo superiores, que correlacionan con el tiempo transcurrido desde el diagnóstico y con el número de complicaciones diabéticas. En lo que respecta a S100β no existen diferencias ni en frecuencia de positividad ni en título de autoanticuerpos entre controles y pacientes. Sin embargo por western blot se ha detectado un tipo de autoanticuerpo presente exclusivamente en los pacientes diabéticos, que sugiere la presencia de una respuesta humoral diferente contra este autoantígeno en comparación con controles sanos. Se han identificado péptidos derivados del autoantígeno S100β procesados y presentados de manera natural (PPPMN) tanto por la molécula de histocompatibilidad HLA-DRB1*04:01 (DR4) como por la molécula HLA-A*02:01 (A2.1). En el caso de DR4 se ha diseñado un sistema de presentación de antígeno en células homocigotas para DR4 a las que se les suministró S100β, se han inmunopurificado las moléculas DR4, y los péptidos unidos a ellas han sido identificados por espectrometría de masas. Los 44 PPPMN identificados se solapan parcialmente, como era de esperar para una molécula de histocompatibilidad de clase II, constituyendo 3 regiones, de las que hemos diseñado 4 péptidos consenso: S100 6-25, S100 21-36, S100 25-46 y S100 68-92. En un ensayo de unión in vitro a DR4 se ha comprobado que S100 68-92 y, en menor medida, S100 6-25 se unen in vitro a DR4, siendo el complejo resultante estable, y se ha delimitado la posible secuencia de unión. A continuación se ha detectado la presencia de linfocitos T autorreactivos específicos para estos epitopos en controles sanos y pacientes diabéticos mediante ensayos de ELISPOT para las citocinas IFN-γ, IL-10 e IL-17. Los pacientes muestran un fenotipo claramente proinflamatorio, con linfocitos T autorreactivos específicos para los péptidos consenso de S100β secretando IFN-γ y, en menor medida, IL-17. Los controles muestran, sin embargo, un fenotipo inmunoregulador, secretando IL-10 en respuesta a estos péptidos, especialmente contra S100 68-92. En el caso de A2.1 se han generado células dobles transfectantes que expresan A2.1 y S100β, de las cuales se han extraído los péptidos presentados por dichas moléculas de histocompatibilidad y se han identificado 5 PPPMN por espectrometría de masas. Mediante un ensayo in vitro se ha comprobado que al menos dos de los 5 PPPMN (S100 10-18 y S100 20-28) pueden haber sido generados por digestión en el proteosoma, un complejo multicatalítico clave en la generación de péptidos para su unión a moléculas de histocompatibilidad de clase I. Finalmente, hemos ensayado la capacidad de unión in vitro de estos PPPMN a la molécula A2.1, resultando que el péptido S100 10-18 se une con baja afinidad a la molécula de histocompatibilidad, característica compartida por otros péptidos derivados de autoantígenos descritos en la literatura. Se han generado además hibridomas a partir de linfocitos T infiltrantes de islotes de Langerhans de ratones NOD (no obesos diabéticos), el modelo animal de la diabetes tipo 1. Hemos comprobado que al menos 2 de los siete hibridomas generados son específicos de S100β, ya que reconocen epitopos derivados de esta proteína presentados por moléculas de histocompatibilidad de clase II. Finalmente, y teniendo en cuenta el gran papel inmunoregulador que desempeñan las galectinas -1 y -3 al mantener la tolerancia central y periférica, en el presente trabajo se ha estudiado la síntesis de estas galectinas, en primer lugar, en diferentes subtipos de linfocitos T colaboradores (Th), y en segundo lugar en distintos tipos celulares de controles sanos y pacientes con diabetes tipo 1. En lo que respecta a los linfocitos Th, es el subtipo Th17 el que mayores niveles de galectina-1 y -3 produce, respecto de los linfocitos Th1 y Th2. En cuanto al estudio en controles sanos y pacientes con diabetes tipo 1, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes secretan menores cantidades de ambas galectinas respecto de controles sanos. La secreción reducida de galectina-1 es debida a células carentes del marcador CD4 (monocitos, linfocitos B y/o linfocitos T CD8+), reducción que supone un mayor resistencia de los linfocitos T autorreactivos a la muerte por apoptosis. Los linfocitos T CD4+ de diabéticos no presentan problemas de secreción de galectina-1, pero poseen niveles significativamente mayores de galectina-1 en superficie, que también conllevan una mayor resistencia a la muerte por apoptosis. Finalmente, los linfocitos T reguladores (Treg) de diabéticos poseen menores niveles de galectina-1 en superficie, probablemente reduciendo su poder supresor. Así pues en este trabajo de tesis se purifican autoantígenos importantes en la diabetes autoinmune, se desarrollan técnicas de ELISA para la detección de autoanticuerpos específicos contra ellos, se identifican PPPMN derivados de S100β y presentados por moléculas de histocompatibilidad que confieren susceptibilidad a padecer la enfermedad, se detectan linfocitos T autorreactivos específicos para péptidos derivados de S100β en pacientes diabéticos, se generan hibridomas de linfocitos T infiltrantes de ratón NOD que reconocen S100β y se describen varios fallos en la síntesis de galectinas por parte de células de pacientes con diabetes tipo 1 respecto de controles sanos

Divergencias en las propiedades moleculares y modo de unión a ligandos de diferentes galectinas humanas

Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura:29-10-2012Crosslinking of glycan ligands on the cell surface by endogenous lectins triggers biosignaling and mediates cell-cell interactions, the family of adhesion/growth regulatory galectins in particular being key players in many physiological and pathological processes. Because of the participation of galectins in basic cellular functions (apoptosis, cellular recognition, triggering of transmembrane signaling cascades, etc.), they play key roles in cancer and immune and inflammatory processes. Therefore, the systematic characterization of the structure, stability and ligand recognition of the different galectins is fundamental for understanding their biological functions. The class of galectins exhibiting a tandem-repeattype design contains two different carbohydrate-recognition domains (CRDs) covalently connected by a linker peptide. This characteristic CRD arrangement enables the members of this category to specifically bind and crosslink different glycan targets, thus operating as dual fine-tuned sensors of galactose-containing glycans. In this Thesis, we have investigated the structural organization in solution and thermal stability of the human tandem-repeat-type galectins 4 and 8, in comparison with human galectins 1 (proto-type) and 3 (chimera-type), using a combination of biophysical approaches, including gel filtration chromatography, analytical ultracentrifugation and circular dichroism. The properties of natural and tailored variants and of isolated CRDs have been examined in parallel, in order to evaluate the influence of the linker on the protein’s properties and to discern divergences between domains. Using small-angle X-ray scattering, the structure of galectin-4 in solution has been modeled at low resolution. This model is the first depiction of the overall shape of a tandem-repeat-type galectin. In addition, the topological features and thermodynamic parameters of ligand binding have been inspected using isothermal titration calorimetry and binding/inhibition radioassays. Some similarities but also significant differences that may bring about the appearance of functional divergences are observed, not only between galectins, but also between the CRDs of a given galectin. As testing system of the galectin’s functionality, their possible bactericidal activity has been investigated. The results reveal a remarkable synergistic activity of certain galectins with antimicrobial peptides, the efficiency of galectin-1 in particular increasing noticeably upon oxidation. Therefore, the mechanism of oxidation of this galectin and the activity of reduced and oxidized variants on neuronal growth, a main biological target of oxidized galectin-1, has been examined. Overall, the results illustrate the occurrence of fine-tuned molecular properties for each particular galectin, which underlie the functional plasticity of this lectin family

Galectina-1: detección, caracterización, actividades biológicas e interacciones en plaquetas humanas

Las galectinas, previamente conocidas como lectinas de tipo S o S-Lac, son una familia filogenéticamente conservada que tienen homología de secuencias aminoacídicas y dominios de reconocimiento a carbohidratos (CRD). Todas las galectinas unen lactosa y otros oligosacáridos β-galactosídicos ejerciendo múltiples funciones. Se han identificado 15 galectinas de mamíferos, siendo designadas Gal-1 a la Gal-15. A través de estudios de localización de las galectinas se sabe que estas proteínas pueden secretarse en múltiples compartimentos celulares dependiendo del estatus celular. La Gal-1 pertenece a las galectinas prototipo, tiene un único CDR y puede formar homodímeros a través de interacciones no covalentes, lo que le confiere la habilidad de formar complejos multivalentes con glicoconjugados específicos en una amplia variedad de tejidos. La Gal-1 presenta una diversidad de comportamientos, presentando efectos estimulatorios o inhibitorios, de adhesividad o de anti-adhesividad, de proliferación o de inhibición de la proliferación, dependiendo del tipo celular, su estado de activación, expresión y su estado de glicosilación de receptores en su superficie, de la proporción monómero-dímero y de la distribución intra vs. extracelular. Las plaquetas son células sanguíneas anucleadas de forma discoide que circulan en una concentración de 150 a 450 x 109/L, formadas a partir de los megacariocitos como discos celulares pequeños que funcionan preservando la integridad del sistema vascular y sus acciones también están vinculadas con procesos complejos como inflamación y cáncer. Se sabe que aproximadamente el 15% del complejo GPIIb/IIIa plaquetario está compuesto por hidratos de carbono y que la interacción de la Gal-1 recombinante humana con plaquetas homólogas, provoca cambios conformacionales en los receptores GPIIb/IIIa los que favorecerían el fenómeno de activación. Debido a que la Gal-1 tiene un rol crucial en la homeostasis celular, inflamación y progresión tumoral, al igual que las plaquetas, y participa del funcionalismo plaquetario interaccionando a través de receptores/ligandos de la misma, nos propusimos purificar y caracterizar a la Gal-1 plaquetaria y plasmática humana, así como también establecer las interacciones con proteínas que participan en el funcionalismo de dichas células. En nuestro laboratorio, previamente demostramos que existía expresión de Gal-1endógena en plaquetas en reposo, tanto por IFI como por CF. Para el aislamiento de Gal-1 de las plaquetas y del plasma humano, realizamos cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad en lactosa-agarosa. Encontramos que la Gal-1 plaquetaria co-purifica con actina, formando un complejo difícil de disociar. La presencia del complejo fue confirmada por western blot y por RP-HPLC-MS. Se estudió la actividad biológica de la Gal-1-actina mediante ensayos de hemoaglutinación utilizando glóbulos rojos de conejo tratados con neuraminidasa. A su vez, mediante microscopía confocal, se demostró que ambas proteínas co-localizaban tanto en plaquetas en reposo como en las activadas con Tr. Por otro lado, se realizaron estudios mediante IFI, para estudiar la interacción de Gal-1 con sus ligandos en plaquetas tanto en reposo como activadas con Tr y Gal-1, para dilucidar posibles interacciones con Ta y otras proteínas de la MEC. También purificamos la Gal-1 plasmática, pudiendo solo realizar la caracterización parcial de la misma. En base a nuestros resultados demostramos que la Gal- 1 se encuentra en muy baja concentración en plaquetas humanas, coincidentemente con los estudios de proteómica previos. Proponemos que la Gal-1 podría generar un complejo interactivo con la actina, la Ta y otras proteínas de la MEC en las plaquetas humanas.Facultad de Ciencias Exacta

Glycopathology of Chagas Disease role of galecting in the outcome of the immune response during the experimental Trypanosoma Cruzi infection

Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular . Fecha de lectura: 17-10-200

Genes desreguladoras y celulas rebeldes: el escape de los tumores. Regulación de la expresión de genes durante el escape tumoral: implicancias en inmunoterapia

La transformación maligna de un grupo de células que lleva a la generación de tumores es sin duda uno de los procesos más complejos y desafiantes de la biología. Los eventos celulares que subyacen a este proceso emergen de alteraciones genéticas que en conjunción con señales provenientes del microambiente de esas células, dictaminan el crecimiento y progresión de un tumor. Un desajuste, un error que no puede ser reparado, conlleva a la amplificación y desinhibición de señales de crecimiento de células que aspiran a dominar tierrasFil: Rabinovich, Gabriel Adrián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Departamento de Química. Cátedra de Química Biológica; ArgentinaFil: Blidner, Ada Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin

Combinación del uso de Galectina-9 como agente reactivador de la latencia del VIH-1 y el bloqueo del receptor celular TIM-3 como estrategia global para la curación de la infección por VIH-1

Galectina-9 es capaz de modular la transcripción del VIH-1 y de reactivar al virus latente. Pero, como con otros agentes anti-latencia, esto no es suficiente para la erradicación del VIH-1 y se precisa un sistema inmune potente para su eliminación. Como se ha visto en diferentes estudios basados en la estrategia, conocida por su denominación en inglés Shock and Kill, la potencia de la respuesta CTL-VIH-1 específica es insuficiente para la eliminación de las células en las que ha sido reactivado el virus latente. Una de estas estrategias evaluadas es la inhibición de diferentes receptores que resultan ser marcadores de agotamiento funcional. En diversos estudios se ha comprobado que bloqueando estos receptores se puede restaurar la función CTL. TIM-3 es un tipo de proteína transmembrana que se expresa en múltiples células del sistema inmune. Entre los ligandos conocidos de TIM-3 se ha identificado Gal-9. La presencia de infección vírica continua se asocia con una sobreexpresión de TIM-3 en la superficie celular, con agotamiento y muerte celular consiguiente. La unión de Gal-9 a TIM-3 se asocia con la apoptosis de células CD8+, aunque si se bloquea la unión de Gal-9 y TIM-3 se mejora la respuesta CTL. Parece, por tanto, que la manipulación de la interacción de la galectina con su receptor podría mejorar las respuestas celulares a las infecciones víricas. El estudio se llevó a cabo en tres partes, en primer lugar, se analizó el efecto de Gal-9 como agente reactivador en un modelo células Jurkat-LAT-GFP y en modelos de latencia basado en IL-7; en segundo lugar, se evaluó el efecto del bloqueo de TIM-3 en la restauración de la actividad CTL de los linfocitos T CD8+ y las células NK tanto en modelos in vitro como ex vivo. Finalmente se evaluó el efecto del bloqueo de TIM-3 y el uso de Gal-9 como estrategia conjunta en modelos in vitro y ex vivo. En este trabajo se ha observado, que Gal-9 produce una reactivación eficiente del VIH-1 en células Jurkat como en el modelo celular primario de latencia. Esta reactivación no parece estar mediada vía TIM-3. Además, la potencia de Gal-9 es mayor que la de otros agentes reactivadores de la latencia (ARLs), con los que la hemos comparado. No se detectó sinergismo ni efectos aditivos al combinar Gal-9 con los otros ARLs. El bloqueo de TIM-3 en las células T-CD8+ se traduce en una mejora en el control de la replicación del virus y sin impacto detectable en las células NK. La reactivación del virus latente por Gal-9 y la mejora de la respuesta CTL mediante la inhibición de TIM-3, sin interferencia entre ellos, permitiría la administración conjunta de ambos en una estrategia shock and kill

Avaliação da presença e quantificação em porcentagem da galectina-1 no esôfago de Barrett sem displasia, através de sistema informatizado de análise de imagem

AnexosOrientador:Osvaldo MalafaiaCo:orientador: Vinicius Milani BudelDissertação(mestrado)- Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências da Saúde.Programa de Pós-Graduação em Medicina InternaInclui bibliografia e glossárioResumo: Atualmente considera-se esôfago ou epitélio de Barrett a condição pela qual o epitélio escamoso do esôfago e substituído pelo epitélio colunar especializado,o qual se caracteriza pela presença de células caliciformes tanto no epitélio de revestimento como no epitélio glandular. O esôfago de Barrett e o único fator de risco bem documentado para o desenvolvimento de adenocarcinoma do esôfago distai, o que explica a ênfase dada a essa condição pré-maligna. Existe considerável grau de subjetividade e discordância interobservadora e intraobservadora neste diagnostico. O progresso no conhecimento da biologia molecular pode permitir o aperfeiçoamento diagnostico nesta patologia. Com o objetivo de analisar novos parâmetros para complementar o diagnostico convencional das metaplasias, utilizou-se uma amostra inicial constituída de 86 biopsias endoscópicas de esôfago de Barrett,as quais foram reavaliadas independentemente por dois patologistas pelos critérios que caracterizam o esôfago de Barrett sem displasia. Após a confirmação dos laudos a amostra final foi de 60 blocos de parafina contendo esôfago de Barrett, com ausência de displasia. O restante excluído não apresentava material suficiente para a realização de novos cortes histológicos, apresentavam os tecidos sobrepostos na lamina em estudo ou material inadequadamente conservado.. Realizou-se a técnica de coloração imunohistoquimica utilizando-se o anticorpo primário policlonal de coelho-IgG anti galectina-1 e anticorpo secundário biotinilado policlonal anti IgG de coelho. O padrão de expressão da galectina 1 foi avaliado imunohistoquimicamente nas diferentes estruturas deste epitélio. A quantificação da coloração foi realizada através da citometria de imagem, pelo sistema informatizado de analise SAMBA 4000. Foram computadorizadas três variáveis: índice de mareagem, densidade optica media e heterogeneidade da amostra. Os resultados obtidos revelaram positividade de expressão do marcador utilizado nas seguintes estruturas analisadas: epitélio de revestimento, epitélio glandular e tecido conjuntivo. A diferença da media do índice de mareagem do epitélio de revestimento e tecido epitelial glandular teve um valor extremamente significante (p = 0.0004), o mesmo ocorrendo quando avaliava-se a diferença do índice de mareagem entre tecido epitelial glandular e tecido conjuntivo (p = 0.0001). Em relação a diferença de densidade óptica media entre tecido epitelial glandular e tecido conjuntivo foi considerada significante (p = 0.0001) como também foi significante esta diferença entre tecido epitelial de revestimento e tecido conjuntivo. Concluiu-se que o sistema SAMBA 4000 permite a analise quantitativa do marcador de maneira subjetiva, as quais passam a não depender unicamente da apreciação do investigador, este método pode ser utilizado em rotinas laboratoriais como técnica auxiliar no diagnostico do esôfago de Barrett sem displasia.Abstract: Nowadays, Barrett's oesophagus or epithelium is considered to be the condition in which stratified squamous epithelium is replaced by specialised columnar epithelium. Barrett's oesophagus is the only well-documented risk factor in the development of Barrett's adenocarcinoma, which explains the emphasis given to this pre-malignant condition. Diagnosis involves a high level o f both inter-observer and intra-observer subjectivity and discordance. The progress in Molecular Biology knowledge may allow both diagnostic and therapeutic perfection o f this pathology. With the objective o f analysing new parameters to complement the conventional diagnosis o f metaplasias, a sample made up of 60 paraffin blocks containing dysplasia-absent Barrett's epithelium, was used. The expression standard Galectina 1 was examined immunohistochemically in the different structures o f the epithelium. The staining quantification was carried out by image cytophotometry, using the computerised analysis system SAMBA 4000. Three variables were computed: labelling index, mean optical density and sample heterogeneity. The results obtained revealed positiveness o f expression o f the marker used in all the analysed structures. The difference in the labelling index averages of the covering epithelium and the glandular epithelial tissue was o f an extremely significant value (p = 0.0004), the same occurring when the difference in the labelling index averages o f the glandular epithelial tissue and the conjunctive tissue (p = 0.0001) was evaluated. In relation, the difference in the mean optical density of the glandular epithelial tissue and the conjunctive tissue was considered to be significant (p = 0.0001) as was the difference between covering epithelial tissue and conjunctive tissue. It was concluded that image cytophotometry is an effective auxiliary diagnostic method for quantifying immunohistochemical markers

Galectin-3 and beta-catenin expression in premalignant and carcinomatous lesions in tongue of mice

INTRODUÇÃO: A galectina-3 (GAL3) apresenta importantes papéis na biologia tumoral e recentemente foi mostrada a sua participação na via de sinalização Wnt, translocando a beta-catenina para o núcleo. Expressão alterada de GAL3 e beta-catenina tem sido descrita em cânceres, mas não há estudos avaliando a expressão de ambas em displasias e carcinomas desenvolvidos em modelos de carcinogênese de língua. OBJETIVOS: Estudar a expressão de GAL3 e beta-catenina em lesões displásicas e carcinomas induzidos experimentalmente em língua de camundongos. MATERIAL E MÉTODOS: Vinte camundongos C57BL/6 machos foram desafiados com 4NQO na água de beber por 16 semanas e sacrificados na semana 16 e 32. Após o sacrifício, as línguas foram removidas, processadas, coradas por hematoxilina e eosina (HE) para detecção de displasias e carcinomas. Ensaio imuno-histoquímico foi realizado para determinar o índice de positividade para GAL3 e beta-catenina nessas lesões, bem como uma correlação entre elas em carcinomas. RESULTADOS: O número de camundongos afetados por carcinoma aumentou entre as semanas 16 e 32 (22,2% vs. 88,9%) e o de displasia diminuiu (66,7% vs. 11,1%). Um aumento de células positivas para beta-catenina não membranosa e GAL3 citoplasmática foi observado nas displasias e nos carcinomas, mas essa diferença não foi estatisticamente significativa. No entanto, um aumento estatisticamente significativo de GAL3 nuclear foi observado na evolução de displasia para carcinoma (p = 0,04). Nenhuma correlação foi encontrada entre beta-catenina e GAL3. CONCLUSÃO: Tanto nas displasias quanto nos carcinomas a via de sinalização Wnt está ativa, e o aumento de GAL3 nuclear nos carcinomas sugere um papel na transformação maligna do epitélio lingual.INTRODUCTION: Galectin-3 plays pivotal role in tumor biology and its participation in Wnt signaling pathway translocating beta-catenin into the nucleus has been recently demonstrated. Altered galectin-3 and beta-catenin expressions have been described in different tumors, however, there are no studies evaluating their expression in dysplasias and carcinomas induced in carcinogenic tongue models. OBJECTIVES: To study galectin-3 and beta-catenin expressions in dysplasias and carcinomas experimentally induced in mouse tongue. METHODS: Twenty C57Bl/6 male mice were treated with 4NQO in their drinking water for 16 weeks and sacrificed at weeks 16 and 32. Tongues were removed, routinely processed, and stained with hematoxylin and eosin to detect dysplasias and carcinomas. An immunohistochemical assay was performed to determine the level of positivity for galectin-3 and beta-catenin in these lesions as well as their correlation in carcinomas. RESULTS: The number of mice affected by carcinomas increased from week 16 to week 32 (22.2% vs. 88.9%) and the number affected by dysplasias decreased (66.7% vs. 11.1%). There was an increase in non-membranous beta-catenin- and cytoplasmic galectin-3-positive cells in dysplasias and carcinomas, although this difference was not statiscally significant. Nonetheless, there was a significant increase of nuclear galectin-3-positive cells in the evolution from dysplasia to carcinoma (p = 0.04). There was no correlation between beta-catenin and galectin-3. CONCLUSION: Wnt signaling pathway is active in both dysplasias and carcinomas and the increase of nuclear galectin-3-positive cells in carcinomas suggests its influence on malignant transformation in the tongue epithelium.(FAPEMIG) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerai