Fluorescence in situ hybridization of genes in environmental microbiology

Our knowledge concerning the metabolic potentials of as yet uncultured microorganisms has increased tremendously with the advance of sequencing technologies and the consequent discovery of novel genes. On the other hand, it is often difficult to reliably assign a particular gene to a phylogenetic clade, because these sequences are usually found on genomic fragments that carry no direct marker of cell identity, such as rRNA genes. Therefore, the main objective of the present study was to develop geneFISH - a protocol for linking gene presence with cell identity in environmental samples. This protocol combines rRNA-targeted Catalyzed Reporter Deposition Fluorescence In Situ Hybridization (CARD-FISH) and in situ gene detection. The method of rRNA-targeted CARD-FISH was previously developed (Pernthaler et al., 2002a). The gene detection method was adapted from Pernthaler and Amann (2004). It uses multiple digoxigenin labeled polynucleotide probes to target genes, followed by the binding of HRP-conjugated antibodies and catalyzed reporter deposition (CARD), to amplify and visualize the gene signal. However, the specificity of polynucleotide probes has not been thoroughly investigated and a rational probe design concept is still missing, because the well established concept for oligonucleotide probe design cannot be transferred to polynucleotides. Therefore, we developed a concept and software (PolyPro) for rational design of polynucleotide probe mixes used to identify particular genes in defined taxa. PolyPro consists of three modules: a GenBank Taxonomy Extractor (GTE), a Polynucleotide Probe Designer (PPD) and a Hybridization Parameters Calculator (HPC). Applying this probe design concept to three metabolic marker genes revealed the following about the use of polynucleotide probes in FISH: (i) a single probe is not sufficient to detect all alleles of a gene; (ii) single probes can be used mostly at the genus level; (iii) probe mixes cannot be used to detect all alleles of a gene, because of differences in the melting temperature; (iv) probe mixes can be used for identifying a gene mostly at the genus and family level. The newly developed concept for polynucleotide probe design was further applied to the probe design for the geneFISH experiments. The geneFISH protocol was first developed and tested in Escherichia coli. In a second phase, it was applied on seawater samples from Benguela upwelling system on the Namibian shelf, in which the presence of putative amoA gene was directly visualized in crenarchaeotal cells. This involved a specially designed polynucleotide probe mix (amoA-Nam) that targets the crenarchaeotal putative amoA alleles present in these environmental samples. Additionally, geneFISH was applied on two more systems, an enrichment sample, targeting rdsrA genes, and an eukaryotic host - bacterial symbiont system, targeting hynL and aprA genes in the symbionts. Further development of this method will in the direction of improving the gene detection efficiency, from less than 50% to 100%. This will allow a quantitative use of the geneFISH protocol

Investigation of Lysozyme Refolding Using Ionic Liquids as Refolding Additives

A rapid and inexpensive method for the production of protein is crucial for the biopharmaceutical industry. The bottleneck in the case of genetically engineered systems lies in the recovery of active and properly refolded proteins from inclusion bodies. The correct refolding of a protein from its denatured state is dependent on several parameters including the concentration of the protein, the refolding buffers utilized, the approach employed and finally the type of refolding additives, if any, used in the process. In this study, an emerging class of refolding additives, namely, ionic liquids were investigated for the refolding of denatured lysozyme protein. Lysozyme was used as a model system due to its rapid refolding kinetics and the fact that enzyme based assay could be carried out to measure the refolding yields. The ionic liquids selection was hypothesized based on the selection of cation and anion that constitute the ionic liquid. The efficacy of Imidazolium based ionic liquids as refolding additives was compared to conventional refolding approach that contains urea and redox-couple cysteine/cystine. Using response surface methodology (RSM) and central composite design (CCD), an empirical model was developed and validated by experimental results. Different refolding strategies were also evaluated; dilution refolding, adsorptive on column packed bed refolding and adsorptive on column fluidized bed refolding. Experimental results indicate that in comparison to the conventional refolding buffer, among different ionic liquids examined, ionic liquid [EMIM]Cl has a pronounced effect on the refolding yield and time required to refold the denatured lysozyme. The optimal conditions were identified in this study as 150 μg/ml of denatured lysozyme in presence of 75 mM [EMIM] Cl in 50 mM HEPES buffer (pH 7.5). On-column refolding studies indicate that in comparison to the packed bed system, the fluidized bed ion-exchange system approach, with [EMIM] Cl as the elution-refolding buffer could tolerate higher concentration of denatured lysozyme (up to 25 mg) with refolding yield ca. 90% and fractional mass recovery ca. 82%. This was due to potentially lower mass transfer limitations in the fluidized bed compared to the packed bed. Thus, the versatility of ionic liquids coupled with on-column adsorptive refolding can possibly be the solution to the large scale downstream processing of proteins

Development of Aggregation-Resistant Monoclonal Antibodies Through Antibody Engineering and Formulation Approaches

Monoclonal antibodies (mAbs) are invaluable in the treatment of cancers, auto-immune and inflammatory conditions. Since their advent, approximately 80 mAbs and antibody-based therapeutic products have gained marketing approval, quickly earning their positions in the list of top ten selling prescription products worldwide. One of the major challenges associated with the development of mAbs, is protein aggregation - a degradation phenomenon which results in ‘clumping’ of proteins together, and subsequent loss of protein activity. Furthermore, antibody aggregates have been associated with immunogenicity experienced by patients undergoing antibody therapy. Preventing antibody aggregation has major implications for biopharmaceutical development; not only are immunogenic reactions minimised, the shelf-life of therapeutic antibodies is significantly increased, there is increased flexibility in the type of antibody formulations that can be manufactured, and the half-life of antibodies may be increased. We tackled the challenge of protein aggregation via two main approaches – 1) investigating novel additives and formulation approaches to suppress protein aggregation; 2) engineering structural changes to antibodies to enhance their stability and resistance to aggregation. Protein aggregation was characterised using intrinsic and extrinsic fluorescence, size-exclusion-HPLC and light scattering techniques. This orthogonal approach allowed us to probe the conformational and colloidal stability of the protein at every step in the aggregation process. Successful approaches discovered include the use of ionic liquids as stabilizers, and engineering antibodies with additional glycosylation to improve their conformational stability. The work described in this thesis paves the way for the development of next-generation therapeutic antibodies, or biobetters, which are resistant to aggregation

Study of the interactions between DNA and ionic liquids

292 p.Los aptameros son ácidos nucleicos de ADN o ARN de hebra simple diseñados para reconocer específicamente una diana que puede ser, como ejemplo, células, proteínas, amino ácidos, drogas o incluso pequeñas moléculas. Estos exhiben propiedades similares a los anticuerpos, pero presentan una estabilidad significativamente más elevada que estos últimos. Los aptameros son seleccionados para la diana de interés a través del procedimiento automatizado in vitro llamado Evolución Sistemática de un Ligando por Enriquecimiento Exponencial - "SELEX". Estos pueden ser usados en biosensores o como elementos compuerta en nanoporos para aplicaciones de liberación controlada de drogas. Los aptameros pueden ser químicamente modificados con la introducción de un ligando y un par de fluoroforo y extintor de fluorescencia dando origen a una estructura tipo horquilla comúnmente llamado de farol molecular (molecular beacon - MB). Desde que fueron desarrolladas, las sondas de MB han sido ampliamente empleadas en biosensores debido a la facilidad de la detección de la señal de fluorescencia tras la interacción con la diana. Hasta ahora, estas sondas y el SELEX se han investigado y empleado principalmente en soluciones tampón acuosas. Sin embargo, debido a sus particulares propiedades físico-químicas, los líquidos iónicos (ILs) surgen como medio alternativo altamente interesante. Debido a que su presión de vapor es casi inexistente, esto es que prácticamente no se evaporan, los ILs tienen una gran ventaja respecto a los disolventes acuosos. La capacidad para disolver moléculas tales como los oligonucleótidos y al mismo tiempo ser capaces de experimentar interacciones electrostáticas, son también atractivas propiedades de los líquidos iónicos. Sin embargo, la información sobre las interacciones entre ADN o aptameros de ADN y líquidos iónicos es todavía limitada.Así, el principal objetivo de esta tesis fue el estudio de las interacciones de ADN con los líquidos iónicos y de la función de un aptamero de ADN en presencia de líquidos iónicos con propiedades físico-químicas distintas. En primer lugar se estudió la capacidad de reconocimiento y la selectividad del aptamero de ATP hacía la molécula de AMP en una solución acuosa con la presencia del liquido iónico prótico nitrato de etilamonio (EAN). Demostrándose que el aptamero de ATP permanece funcional con la presencia de EAN en la solución, otros líquidos iónicos fueron utilizados para entender la influencia de líquidos ionicos con diferentes propiedades físico-químicas en la estructura y función del ADN (lactato de colina (CL), nitrato de colina (CN), di-hidrogenofosfato de colina (CDHP), cloruro de 1-butil-3-metilimidazolio (BMIM-Cl) y lactato de 1,1,3,3-tetrametilguanidinio (TMGL)). Para eso, la hibridación y la estabilidad de una doble hebra de ADN constituida por 12 nucleótidos fueron estudiadas en solución con estos ILs. Diferentes tecnologías espectroscópicas, envolviendo la medición de la fluorescencia o el dicroísmo circular, complementadas por cálculos computacionales fueron usadas a lo largo de este trabajo. La posible influencia de estos líquidos iónicos en la emisión de la fluorescencia del fluoroforo usado, el Alexa Fluor 488, fue también investigada determinándose que cuando el AF 488 estaba libre en la solución, casi todos los líquidos iónicos disminuyeron la emisión de la fluorescencia. Por otro lado, cuando el AF 488 estaba ligado a una hebra simple de ADN, la fluorescencia se mantuvo prácticamente constante mismo con la presencia de estos ILs en solución. Estos resultados fueron entonces favorables para el uso de este sistema con AF 488 ligado al ADN en los estudios subsecuentes envolviendo líquidos iónicos en la solución. De esos estudios, se determinó que dependiendo del líquido iónico y de su concentración en solución, la función y estabilidad del ADN se mantuvieron.La segunda parte de este trabajo envolvió el proceso de SELEX, realizado por primera vez en presencia de un liquido iónico, el lactato de colina. El objetivo aquíera determinar hasta qué punto la introducción de un líquido iónico directamente durante el proceso de SELEX iría permitir que las secuencias de aptamero de ADN reconocieran la diana ATP y comparar la constante de reconocimiento molecular (Kd) con la obtenida usando apenas la solución tampón pura. A partir del SELEX en presencia de este líquido iónico se determinaron algunas nuevas secuencias de ADN potencialmente selectivos para el ATP, sin embargo, la medición final del Kd no pudo llevarse a cabo dentro del plazo de esta tesis.Como conclusiones generales, esta investigación permitió determinar que el ADN permaneció funcional en presencia de un entorno no fisiológico conteniendo liquido iónico. Considerando sus propiedades físico-químicas, no se determinó ningún patrón de interacción entre los líquidos iónicos. Por lo tanto, se concluyó que cada sistema debe ser caracterizado de manera independiente, incluso si los líquidos iónicos presentan cationes o aniones comunes. Nuevas secuencias de aptamero de ADN para el ATP fueron obtenidas a través del SELEX con la presencia de CL en solución lo que demuestra que, en un principio, este procedimiento de selección puede emplearse también con una solución no convencional

Study of the interactions between DNA and ionic liquids

292 p.Los aptameros son ácidos nucleicos de ADN o ARN de hebra simple diseñados para reconocer específicamente una diana que puede ser, como ejemplo, células, proteínas, amino ácidos, drogas o incluso pequeñas moléculas. Estos exhiben propiedades similares a los anticuerpos, pero presentan una estabilidad significativamente más elevada que estos últimos. Los aptameros son seleccionados para la diana de interés a través del procedimiento automatizado in vitro llamado Evolución Sistemática de un Ligando por Enriquecimiento Exponencial - "SELEX". Estos pueden ser usados en biosensores o como elementos compuerta en nanoporos para aplicaciones de liberación controlada de drogas. Los aptameros pueden ser químicamente modificados con la introducción de un ligando y un par de fluoroforo y extintor de fluorescencia dando origen a una estructura tipo horquilla comúnmente llamado de farol molecular (molecular beacon - MB). Desde que fueron desarrolladas, las sondas de MB han sido ampliamente empleadas en biosensores debido a la facilidad de la detección de la señal de fluorescencia tras la interacción con la diana. Hasta ahora, estas sondas y el SELEX se han investigado y empleado principalmente en soluciones tampón acuosas. Sin embargo, debido a sus particulares propiedades físico-químicas, los líquidos iónicos (ILs) surgen como medio alternativo altamente interesante. Debido a que su presión de vapor es casi inexistente, esto es que prácticamente no se evaporan, los ILs tienen una gran ventaja respecto a los disolventes acuosos. La capacidad para disolver moléculas tales como los oligonucleótidos y al mismo tiempo ser capaces de experimentar interacciones electrostáticas, son también atractivas propiedades de los líquidos iónicos. Sin embargo, la información sobre las interacciones entre ADN o aptameros de ADN y líquidos iónicos es todavía limitada.Así, el principal objetivo de esta tesis fue el estudio de las interacciones de ADN con los líquidos iónicos y de la función de un aptamero de ADN en presencia de líquidos iónicos con propiedades físico-químicas distintas. En primer lugar se estudió la capacidad de reconocimiento y la selectividad del aptamero de ATP hacía la molécula de AMP en una solución acuosa con la presencia del liquido iónico prótico nitrato de etilamonio (EAN). Demostrándose que el aptamero de ATP permanece funcional con la presencia de EAN en la solución, otros líquidos iónicos fueron utilizados para entender la influencia de líquidos ionicos con diferentes propiedades físico-químicas en la estructura y función del ADN (lactato de colina (CL), nitrato de colina (CN), di-hidrogenofosfato de colina (CDHP), cloruro de 1-butil-3-metilimidazolio (BMIM-Cl) y lactato de 1,1,3,3-tetrametilguanidinio (TMGL)). Para eso, la hibridación y la estabilidad de una doble hebra de ADN constituida por 12 nucleótidos fueron estudiadas en solución con estos ILs. Diferentes tecnologías espectroscópicas, envolviendo la medición de la fluorescencia o el dicroísmo circular, complementadas por cálculos computacionales fueron usadas a lo largo de este trabajo. La posible influencia de estos líquidos iónicos en la emisión de la fluorescencia del fluoroforo usado, el Alexa Fluor 488, fue también investigada determinándose que cuando el AF 488 estaba libre en la solución, casi todos los líquidos iónicos disminuyeron la emisión de la fluorescencia. Por otro lado, cuando el AF 488 estaba ligado a una hebra simple de ADN, la fluorescencia se mantuvo prácticamente constante mismo con la presencia de estos ILs en solución. Estos resultados fueron entonces favorables para el uso de este sistema con AF 488 ligado al ADN en los estudios subsecuentes envolviendo líquidos iónicos en la solución. De esos estudios, se determinó que dependiendo del líquido iónico y de su concentración en solución, la función y estabilidad del ADN se mantuvieron.La segunda parte de este trabajo envolvió el proceso de SELEX, realizado por primera vez en presencia de un liquido iónico, el lactato de colina. El objetivo aquíera determinar hasta qué punto la introducción de un líquido iónico directamente durante el proceso de SELEX iría permitir que las secuencias de aptamero de ADN reconocieran la diana ATP y comparar la constante de reconocimiento molecular (Kd) con la obtenida usando apenas la solución tampón pura. A partir del SELEX en presencia de este líquido iónico se determinaron algunas nuevas secuencias de ADN potencialmente selectivos para el ATP, sin embargo, la medición final del Kd no pudo llevarse a cabo dentro del plazo de esta tesis.Como conclusiones generales, esta investigación permitió determinar que el ADN permaneció funcional en presencia de un entorno no fisiológico conteniendo liquido iónico. Considerando sus propiedades físico-químicas, no se determinó ningún patrón de interacción entre los líquidos iónicos. Por lo tanto, se concluyó que cada sistema debe ser caracterizado de manera independiente, incluso si los líquidos iónicos presentan cationes o aniones comunes. Nuevas secuencias de aptamero de ADN para el ATP fueron obtenidas a través del SELEX con la presencia de CL en solución lo que demuestra que, en un principio, este procedimiento de selección puede emplearse también con una solución no convencional

Strategies for the enhancement of the catalytic performance of cutinase in nonaqueous media

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Química e Bioquímic

Analysis of ras gene mutations in rainbow trout tumors

For ras gene mutation analysis in the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) model system, a partial trout ras sequence was identified using the polymerase chain reaction (PCR). Two synthetic oligonucleotides based on rat K-ras gene sequence were used as primers for the PCR procedure. A 90 base pair (bp) sequence, referred to as the trout K-ras, was amplified from trout genomic DNA and cDNA. Cloned 90 by PCR products from several normal liver tissues were sequenced resulting in the same sequence. Large-sized PCR products, 111 and 237 bp, were also cloned and sequenced indicating that these fragments included the 90 by sequence information expressed in mRNA. This 5'-terminal partial trout K-ras nucleotide sequence was 88% homologous to that of the goldfish ras gene, and less homologous to those of mammalian ras genes. Based on the partial sequence information of two trout ras genes, K-ras and H-ras, DNA from trout tumors induced by chemical carcinogens, aflatoxin B1 (AFB1) and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidene (MNNG), were analyzed for the presence of point mutations. Using the PCR and oligonucleotide hybridization methods, a high proportion (10/14) of the AFB1-initiated liver tumor DNA indicated evidence for ras point mutations. Of the 10 mutant ras genotypes, seven were probed as G to T transversions at the second position of codon 12, two were G to T transversions at the second position of codon 13, and one was a G to A transition at the first position of codon 12. Nucleotide sequence analysis of cloned PCR products from four of these tumor DNAs provided definitive mutation evidence in each case, which seemed to occur in only a fraction of the neoplastic cells. However, no mutations were detected in exon 1 of the trout K-ras gene, nor in DNA from trout normal livers. Results indicated that the hepatocarcinogen AFB1 induced similar ras gene mutations in trout as in rat liver tumors. By comparison, the mutation specificity of MNNG in trout liver tumors was for G to A transitions, but no ras mutations were detected in trout kidney tumors. This investigation was the initial study of experimentally induced ras gene point mutations in a lower vertebrate fish model

Bioinorganic Chemistry

This book covers material that could be included in a one-quarter or one-semester course in bioinorganic chemistry for graduate students and advanced undergraduate students in chemistry or biochemistry. We believe that such a course should provide students with the background required to follow the research literature in the field. The topics were chosen to represent those areas of bioinorganic chemistry that are mature enough for textbook presentation. Although each chapter presents material at a more advanced level than that of bioinorganic textbooks published previously, the chapters are not specialized review articles. What we have attempted to do in each chapter is to teach the underlying principles of bioinorganic chemistry as well as outlining the state of knowledge in selected areas. We have chosen not to include abbreviated summaries of the inorganic chemistry, biochemistry, and spectroscopy that students may need as background in order to master the material presented. We instead assume that the instructor using this book will assign reading from relevant sources that is appropriate to the background of the students taking the course. For the convenience of the instructors, students, and other readers of this book, we have included an appendix that lists references to reviews of the research literature that we have found to be particularly useful in our courses on bioinorganic chemistry