The evaluation and interpretation of controls used in three commercially available quantification kits for forensic DNA analysis

This research presented an idea to aid crime laboratories in the selection of the best quantification method for use in DNA analysis in their laboratory. The goal of this research was to evaluate the suitability of using an external reference standard, the NIST SRM 2372 Human Quantitation Standard, to increase the quality of quantification results of human DNA analysis in commercially available kits. Additionally, the DNA standard included with the commercial kit, used for developing a standard curve, was evaluated for accuracy and stability beyond the recommended time frame. The commercial quantification kits tested were: QuantifilerRTM Trio DNA Quantification Kit (Applied Biosystems(TM), Life Technologies), PlexorRTM HY System (Promega Corporation), and InvestigatorRTM Quantiplex HYres (Qiagen). It was found that generally the concentration of the NIST SRM 2372 was not accurately quantifying in all three quantification kits. Furthermore, it was found that each standard curve dilution series varied in accuracy, as well as stability

Association of AURKA polymorphisms with prostate cancer risk

Die vorliegende Diplomarbeit ist ein Teil des Projekts „Molekulare Epidemiologie von Prostatakrebs“, einer Zusammenarbeit der Abteilung für angewandte und experimentelle Onkologie des Instituts für Krebsforschung sowie der urologischen Abteilungen der Medizinischen Universität Wien, des Sozialmedizinischen Zentrums Süd und des Sozialmedizinischen Zentrums Ost. Ziel dieser Studie ist es, ein polygenetisches Modell zu entwickeln, um Hochrisikopatienten identifizieren zu können und neue Perspektiven in der Prävention und der Therapie des Prostatakrebses zu eröffnen. Prostatakrebs stellt die häufigste bösartige Neubildung bei Männern in Österreich dar. In dieser Diplomarbeit wurden vier Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), welche im AURKA-Gen lokalisiert sind, genotypisiert. Das Gen für AURKA (Aurora Kinase A), eine Serin/Threonin-Proteinkinase, befindet sich am Chromosom 20q13, einem bekannten Prostatakrebs-Suszeptibilitätslokus. AURKA ist an einigen ausschlaggebenden Vorgängen während der Mitose beteiligt. Genetische Polymorphismen im AURKA-Gen tragen zu interindividuellen Unterschieden in der Chromosomenstabilität bei und beeinflussen dadurch das Prostatakrebsrisiko. Die Studienpopulation dieser fortlaufenden Studie besteht aus 1027 Prostatakrebsfällen und 550 Kontrollpatienten mit benigner Prostatahypoplasie (BPH). Vier ausgewählte tagging SNPs (rs2180691, rs8117896, rs1468055, rs1476394) wurden mit Hilfe des T5’ Nuclease TaqMan MGB Assay bestimmt. Zusammenfassend wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen den untersuchten SNPs und dem Prostatakrebsrisiko gefunden. Jedoch zeigte eine Haplotypenanalyse ein reduziertes Prostatakrebsrisiko (OR: 0,7021; 95% CI: 0,49599-0,99384) für Männer unter 64 Lebensjahren mit einem GCAC Haplotyp. Weitere Untersuchungen in größeren Studienpopulationen sind nötig, um den Einfluss von Polymorphismen im AURKA-Gen auf das Prostatakrebsrisiko festzustellen.The present diploma thesis is part of the project “Molecular Epidemiology of Prostate Cancer”, a collaboration of the Department of Applied and Experimental Oncology of the Institute of Cancer Research and the Departments of Urology of the Medical University Vienna, Sozialmedizinisches Zentrum Süd and Sozialmedizinisches Zentrum Ost. Aim of this study is to create a polygenetic model to identify high-risk patients and to open new perspectives in prevention and therapy of prostate cancer. Prostate cancer is the most common malign neoplasm in men in Austria. In this diploma thesis four single nucleotide polymorphisms (SNPs) within the AURKA gene were genotyped. AURKA (Aurora Kinase A), a serin/threonin protein kinase, is located on chromosome 20q13, a known prostate cancer susceptibility locus, and is involved in some crucial events during mitosis. Genetic polymorphisms in AURKA gene may contribute to interindividual differences in chromosomal stability and therefore influence the risk of prostate cancer. The study population of this ongoing study consists of 1027 prostate cancer cases and of 550 benign prostatic hyperplasia (BPH) controls. Four selected tagging SNPs (rs2180691, rs8117896, rs1468055, rs1476394) were determined using -T5’ nuclease TaqMan MGB Assay. Overall, no significant association could be found between the investigated SNPs and prostate cancer risk. However, a haplotype analysis revealed a reduced prostate cancer risk (OR: 0.7021; 95% CI: 0.49599-0.99384) for men below 64 years of age with the GCAC haplotype. Further investigations in larger study populations are required to assess the influence of polymorphisms in the AURKA gene on prostate cancer risk

Fine mapping of susceptibility loci to malaria clinical episodes in a family-based cohort from Senegal

O parasita da malária, P. falciparum, mata na ordem de um milhão de crianças Africanas em cada ano, e esta é uma pequena fracção do número de pessoas infectadas em todo o mundo. A evolução clínica de uma infecção por este parasita depende em certa medida, da constituição genética do indivíduo infectado. O papel dos factores genéticos que regulam a gravidade da infecção da malária tem sido repetidamente demonstrado em humanos e animais. Os estudos de associação são realizados com o objectivo de identificar os genes implicados na causalidade do resultado da infecção. Foi detectado anteriormente, linkage no cromossoma humano 5p15 ao número de ataques de Plasmodium falciparum (PFA) em Dielmo, uma aldeia senegalesa [48]. Posteriormente, e antes deste estudo, um levantamento usando um ensaio "GoldenGate" da Illumina, com cerca de 1.450 SNPs foi realizada na região de Linkage com o fenótipo PFA. A análise foi realizada com três programas estatísticos baseados na família: Merlin, QTDT e FBAT/PBAT. Estes programas identificaram três genes candidatos associados com o fenótipo PFA: três SNPs (rs4867417, rs7714218 e rs11959398), localizados no gene PDZD2, um SNP (rs11134099) no gene ADAMTS16, e outro (rs3777320) localizado no gene SEMA5A. O objectivo deste estudo foi investigar estas associações. Os SNPs das regiões destes genes candidatos foram escolhidos por sequenciação de exões situados na região candidata ou por análise bioinformática utilizando dados do HapMap da população Yoruba. O estudado para genotipagem foi através das análises de pré-design ou “Custom” dos SNPs (Applied Biosystems). Os dados foram incluídos num banco de dados e a verificação dos erros de transmissão mendeliana foi efectuada. As análises estatísticas foram realizadas utilizando dois programas de associação familiar, PBAT e QTDT. Foram utilizados diferentes modelos de transmissão de alelos e foi definido como limite de significância p-value = 10-3. As análises de SNPs dos genes PDZD2 e ADAMTS16 não confirmaram a associação, mas encontrou-se associação significativa com SNPs do gene SEMA5A. Um SNP (rs3777325) foi significativamente associado com o fenótipo PFA usando ambos os programas (p-value= - 6.49x10-4 usando o programa PBAT e p-value = 2.0x10-4 usando o programa QTDT). A análise de haplótipos de dois SNPs adjacentes (rs4541632 e rs1018956), também mostrou uma associação significativa do haplótipo GC (p-value= -6.82x10-5) utilizando o programa PBAT. Este estudo confirma que o locus de susceptibilidade para o fenótipo PFA está localizado no gene SEMA5A. Mais estudos serão necessários para replicar essa associação e identificar o polimorfismo causal.The malaria parasite, P. falciparum, kills on the order of a million African children each year, and this is a small fraction of the number of infected individuals world-wide. The clinical outcome of an infection by this parasite depends to some extent on the genetic makeup of the infected individual. The role of genetic factors that regulate the severity of malaria infection has been repeatedly demonstrated in humans and animals. Association studies are conducted with the aim of identifying the causal genes implicated in the outcome of infection. Linkage was previously detected on human chromosome 5p15 controlling the number of Plasmodium falciparum attacks (PFA) in Dielmo, a Senegalese village [48]. Subsequently, and prior to this present study, a fine mapping study using a "GoldenGate assay” from Illumina, with about 1450 SNPs was performed in this region of linkage with PFA phenotype. Analysis was performed with three statistical family-based programs: Merlin, QTDT, and FBAT/PBAT. These programs identified three candidate genes associated with PFA phenotype: three SNPs (rs4867417, rs7714218, and rs11959398) located in PDZD2, one SNP (rs11134099) in ADAMTS16, and one (rs3777320) in SEMA5A. The aim of this present study was to investigate these associations. Novel SNPs in the candidate regions of these genes were selected either by sequencing exons located in these candidate regions or by bioinformatics analysis using HapMap data from Yoruba population. SNPs were studied using either Pre-design or Custom SNP genotyping assay (Applied Biosystems). Data were included in an Access Database and checked for error of Mendelian transmission. Statistical analyses were performed using two family-based association programs, PBAT and QTDT. We used different models of allele transmission and defined p=10-3 as significance threshold. The analyses did not confirm the association with SNPs of PDZD2 or ADAMTS16, but did find significant association with SNPs of SEMA5A. One SNP (rs3777325) was significantly associated with PFA phenotype using both programs (p-value= -6.49x10-4 using the PBAT program and p-value=2.0x10-4 using the QTDT program). A haplotype analysis of two adjacent SNPs (rs4541632 and rs1018956) also showed a significant association of the haplotype GC (p-value= -6.82x10-5) using the PBAT program. This work confirms that a susceptibility locus to PFA phenotype is located inside SEMA5A. Further studies will be necessary to replicate this association and identify the causal polymorphism

Association of TERT polymorphisms with colorectal polyps and colorectal cancer risk

Die vorliegende Diplomarbeit ist Teil des laufenden Projekts „Molekulare Epidemiologie des kolorektalen Karzinoms” mit dem Ziel, ein polygenetisches Modell zu entwickeln um Patienten mit hohen Risikoprofilen zu identifizieren und neue Ansätze in der Prävention und Therapie des kolorektalen Karzinoms (KRKs) zu entwickeln. Mit über 4500 Neuerkrankungen jährlich zählt das KRK zu den häufigsten Krebserkrankungen in Österreich. Das Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) Gen ist verantwortlich für die Erhaltung und Stabilität der Telomere in Krebszellen. Genetische Polymorphismen im TERT Gen könnten die chromosomale Stabilität und folglich das Risiko für Kolonpolypen und dem KRK beeinflussen. Das KRK ist eine multifaktorielle Erkrankung. Neben umweltbedingte Risikofaktoren können auch genetische Prädispositionen zur Entstehung des Tumors führen. Zu den genetischen Faktoren zählen seltene, hochpenetrante Mutationen sowie häufig vorkommende genetische Polymorphismen. In einer Fall-Kontroll Studie, bestehend aus 182 KRK Patienten, 332 Patienten mit Hochrisiko-Polypen, 1065 Patienten mit Niedrigrisiko-Polypen und 1822 Teilnehmern mit einem negativen Koloskopiebefund wurden die Genotypen von fünf ausgewählten “Single Nucleotide Polymorphisms” (SNPs) im TERT Gen, mittels dem 5’ Nuklease TaqMan MGB Assay bestimmt. Es konnte kein Zusammenhang zwischen den genotypisierten SNPs und einem veränderten KRK Risiko nachgewiesen werden. Homozygote Träger des intronischen SNPs rs2075786 wurden jedoch mit einem signifikant erhöhten Risiko für Hochrisiko-Polypen assoziiert. Die Ergebnisse dieser Studie weisen auf einen möglichen Einfluss genetischer Varianten auf die Suszeptibilität für Kolonpolypen hin. Weitere Studien in größerem Ausmaß sind jedoch erforderlich um rs2075876 als Biomarker zu validieren und den Einfluss von multiplen Polymorphismen in Telomerstabilitäts-Genen auf das kolorektale Polypen und KRK Risiko zu untersuchen.The present diploma thesis is part of the project “Molecular Epidemiology of Colorectal Cancer”, and intends to develop a polygenic model of biomarkers in order to identify high-risk individuals and offer new insights into the prevention and treatment of colorectal cancer (CRC). With more than 4500 new incidence cases a year CRC represents one of the most common cancers in Austria. The telomerase reverse transcriptase (TERT) gene is essential for telomere length maintenance and stability in cancer cells. Genetic polymorphisms in the TERT gene may contribute to interindividual differences in the chromosomal stability and as a result influence individual colorectal polyp and CRC susceptibility. CRC is a multifactorial disease, environmental factors and genetic predisposition contribute to its development. Genetic factors include rare, but highly penetrant mutations and the more common genetic polymorphisms. In a case-control study, consisting of 182 colorectal carcinoma patients, 332 high-risk polyp patients, 1065 low-risk polyp patients and 1822 colonoscopy negative controls, five selected single nucleotide polymorphisms (SNPs) within the TERT were genotyped using the 5’ nuclease TaqMan MGB Assay. No significant overall association was found for the genotyped SNPs and colorectal cancer risk. However, a significant increased risk for high-risk polyps was seen among homozygous carriers of the intronic SNP rs2075786. As a consequence, these results suggest potential involvement of genetic variation in susceptibility to colonic polyps. However, investigations in larger cohorts are required to establish rs2075786 as a possible biomarker for high-risk colonic polyps, and to further characterize the effect of multiple genetic polymorphisms within telomere stability genes on colonic polyps and CRC risk

Operatives Trauma des Darmes bei der Osteopetrosis-Maus : Bedeutung der intestinalen Muskularis-Makrophagen

Abdominelle Operationen bewirken eine massive Entzündungsreaktion in der Darmwand, die unter anderem zur postoperativen Darmatonie führt. Der postoperative Ileus als fortgeschrittene Form der Darmatonie ist eine alltägliche Komplikation der Abdominalchirurgie und stellt somit klinisch, aber auch ökonomisch ein höchst relevantes Krankheitsbild dar. Die zugrunde liegenden Pathomechanismen der postoperativen Darmatonie sind trotz ihres alltäglichen Charakters und vieler Erklärungshypothesen weitgehend unbekannt, somit beschränkt sich deren Behandlung auf symptomatisch-empirische Maßnahmen. Um eine kausale Therapie und darüber hinaus eine Prävention entwickeln zu können, müssen die initialen Schritte der Entstehung des postoperativen Ileus genau erforscht werden. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe legen nahe, dass residente Muskularis-Makrophagen eine entscheidende Rolle in der Entstehung der postoperativen Entzündungsreaktion in der intestinalen Tunica muscularis spielen. Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob das vollständige Fehlen der Muskularis-Makrophagen zu einer Reduktion der postoperativen Muskularis-Entzündung und nachfolgend zu einer normalisierten Muskelfunktion führt. Verwendet wurden Osteopetrosis-Mäuse mit komplett fehlenden Makrophagen innerhalb der Tunica muscularis des Darmes, bei verminderter Anzahl der Makrophagen in der Mukosa und in anderen Organen. Osteopetrosis-, Wildtyp- und heterozygote Mäuse wurden einer standardisierten Manipulation des Dünndarms ausgesetzt und 3 und 24 Stunden postoperativ untersucht. Als Kontrollen dienten nicht operierte Tiere. Muskularis-Präparate wurden für histochemische und immunhistochemische Färbungen zur Phagozyten-Quantifizierung resp. Makrophagenlokalisation verwendet. Die Expression von Entzündungsmediatoren wie MIP-1α, IL-6, COX-2, ICAM-1 und MCP-1 in der Darmwand wurde zu verschiedenen Zeitpunkten postoperativ mittels real-time PCR quantifiziert. Weiterhin wurde die in vitro Muskelkontraktilität im Organbad an Jejunumstreifen gemessen. Der gastrointestinale Transit wurde in vivo nach intragastrischer Gabe von Fluoreszenz-markiertem Dextran bestimmt. Histochemisch zeigte sich bei allen drei manipulierten Gruppen ein signifikanter Anstieg der Phagozyten in der Tunica muscularis im Vergleich zu nicht manipulierten Tieren. Bei den Osteopetrosis-Mäusen war diese Zunahme signifikant geringer (43-fach vs. 180-fach Wildtyp und 176-fach Heterozygote). Die Darmmanipulation bewirkte bei Heterozygoten und Wildtypmäusen eine massive Expression der untersuchten Entzündungsmediatoren in der Tunica muscularis mit einem Maximum nach drei Stunden. Bei den Osteopetrosis-Mäusen war die Mediatoraktivierung signifikant vermindert (MIP-1α: 12,1-fach; IL-6: 3,5-fach; COX-2: 2,3-fach; ICAM-1: 6,7-fach und MCP-1: 18,8-fach). Bei der in vitro Kontraktilitätsmessung war bei Osteopetrosis-Mäusen die bekannte postoperative Minderung der glatten Muskelfunktion signifikant geringer ausgeprägt (13,6 % vs. 41 % Wildtyp und 36,4 % Heterozygote). In dem in vivo GIT wiesen die Osteopetrosis-Tiere bei normalisierter Transitzeit (GC ± SEM: 10,09 ± 0,70 vs. 3,2 ± 0,30 für Wildtyp und 4,7 ± 0,35 für Heterozygote) keine signifikante Auswirkung des chirurgischen Darmtraumas auf. Unsere Daten zeigen eindeutig, dass durch das komplette Fehlen der Muskularis-Makrophagen bei der Osteopetrosis-Maus sowohl die lokale Entzündungsreaktion der Darmwand als auch die resultierende Motilitätsstörung nach chirurgischem Trauma signifikant gemindert sind. Diese Ergebnisse verdeutlichen die herausragende Rolle der residenten Muskularis-Makrophagen bei den initialen Schritten der Pathogenese des postoperativen Ileus

White-pink transdifferentiation: in search of the molecular mechanisms involved in the adipoepithelial transdifferentiation in the mouse adipose organ.

L'organo adiposo dei mammiferi è caratterizzato da grande plasticità. Dopo acclimatazione al freddo, ad esempio, gli adipociti bianchi possono trasformarsi in adipociti bruni che producono calore per sostenere le esigenze termogenetiche del corpo. Al contrario, sotto sovraccarico lipidico, gli adipociti bruni possono transdifferenziare in adipociti bianchi che immagazzinano lipidi per tamponare l'eccesso di nutrienti introdotti con gli alimenti. Recentemente abbiamo raccolto dati nella ghiandola mammaria di topi femmine gravide, gli adipociti bianchi non delipidano e acquisiscono una posizione pericitica, come si pensa, ma invece transdifferenziano in cellule epiteliali alveolari che producono latte. In particolare, tale transdifferrenziazione è reversibile, perché alla fine della lattazione le cellule epiteliali alveolari rapidamente riconvertono in adipociti bianchi che accumulano lipidi. Nel tentativo di comprendere i segnali molecolari coinvolti nel processo di transdiffernziazione adipo-epiteliale, abbiamo ricreato un sistema di cocultura dove siamo stati in grado di riprodurre in qualche misura la transdifferenziazione di adipo-epiteliale. L'analisi molecolare dei fattori che intervengono nel nostro sistema sperimentale ha evidenziato il possibile ruolo del Fibroblast Growth Factor come un possibile candidato in grado di indurre la transdifferenziazione adipo-epiteliale anche in vivo.The mammalian adipose organ is characterized by great plasticity. After cold acclimation, for example, white adipocytes can convert into heat-producing brown adipocytes to sustain the thermogenetic needs of the body. Conversely, under lipid overload brown adipocytes transdifferentiate into lipid-storing white adipocytes to buffer the excess of nutrients introduced with the aliments. We recently collected evidences that in the mammary gland of pregnant female mice, white adipocytes do not slim, dedifferentiate and acquire a pericytic position, as generally thought, but instead do transdifferentiate into milk-producing epithelial alveolar cells. Notably, such a transdifferentiation is reversible, because at the end of lactation alveolar epithelial cells quickly re-convert to lipid-storing white adipocytes. In the attempt to detect the molecular cues involved in the adipoepithelial transdifferentiation process we established a coculture system where we were able to reproduce to a some extent the adipoepithelial transdifferentiation. The analysis of the molecular players intervenying in our experimental setting stressed the possible role of the basic Fibroblast Growth Factor as a possible candidate directing adipoepithelial transdiffferentiation also in vivo

Polymorphismen im Toll-like-Rezeptor-Signaltransduktionsweg bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie

Die Dissertation „Polymorphismen im Toll-like-Rezeptor-Signaltransduktionsweg bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie“ befasst sich in einer Fall-Kontroll-Assoziationsstudie mit verschiedenen Kandidatengenen des Toll-like-Rezeptor-Signaltransduktionswegs. Es soll untersucht werden, ob Varianten dieser Gene ein genetisches Risiko für die Entwicklung des Krankheitsbildes der dilatativen Kardiomyopathie in sich bergen. Patienten mit DCM werden in allen koronarangiographisch tätigen Kliniken und Praxen des Einzugsgebietes des populationsgenetischen Projektes PopGen in Schleswig-Holstein identifiziert und werden zur Teilnahme gebeten. Anschließend soll den Probanden, welche eingewilligt haben, Blutproben entnommen werden sowie epidemiologische und krankheitsbezogene Daten in Form eines Fragebogens erhoben werden. Ergänzungen zur Krankengeschichte werden aus den Patientenakten herangezogen, um die Datenlage zu vervollständigen. Aus den Blutproben wird die DNA extrahiert und genotypisiert. Alle Daten werden in ein Datenbanksystem eingepflegt, verwaltet und ausgewertet. So sollen Unterschiede in den Allelfrequenzen der untersuchten Einzelbasenpolymorphismen der ausgewählten Gene zwischen der Fallgruppe und einer Kieler Kontrollgruppe ermittelt werden, um Gene des Toll-like-Rezeptor-Signaltransduktionsweg bezüglich einer Assoziation mit einer DCM zu identifizieren