Modélisation métabolique à l’échelle du génome de la bactérie quasi-minimale Mesoplasma florum

Des avancées significatives au niveau de la synthèse et de l’assemblage de fragments d’acide désoxyribonucléique (ADN), le support physique des fonctions cellulaires encodées dans une cellule vivante, permettent maintenant la construction de génomes entiers. Ce progrès permet d’imaginer que la conception d’organismes synthétiques deviendra routinière au cours des prochaines années. Cette capacité promet de transformer radicalement le domaine de la biologie en formant une nouvelle discipline d’ingénierie biologique. Parmi les retombées anticipées, on note le remplacement de synthèses chimiques par des procédés biologiques renouvelables tels que la production de biocarburants, la synthèse de médicaments microbiens, ou des approches alternatives pour le traitement des maladies. Dans ce contexte, il devient particulièrement important d’arriver à prédire correctement le phénotype résultant des génomes qui seront générés. Pour y arriver, il convient de réduire la complexité biologique en travaillant d’abord avec les cellules les plus simples possibles. Ce type d’organisme ayant subi un processus de réduction de génome et dont la majorité des gènes sont essentiels afin de survivre en conditions définies se nomme une cellule minimale. Le groupe phylogénétique des mollicutes, bactéries dépourvues de paroi cellulaire, contient les espèces vivant avec les plus petits génomes connus à ce jour. Membre de ce groupe, le pathogène humain Mycoplasma genitalium possède le plus petit génome capable de croissance autonome (560kbp codant pour 482 protéines. Cependant, sa pathogénicité et sa vitesse de croissance réduite (~24h) limitent l’applicabilité de M. genitalium en biologie synthétique. Pour remédier à ce problème, notre laboratoire a choisi de travailler avec Mesoplasma florum dont le temps de doublement est très rapide (~32 min) et qui ne cause pas de maladies chez l’humain. Les travaux effectués chez M. florum permettent maintenant le clonage et la transplantation de son génome et des travaux récents ont permis de caractériser les propriétés physico-chimiques de sa cellule ainsi que plusieurs paramètres biologiques. Afin de permettre la conception de génomes synthétiques basés sur M. florum, il convient d’intégrer un maximum de connaissances dans un cadre informatique structuré capable de générer des prédictions phénotypiques. Un modèle métabolique à l’échelle du génome (GEM) reposant sur la méthode d’analyse des flux à l’équilibre (FBA) représente un format particulièrement intéressant pour initier ces travaux de biologie des systèmes. La qualité des prédictions générées par ce type de modèle est dépendante de la précision de l’objectif à atteindre. Pour simuler la croissance, les GEMs doivent satisfaire un objectif nommé “fonction objective de biomasse” (BOF) qui contient l’ensemble des métabolites nécessaires à la production d’une nouvelle cellule avec des coefficients stœchiométriques représentatifs de l’abondance de ces composantes dans la cellule. Pendant mon parcours de doctorat, j’ai développé le logiciel BOFdat qui permet la définition d’une BOF représentative de la composition cellulaire spécifique à une espèce avec les données expérimentales associées. Les deux premières des trois étapes de BOFdat déterminent les coefficients stoechiométriques de molécules connues pour faire partie de la composition cellulaire telles que les macromolécules principales (étape 1, ADN, ARN et protéines) et les coenzymes essentiels (étape 2). L’étape 3 de BOFdat propose une méthode non-biaisée pour déterminer les métabolites susceptibles d’améliorer la prédiction d’essentialité des gènes formulée par le modèle. Pour ce faire, un algorithme génétique maximise la composition de la biomasse en fonction des données d’essentialité expérimentales à l’échelle du génome. BOFdat a été validé en reconstruisant la BOF du modèle iML1515 de la bactérie modèle Escherichia coli. L’utilisation de BOFdat a permis de récapituler le taux de croissance prédit avec la BOF originale tout en améliorant la qualité des prédictions d’essentialité de gènes de iML1515. BOFdat est disponible en libre accès pour quiconque désire construire une BOF pour un modèle métabolique. Ensuite, un GEM nommé iJL208 a été produit et contient 208 des 676 protéines représentant l’ensemble du métabolisme de M. florum. La qualité de l’annotation du génome a d’abord été évaluée en intégrant l’information obtenue par trois approches bio-informatiques, révélant que la majorité des protéines (418/676) ont une qualité suffisante pour être incorporées dans le modèle. Ensuite, les réactions ont été identifiées et rigoureusement incorporées une à la fois afin de construire le réseau métabolique de cette bactérie quasi-minimale. L’étude de la carte métabolique reconstruite révèle une dépendance prononcée pour l’import de composantes à partir du milieu de culture ainsi que l’importance des mécanismes de recyclage des métabolites. Pour sa production d’énergie, M. florum est entièrement dépendante de la glycolyse et ne possède pas la machinerie nécessaire à la respiration cellulaire. L’élaboration d’un milieu de culture semi-défini a réduit la présence de sucres contaminants dans le milieu de culture initial et ainsi de distinguer la croissance avec ou sans supplémentation de sucrose. Cette avancée importante a permis de mesurer les taux d’assimilation de sucrose et de production des déchets métaboliques lactate et acétate. Ces paramètres ont été utilisés afin de contraindre le modèle et de mieux comprendre la sensibilité du modèle à une variété de paramètres. Aussi, la croissance de M. florum a pu être validée expérimentalement avec différents sucres. L’information contextuelle obtenue, combinée à une analyse de structures tridimensionnelles de protéines clés, a permis de suggérer des hypothèses crédibles supportant l’assimilation de ces sucres par M. florum. Finalement, iJL208 a été utilisé afin de formuler une prédiction de génome minimal pour M. florum en simulant itérativement de larges délétions dans son génome. Combiner l’intégration de données expérimentales avec les prédictions du modèle constitue une voie d’avenir pour la conception de génomes synthétiques qui rejoint les capacités techniques d’assemblage de chromosomes en biologie synthétique. Globalement, les projets réalisés au cours de mon doctorat contribuent à l’avancement de la biologie des systèmes chez M. florum dans le but de prédire efficacement les phénotypes de la souche naturelle et de variants synthétiques qui pourront être produits au cours des prochaines années

Une approche de modélisation de biologie des systèmes sur la spondylarthrite

Spondyloarthritis is a frequent chronic inflammatory rheumatism, with a prevalence of 0.43 % in France. This disease presents axial skeleton injuries, but also on peripheral joints, and can results in a total spinal and sacro-iliac motility loss. Extra-articular features including uveitis, psoriasis and inflammatory bowel disease are frequent. Current SpA treatments are only symptomatic, relieving inflammatory symptoms. SpA etiology is largely multifactorial with a genetic component dominated by the long-known strong association with the HLA-B27 allele. This allele, however, is not sufficient for the disease to occur. This thesis project objective was then to identify other genetic factors in the origin of SpA.My work was mainly divided in two complementary data analyses, in a way to get a systems biology approach. The first one consisted in proceed linking analyses on data from Affymetrix genotyping chips gathered from DNA of 1310 people grouped in 210 families. This study allowed notably to detect a new significantly linked region to SpA : 13q13, with an interval of 1.3 Mb. This part of genome is currently being sequenced to allow a better causal SNP identification.Secondly, an Affymetrix HumanGene 1.0 st transcriptomic chips analysis was performed on MD-DCs extracted from 68 people, stimulated or not by LPS during 6 or 24 hours. This cohort was grouped between 23 patients HLA-B27+, 23 healthy controls HLA-B27+ and 21 healthy controls HLA-B27-. I could notice that HLA-B27 allele is farly enough to considerably affect cell transcriptomic profiles, which encourages to include HLA-B27+ healthy controls. Otherwise, a gene network analysis allowed me to highlight on an inhibition of early steps of cholesterol biosyntthesis.La Spondyloarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent, avec une prévalence de 0,43 % en France. Elle consiste en une atteinte prédominante du squelette axial, mais aussi des articulations périphériques, et peut conduire à une immobilité du rachis et des articulations sacro-iliaques. Des atteintes extra-articulaires sont fréquentes, telles qu'une uvéite, un psoriasis ou une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Les traitements actuels ne sont que symptomatiques, ciblant principalement les manifestations inflammatoires. L'étiologie de la SpA est multifactorielle avec une composante génétique dominée par l'association forte et bien connue avec l'allèle HLA-B27. Cependant, ce facteur génétique n'est clairement pas suffisant pour induire le développement de la maladie. L'objectif de ce projet de thèse était donc d'identifier d'autres facteurs génétiques à l'origine du développement de la SpA.Mon travail a porté sur l'analyse de deux jeux de données complémentaires, dans une perspective de biologie des systèmes. Dans une première partie, j'ai conduit une analyse de liaison dans 210 familles atteintes de la maladie représentant 1310 personnes génotypées avec des puces Affymetrix 250k. Une nouvelle région significativement liée à la SpA a été détectée en 13q13, avec un intervalle de 1,3 Mb défini par des haplotypes recombinants chez les patients.Ensuite, une analyse transcriptomique des cellules dendritiques dérivées des monocytes de 23 patients HLA-B27+, 23 témoins sains HLA-B27+ et 21 témoins sains HLA-B27-, et stimulées ou non par du LPS, a tenté de distinguer les gènes dont l'expression est modifiée par la maladie de ceux influencés par l'allèle HLA-B27 seul. L'annotation fonctionnelle et une analyse par réseau de gènes ont mis en évidence l'inhibition chez les patients des étapes précoces de la biosynthèse du cholestérol

Développement de méthodes bioinformatiques dédiées à la prédiction et l'analyse des réseaux métaboliques et des ARN non codants

L'identification des interactions survenant au niveau moléculaire joue un rôle crucial pour la compréhension du vivant. L'objectif de ce travail a consisté à développer des méthodes permettant de modéliser et de prédire ces interactions pour le métabolisme et la régulation de la transcription. Nous nous sommes basés pour cela sur la modélisation de ces systèmes sous la forme de graphes et d'automates. Nous avons dans un premier temps développé une méthode permettant de tester et de prédire la distribution du flux au sein d'un réseau métabolique en permettant la formulation d'une à plusieurs contraintes. Nous montrons que la prise en compte des données biologiques par cette méthode permet de mieux reproduire certains phénotypes observés in vivo pour notre modèle d'étude du métabolisme énergétique du parasite Trypanosoma brucei. Les résultats obtenus ont ainsi permis de fournir des éléments d'explication pour comprendre la flexibilité du flux de ce métabolisme, qui étaient cohérentes avec les données expérimentales. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à une catégorie particulière d'ARN non codants appelés sRNAs, qui sont impliqués dans la régulation de la réponse cellulaire aux variations environnementales. Nous avons développé une approche permettant de mieux prédire les interactions qu'ils effectuent avec d'autres ARN en nous basant sur une prédiction des interactions, une analyse par enrichissement du contexte biologique de ces cibles, et en développant un système de visualisation spécialement adapté à la manipulation de ces données. Nous avons appliqué notre méthode pour l'étude des sRNAs de la bactérie Escherichia coli. Les prédictions réalisées sont apparues être en accord avec les données expérimentales disponibles, et ont permis de proposer plusieurs nouvelles cibles candidates.The identification of the interactions occurring at the molecular level is crucial to understand the life process. The aim of this work was to develop methods to model and to predict these interactions for the metabolism and the regulation of transcription. We modeled these systems by graphs and automata.Firstly, we developed a method to test and to predict the flux distribution in a metabolic network, which consider the formulation of several constraints. We showed that this method can better mimic the in vivo phenotype of the energy metabolism of the parasite Trypanosoma brucei. The results enabled to provide a good explanation of the metabolic flux flexibility, which were consistent with the experimental data. Secondly, we have considered a particular class of non-coding RNAs called sRNAs, which are involved in the regulation of the cellular response to environmental changes. We developed an approach to better predict their interactions with other RNAs based on the interaction prediction, an enrichment analysis, and by developing a visualization system adapted to the manipulation of these data. We applied our method to the study of the sRNAs interactions within the bacteria Escherichia coli. The predictions were in agreement with the available experimental data, and helped to propose several new target candidates.BORDEAUX1-Bib.electronique (335229901) / SudocSudocFranceF

Caractérisation de l'étiologie génétique de patients atteints de différentes maladies neuromusculaires par l’intégration de données omiques

Les progrès des technologies de séquençage ont joué un rôle important dans le diagnostic moléculaire des maladies rares, telles que les myopathies et les dystrophies musculaires. Cependant, plusieurs patients atteints de maladies neuromusculaires restent sans diagnostic. Ceci est dû à la grande hétérogénéité clinique et génétique ainsi qu'au caractère hautement polymorphique des gènes associés à ces troubles. L'interprétation des données génétiques est un grand défi et les tests génétiques aboutissent souvent à l'identification de variants de signification inconnue (VUSs). Plusieurs de ces variants peuvent perturber l'épissage normal de l'ARN ou affecter l'expression des gènes. À cet égard, nous proposons une approche bio-informatique. Notre objectif est de mettre en place un pipeline identifiant et caractérisant des variants d'intérêt dans un contexte pathologique. Afin de déterminer si les variants ont un impact fonctionnel, notre pipeline se concentre sur l'épissage alternatif ainsi que sur l'intégration des données génomiques et transcriptomiques. Nous émettons l'hypothèse qu'une partie des patients sans diagnostic pour leur maladie neuromusculaire s'explique par des variants introniques jouant un rôle régulateur ou affectant l'épissage et l'abondance de l'ARNm. Cette approche multi-omique permet de déterminer si les variants ont un impact fonctionnel. Pour ce faire, nous avons réalisé un séquençage de l'ARN et de l'ADN à partir de biopsies musculaires de quatre patients. Les données ont été alignées et annotées avec différents scores de pathogénicité. Les événements d'épissage sont analysés par SpliceAI et rMATS. L'analyse des gènes différentiellement exprimés a été réalisée par l'outil LPEseq. Les CNVs et les expansions de répétitions ont été analysés avec CNVkit et ExpansionHunter. Plusieurs scripts maison filtrent et intègrent les données ARN et ADN. Pour l'instant, un total de huit variants pathogéniques sont proposés pour nos patients, mais des investigations supplémentaires sont nécessaires. Les variants recherchés sont rares et nécessitent donc un pipeline cohérent et efficace. Ce projet apportera un bénéfice significatif pour les patients en leur permettant d'obtenir un diagnostic et ainsi d'avoir accès à un meilleur suivi clinique.Advances in sequencing technologies have played an important role in the molecular diagnosis of rare diseases, such as myopathies and muscular dystrophies. However, several patients with these neuromuscular diseases remain undiagnosed. This is due to the great clinical and genetic heterogeneity as well as the highly polymorphic nature of the genes associated with myopathies and muscular dystrophies. The interpretation of genetic data is a great challenge and genetic testing often results in the identification of variants of uncertain significances (VUSs). Many of these variants can disrupt normal RNA splicing or affect gene expression. In this regard, we propose a bioinformatics approach. Our aim is to put in place a pipeline identifying and characterizing variants of interest in a pathological context. To determine if the variants have a functional impact, our pipeline focuses on alternative splicing as well as the integration of genomic and transcriptomic data. We hypothesize that a portion of patients without a diagnosis for their neuromuscular disorder is explained by intronic variants having a regulatory role or affecting mRNA splicing and abundance. This multi-omics approach will make it possible to determine whether the variants have a functional impact. To do so, we performed RNA and DNA sequencing using muscle biopsies from four patients. Data was aligned and annotated with different pathogenicity scores. Splicing events are analyzed by SpliceAI and rMATS. The analysis of the differentially expressed genes was carried out by the LPEseq tool. CNVs and repeat expansion were analyzed with CNVkit and ExpansionHunter. Several in-house scripts filter and integrate RNA and DNA data. For now, a total of eight pathogenic variants are proposed for our patients, but further investigations are needed. The variants sought are rare and therefore require a coherent and efficient pipeline to facilitate their characterization. This project will have a significant benefit for patients by allowing them to obtain a diagnosis and thus have access to better clinical follow-up

Analyse bioinformatique du contrôle des éléments transposables par les siARN chez Arabidopsis thaliana

Many mechanisms control and limit the proliferation of transposable elements (TEs) which could otherwise threaten the structural and functional integrity of the genome. In plants RNA interference (RNAi) plays an important role in this control through small RNAs that guide the expression regulation of endogenous or exogenous sequences by two types of mechanisms. The first such mechanism, shared by many eukaryotic organisms, acts at the post-transcriptionnal level to inhibit the activity of mRNA. A second type of regulation allows the transcriptional control of TEs activity through a mechanism called RNA directed DNA methylation (RdDM) which involves 24nt long siRNA ("short-interfering RNA") that guide DNA methylation specifically on TEs sequences. Furthermore, siRNAs are also involved in the progressive restoration of DNA methylation after a loss induced by mutation of the DDM1 gene (Decrease in DNA Methylation 1). The aim of this thesis is to take advantage of high-throughput sequencing technologies to characterize these TEs controls mechanisms by siRNA in the model plant Arabidopsis thaliana .At first, I developed methods and bioinformatics tools to effectively manage data produced by high-throughput sequencing of small RNA libraries. These tools, combined in a pipeline, are designed to allow the study the accumulation of siRNA corresponding to TE sequences or TE families as well as their global or detailed visualization.These tools were applied to characterize, in a wild type background, the association between siRNA and TEs in order to define factors that may explain the observed differences in siRNA abundance . These analyses were performed by taking into account both DNA methylation states and genomic context. It provides a static view of siRNA control of TEs and their impact on nearby genes. Then, analysis of small RNA libraries from mutants of the RNAi pathway was performed to better characterize the impact of DNA methylation loss on siRNA populations and to define the mechanisms involved in the production of 21nt siRNA induced in the ddm1 mutant. These comparative analyses of the TE control after loss of DNA methylation allow us to highlight the production of 24nt siRNA independently of the classical RdDM pathway and to propose a model explaining the production of 21nt siRNA in the ddm1 mutant. At last, I tried to clarify the involvement of siRNA in the restoration of DNA methylation. Changes in DNA methylation induced by ddm1 mutation were characterized as well as their transgenerational stability in an epiRIL population. The stability of DNA hypomethylation has been studied in relation to high-throughput sequencing of small RNAs data from WT, ddm1 and 4 epiRIL lines. It provides a temporal view of the TE control by siRNA. The results highlight the important role of small RNAs in the control of transposable elements in order to preserve structural and functional integrity of the genome through a variety of mechanisms depending on TE sequences. This work opens the way to the analysis of the siRNA control on TEs based on approaches that combine TEs in networks based on their shared siRNA sequences. It would allow to study "siRNA-connections" between TEs in order to explore, for example, the action in trans of siRNA in the restoration of DNA methylation defect.De nombreux mécanismes contrôlent et limitent la prolifération des éléments transposables (ET) dans les génomes dont ils menacent l'intégrité structurale et fonctionnelle. Chez les plantes l'interférence ARN (ARNi) joue un rôle important dans ces contrôles via des petits ARN d'environ 20nt qui guident la régulation de l'expression de séquences endogènes ou exogènes par deux types de mécanismes. Un premier mécanisme, partagé par de nombreux organismes eucaryotes, inhibe l'activité d'ARNm par un contrôle post-transcriptionnel. Un deuxième type de régulation, permet un contrôle transcriptionnel de l'activité des ET via un mécanisme appelé RNA directed DNA Methylation (RdDM) qui implique des siARN («  short-interfering RNA ») de 24nt qui guident la méthylation de l'ADN spécifiquement au niveau des séquences d'ET. Les siARN sont impliqués également dans la restauration progressive de la méthylation de l'ADN après une perte induite par la mutation du gène DDM1 (Decrease in DNA Methylation 1). L'objectif de cette thèse est de tirer avantage des technologies de séquençage à haut débit pour caractériser le contrôle des ET par les siARN chez la plante modèle Arabidopsis thaliana.Dans un premier temps, j'ai développé des méthodes et outils bioinformatiques afin de gérer efficacement les données de séquençage à haut débit de banques de petit ARN. Ces outils, regroupés en pipeline, visent à permettre l'étude de l'accumulation des siARN correspondant aux séquences d'ET ou de familles d'ET ainsi que leur visualisation de manière globale ou détaillée.Ces outils ont ensuite été appliqués pour caractériser, dans un contexte sauvage, l'association entre les siARN et les ET afin de déterminer des facteurs pouvant expliquer les différences d'abondance en siARN observées. Ces analyses, réalisées en tenant compte de l'état de méthylation de l'ADN et du contexte génomique des ET apportent une vue statique du contrôle des ET par les siARN et de leur impact sur les gènes situés à proximité.L'analyse de banques de petits ARN de mutants de la voie de l'ARNi a ensuite été réalisée afin mieux caractériser l'impact de la perte de méthylation de l'ADN sur les populations de siARN et notamment définir les mécanismes impliqués dans la production des siARN de 21nt induite dans le mutant ddm1. Ces analyses comparatives du contrôle des ET lors d'une perte de la méthylation de l'ADN ont permis de mettre en évidence une production de siARN de 24nt indépendante de la voie classique du RdDM et de proposer un modèle permettant d'expliquer la production de siARN de 21nt dans le mutant ddm1.Dans un dernier temps, j'ai cherché à mieux définir l'implication des siARN dans la restauration des états de méthylation de l'ADN. Les variations de méthylation de l'ADN induites par la mutation ddm1 ont été caractérisées ainsi que leur stabilité transgénérationnelle au sein d'une population d'epiRIL. La stabilité de l'hypométhylation de l'ADN a été étudiée, au regard de données de séquençage à haut débit de banques de petits ARN de lignées WT, ddm1 ainsi que pour 4 lignées epiRIL, afin d'apporter une notion temporelle à l'étude du contrôle des ET par les siARN.Les résultats soulignent le rôle majeur des petits ARN pour le contrôle des éléments transposables afin de préserver l'intégrité structurale et fonctionnelle du génome et ce, via des mécanismes variés en fonction des ET. Ce travail ouvre la voie vers une analyse du contrôle des ET par les siARN basée sur une approche regroupant les ET en réseaux en fonction des séquences de siARN qu'ils partagent. Cela permettrait d'étudier les « connections-siARN » entre ET afin de, par exemple, explorer l'action en trans des siARN pour la restauration de la méthylation de l'ADN

Architecture génétique de l'efficacité alimentaire chez le porc en croissance : exploration de données génétique et transcriptomique issues de lignées divergentes sur la consommation moyenne journalière résiduelle (CMJR)

L'efficacité de l'alimentation est un caractère économiquement important dans l'industrie porcine puisque le coût des aliments représente plus de 2/3 des coûts de production totaux. Parmi les mesures disponibles pour l'évaluation de l'efficacité alimentaire, la consommation moyenne journalière résiduelle (CMJR) reflète la différence entre la consommation observée et la consommation théorique estimée afin de répondre aux besoins de production et d'entretien. A INRAE depuis plus de 20 ans, une sélection divergente pour une meilleure (CMJR-) et une moindre efficacité alimentaire (CMJR+) a été effectuée sur des porcs Large-White (LW) pendant dix générations. En utilisant ces lignées sélectionnées, l'objectif principal de cette thèse était d'approfondir nos connaissances sur les bases génétiques et biologiques de la CMJR chez les porcs. Dans une première étude, nous avons recherché les régions génomiques affectant la CMJR et des caractères de production corrélés à la CMJR via une analyse d'association. Les données de génotypage ont été acquises à l'aide de puces de SNP de moyenne densité (MD) pour l'ensemble des individus reproducteurs des deux lignées divergentes et 32 individus fondateurs ont été génotypés à l'aide d'une puce haute densité (HD). Grace à des analyses d'imputation nous avons pu reconstruire les génotypes de 570 447 marqueurs de la puce HD pour l'ensemble des reproducteurs. Ces génotypes ont alors été utilisés pour attribuer un génotype moyen à l'ensemble des portées de descendants phénotypés pour les caractères d'intérêt (dont le CMJR). Ainsi des analyses GWAS ont été réalisées à partir d'un dispositif de 2 426 porcs phénotypés pour 24 caractères et disposant après prédiction des génotypes reconstruits à l'aide des informations généalogiques. Ces études ont été réalisées dans chaque lignée indépendamment ou en incluant les deux lignées. Au total, 186 régions QTL ont été identifiées dont 54 régions chromosomiques via l’approche globale, et 37 et 61 régions respectivement détectées à partir de la lignée CMJR- seule et la lignée CMJR+ seule. Parmi celles-ci, seules 15 régions sont partagées entre au moins deux analyses, et une seule est commune aux trois approches GWAS mais présentent des effets pour des caractères différents selon l'analyse. Parmi les 12 régions QTL détectées pour la CMJR, 3 avaient été d'ores et déjà identifiées et publiées dans d'autres études et 9 nouvelles régions génomiques ont été identifiées contenant des gènes candidats potentiels impliquées dans la prolifération cellulaire et les processus de différenciation des tissus gastro-intestinaux ou des voies de signalisation liées au métabolisme des lipides. La détection de régions QTL différentes entre les deux lignées pourrait être dû aux changements de fréquences alléliques au cours de la sélection des lignées. Afin d'affiner la caractérisation des régions QTL dans une seconde étude nous avons exploité un jeu de de données transcriptomiques disponible sur 4 tissus pour un lot d’individus issus de la 8ème génération de sélection. Des études d'enrichissement successives ont été réalisées à l'aide de l'outils GSEA, (1) en confrontant uniquement la liste des gènes différentiellement exprimés (DEG) à la base de données « Molecular Signatures Database » (MSigDB), (2) en recherchant dans cette même base de données les voies métaboliques enrichies en gènes présents dans les régions QTL et (3) en cherchant à combiner les données génétiques et transcriptomiques. Dans le cadre de cette approche nous avons choisi de porter une attention particulière aux DEG localisés en cluster dans le génome et aux régions présentant de fortes évolutions de fréquence à l'issue de la sélection. A terme l’intégration de données fonctionnelles, les plus riches et complètes possibles, doit ainsi permettre d'affiner la recherche de gènes candidats et d'identifier des processus biologiques sousjacents aux lignées divergentes pour l'efficacité alimentaire

Altération métabolique et déficit synaptique dans la maladie d'Alzheimer : rôle de la PHGDH astrocytaire

An early alteration of both cerebral glucose metabolism and synaptic activity has been consistently described in Alzheimer's disease (AD) patients. Metabolism of glucose via glycolysis and the citric acid cycle produces ATP that is essential for synaptic activity and plasticity. In the brain, glucose is predominantly processed glycolytically into astrocytes and not by neurons. Beyond ATP production, a major function of aerobic glycolysis is to provide precursors to support macromolecular synthesis. L-serine, generated from glucose through diversion of the glycolytic intermediate 3-phosphoglycerate (3PG) into the phosphorylated pathway, is only produced in astrocytes by 3-phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH), selectively expressed in those glial cells. L-serine is the precursor of D-serine, the main co-agonist of synaptic NMDAR, required for synaptic activity and plasticity. We used 3xTg-AD mice, which develop a progressive pathology, to investigate whether a defective production of L-/D-serine contributes to early synaptic deficits in AD. We found that 3xTg-AD mice display early in vivo alterations of glucose metabolism, synaptic deficits (LTP) in the CA1 region and also lower concentration of L-serine. The local expression of PHGDH was significantly altered. Exogenous D-serine completely rescued LTP in 3xTg-AD mice. These data support the hypothesis that a deficit of L-serine synthesis by astrocytes likely mediated by a decreased glycolytic flux may be responsible for the synaptic alteration mediated by NMDAR in the hippocampus of 3xTg-AD mice.Les patients atteints de la MA souffrent d'altérations métaboliques et synaptiques précoces. Via la glycolyse et le cycle de Krebs, le métabolisme du glucose permet la production d'ATP, essentielle à l'activité et la plasticité synaptique. Contrairement aux neurones, les astrocytes utilisent majoritairement la glycolyse pour métaboliser le glucose. En plus de la production d'énergie, la glycolyse fournit les précurseurs indispensables à la synthèse de biomolécules comme la L-sérine. Cet acide aminé est produit à partir du glucose par la déviation du 3-phosphoglycérate (3PG), un intermédiaire glycolytique, via l'enzyme 3-phosphoglycérate déshydrogénase (PHGDH), exprimée spécifiquement dans les astrocytes. La L-sérine est le précurseur de la D-sérine, le principal co-agoniste des NMDAR nécessaires à l'activité et la plasticité synaptique.Nous avons utilisé des souris 3xTg-AD, un modèle développant une MA progressive, afin d'étudier si une altération de la production de L-/D-sérine pouvait contribuer à des déficits synaptiques.A 6 mois, lorsque les souris 3xTg-AD ne possèdent pas encore de plaques amyloïdes dans l'hippocampe, nous avons observé in vivo une diminution du métabolisme du glucose, de la concentration de L-sérine et des déficits synaptiques (LTP). L'expression locale de la PHGDH est aussi altérée. L'application de D-sérine restaure complètement les déficits de LTP chez les souris 3xTg-AD.Ces données supportent l'hypothèse qu'un déficit de production de L-sérine par les astrocytes médié par une diminution du flux glycolytique serait responsable de l'altération synaptique observée dans l'hippocampe des souris 3xTg-AD

Etude de la réponse de Saccharomyces cerevisiae à une perturbation NADPH par une approche de biologie des systèmes

L'élucidation des propriétés du réseau métabolique est fondamentale pour la compréhension du fonctionnement cellulaire et pour l'élaboration de stratégies d'ingénierie métabolique. L'objectif de cette thèse était de mieux comprendre la régulation du métabolisme du NADPH, un métabolite "hub" qui joue un rôle central dans de nombreux processus cellulaires, chez Saccharomyces cerevisiae en fermentation. Nous avons utilisé une démarche systématique couplant modélisation et approches multi- omics pour étudier de façon quantitative la réponse à une perturbation de la demande en NADPH. Un système expérimental original, basé sur l'expression d'une butanediol déshydrogénase modifiée NADPH-dépendante a été utilisé pour augmenter de façon contrôlée la demande en NADPH. L'utilisation de ce dispositif, le développement et l'utilisation d'un modèle stœchiométrique de la levure dédié à la fermentation ont permis de prédire la répartition des flux pour différents niveaux de perturbation. Ces analyses ont montré, en premier lieu, la très grande capacité de la levure à faire face à des demandes très importantes de NADPH représentant jusqu'à 40 fois la demande anabolique. Pour des demandes modérées (allant jusqu'à 20 fois la demande anabolique), la perturbation est principalement compensée par une augmentation du flux à travers la voie des pentoses phosphate (VPP) et à moindre titre à travers la voie acétate (Ald6p). Pour une forte demande en NADPH, correspondant à 40 fois la demande anabolique, le modèle prédit la saturation de la VPP ainsi que la mise en place du cycle glycérol-DHA, qui permet l'échange du NADH en NADPH. Des analyses fluxomique (13C), métabolomique et transcriptomique, ont permis de valider ces hypothèses et de les compléter. Nous avons mis en évidence différents niveaux de régulation selon l'intensité de la perturbation : pour les demandes modérées, les flux sont réajustés par un contrôle au niveau enzymatique ; pour de fortes demandes, un contrôle transcriptionnel de plusieurs gènes de la VPP ainsi que de certains gènes des voies de biosynthèse des acides aminés est observé, cet effet résultant probablement de la moindre disponibilité en NADPH. Dans l'ensemble, ce travail a apporté un nouvel éclairage sur les mécanismes impliqués dans l'homéostasie du NADPH et plus généralement dans l'équilibre redox intracellulaire.The elucidation of the properties of metabolic network is essential to increase our understanding of cellular function and to design metabolic engineering strategies. The objective of this thesis was to better understand the regulation of the metabolism of NADPH, a hub metabolite which plays a central role in many cellular processes in Saccharomyces cerevisiae during fermentation. We used a systematic approach combining modeling and multi- omics analyses to study quantitatively the response to a perturbation of the NADPH demand. An original experimental system, based on the expression of a modified NADPH-dependent butanediol dehydrogenase was used to increase the demand for NADPH in a controlled manner. Through the use of this device and the development and use of a stoichiometric model of yeast dedicated to the fermentation, we predicted the flux distribution for different levels of perturbation. These experiments showed, first, the overwhelming ability of yeast to cope with very high NADPH demand, up to 40 times the anabolic demand. For a moderate level (up to 20 times the anabolic demand), the perturbation is mainly compensated by increased flux through the pentose phosphate pathway (PPP) and to a lesser extent through the acetate pathway (Ald6p). For a high NADPH demand, corresponding to 40 times the anabolic demand, the model predicts the saturation of the PPP as well as the operation of the glycerol-DHA cycle, which allows the exchange of NADH to NADPH. Fluxomics (13C), metabolomics and transcriptomics data were used to validate and to complement these hypotheses. We showed different levels of control depending on the intensity of the perturbation: for moderate demands, flux remodeling is mainly achieved by enzymatic control; for a high demand, a transcriptional control is observed for several genes of the PPP as well as some genes of the amino acids biosynthetic pathways, this latter effect being likely due to the low NADPH availability. Overall, this work has shed new light on the mechanisms governing NADPH homeostasis and more generally the intracellular redox balance.MONTPELLIER-SupAgro La Gaillarde (341722306) / SudocSudocFranceF

Caractérisation des cellules souches présentes dans les follicules pileux et analyse de leur potentiel de différenciation in vivo et in vitro à l'aide de peaux reconstruites par génie tissulaire

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006Les cellules souches sont à la base de la régénération des tissus adultes et du maintien de leur homéostasie. Afin d'étudier le processus de différenciation des cellules souches cutanées et d'approfondir nos connaissances sur les conditions qui contrôlent leur différenciation en épiderme et/ou en follicules pileux in vitro différents substituts cutanés ont été mis au point par génie tissulaire. D'une part, la portion dermique des peaux reconstruites a été produite par la superposion de feuillets de matrice extracellulaire produits par des fibroblastes humains ou murins cultivés en présence d'acide ascorbique. D'autre part, des kératinocytes (humains ou murins) ou des follicules pileux immatures (murins) ont été implantés sur les dermes reconstruits. Les propriétés histologiques et immunohistochimiques des tissus ont été évaluées après leur maturation in vitro ou sur l'animal. Nos résultats ont révélé que les interactions mésenchyme-épithéliales créées dans la peau reconstruite par génie tissulaire influencent significativement la voie de différenciation qu'empruntent les kératinocytes engendrés par les cellules souches et qu' il est possible, en recréant les conditions adéquates, de reconstruire des substituts cutanées aux propriétés histologiques similaires à la peau native ainsi que des peaux reconstruites capables de soutenir la formation de follicules pileux après la greffe. Des études in situ ont également été menées sur les cellules souches de la vibrisse de la souris. Nous avons observé que les kératinocytes présentant un cycle cellulaire long forment deux populations distinctes dans la région du renflement: une est en contact avec la membrane basilaire et l'autre ne l'est pas (appelée Bs1). Chacune de ces populations possède un aspect histologique distinct et présente une organisation, du réseau de kératine qui lui est spécifique et qui est associée à l'expression de kératines particulières. L'étude des vibrisses des souris dont le gène de la kératine 17 (K 17) a été invalidé a révélé que la K 1 7 est essentielle à la formation des vibrisses et à l'intégrité ultrastructurale des cellules Bs 1. En conclusion, mes travaux apportent de nouvelles données sur les conditions qui régissent la différenciation des cellules souches cutanées et sur les caractéristiques intrinsèques des cellules souches de la vibrisse