Complex and unexpected dynamics in simple genetic regulatory networks

Peer reviewedPublisher PD

Biological Rhythms Workshop IB: Neurophysiology of SCN Pacemaker Function

Pacemakers are functional units capable of generating oscillations that synchronize downstream rhythms. In mammals, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus is a circadian pacemaker composed of individual neurons that intrinsically express a near 24-hour rhythm in gene expression. Rhythmic gene expression is tightly coupled to a rhythm in spontaneous firing rate via intrinsic daily regulation of potassium current. Recent progress in the field indicates that SCN pacemaking is a specialized property that emerges from intrinsic features of single cells, structural connectivity among cells, and activity dynamics within the SCN. The focus of this chapter is on how Nature built a functional pacemaker from many individual oscillators that is capable of coordinating the daily timing of essential brain and physiological processes

Ca2+ signaling by T-type Ca2+ channels in neurons

Among the major families of voltage-gated Ca2+ channels, the low-voltage-activated channels formed by the Cav3 subunits, referred to as T-type Ca2+ channels, have recently gained increased interest in terms of the intracellular Ca2+ signals generated upon their activation. Here, we provide an overview of recent reports documenting that T-type Ca2+ channels act as an important Ca2+ source in a wide range of neuronal cell types. The work is focused on T-type Ca2+ channels in neurons, but refers to non-neuronal cells in cases where exemplary functions for Ca2+ entering through T-type Ca2+ channels have been described. Notably, Ca2+ influx through T-type Ca2+ channels is the predominant Ca2+ source in several neuronal cell types and carries out specific signaling roles. We also emphasize that Ca2+ signaling through T-type Ca2+ channels occurs often in select subcellular compartments, is mediated through strategically co-localized targets, and is exploited for unique physiological function

Elektrophysiologische Charakterisierung des isolierten circadianen Schrittmachers der Schabe Leucophaea maderae

Der Sitz des circadianen Schrittmachers, der das Laufverhalten der Schabe Leucophaea maderae steuert, wurde durch Läsions- und Transplantationsexperimente in der akzessorischen Medulla (aMe; Plural akzessorische Medullae, aMae) lokalisiert. Die aMe ist ein noduläres Neuropil, welches sich am frontalen, ventromedialen Rand der Medulla in den bilateralen optischen Loben befindet. Immunfärbungen gegen das Octadeca-Peptid pigment-dispersing hormon (PDH) aus Crustaceen zeigen eine dichte Innervation von PDH-immunreaktiven (PDH-ir) Zellen in der aMe. Bei Drosophila melanogaster und Leucophaea maderae exprimiert ein Grossteil der PDH-ir Zellen das Protein PERIOD, einen integralen Bestandteil des molekularen circadianen Schrittmachers (pacemaker). Darüber hinaus erfüllt die Anatomie der gefundenen PDH-ir Zellen wichtige Kriterien eines circadianen Schrittmachers. So weisen sie Projektionen in der Lamina auf und somit einen möglichen Informationsausgang zu den Komplexaugen, es besteht eine Kopplungsbahn zwischen den bilateralen aMae und es sind Ausgänge in das superiore mediane Protocerebrum vorhanden, welche für die Kontrolle des Verhaltens verantwortlich sein könnten. Zusätzlich zu den PDH-ir Zellen wird die aMe von einer Vielzahl verschiedener Peptid- und GABA-ir Neurone innerviert. Die Verzweigungen dieser Neurone formen Subkompartimente in der aMe: ein dichtes noduläres Neuropil, dazwischen ein internoduläres Neuropil und eine „Schale“, die das noduläre und internoduläre Neuropil umgibt. Das noduläre Neuropil weist dichte Verzweigungen aus dem GABA-ir distalen Trakt auf, die vermutlich für die Lichtsynchronisation verantwortlich sind. Zusätzliche Verzweigungen von circa 25 GABA-ir Neuronen mit Somata in direkter Nähe zur aMe dienen wahrscheinlich als lokale Interneurone. In den letzten Jahren wurden große Fortschritte in der Erforschung des molekularen Schrittmachers gemacht, aber nur wenige Informationen zu den physiologischen Eigenschaften der Schrittmacherneurone und deren Verschaltung zu einem neuronalen Netzwerk sind bekannt. In der vorliegenden Dissertation wurde eine Methode entwickelt und etabliert, welche es ermöglicht, über einen Zeitraum von Stunden bis hin zu mehreren Tagen die elektrische Aktivität von isolierten aMae aufzuzeichnen. Mit dieser Methode werden mit einer niederohmigen Saugelektrode Summenpotentiale von mehreren Neuronen simultan extrazellulär abgeleitet (multi-unit recording). Dies ermöglicht, die zeitliche Koordination der elektrischen Aktivität von Neuronen in einem Netzwerk zu untersuchen. Das Ziel der Arbeit war die elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung der aMe und die Untersuchung, ob das neuronale Netzwerk der isolierten aMe selbstständig einen circadianen Rhythmus generiert. Die vorliegende Dissertation gliedert sich in drei Kapitel: Kapitel I: Pigment-dispersing factor and GABA synchronisieren Zellen der isolierten circadianen Uhr der Schabe Leucophaea maderae Extrazelluläre Langzeitableitungen von Summenpotentialen von isolierten aMae der Schabe Leucophaea maderae zeigten, dass die Mehrzahl der abgeleiteten Neurone spontanaktiv Aktionspotentiale mit sehr regelmäßigen Intervallen im Millisekundenbereich generieren. Diese Regelmäßigkeit wird wahrscheinlich durch Membranpotentialoszillationen mit ultradianen Periodenlängen verursacht. Die meisten Neurone in der aMe sind zu Ensembles phasengleich gekoppelt und generieren simultan Aktionspotentiale mit gleichen Intervallen (Periodenlängen) und zu gleichen Zeitpunkten (Phasenlage). Verschiedene Ensembles von Neuronen generieren unterschiedliche Periodenlängen und Phasenlagen. Die Effekte der Applikationen des inhibitorischen Neurotransmitters GABA und des Chloridkanal Blockers Picrotoxin, welcher reproduzierbar GABA-Inhibitionen aufhob, auf die zeitliche Koordination der elektrischen Aktivität, lassen vermuten, dass die neuronalen Ensembles mittels Synchronisation durch GABAerge Interneuronen gebildet werden. Die Phasenlage unterschiedlicher Ensembles wiederum kann durch Applikation von pigment-dispersing factor (PDF) synchronisiert werden (das Peptid PDF der Insekten ist homolog zu dem PDH der Crustaceen). Aus den Daten geht hervor, dass diese Phasenkopplung wahrscheinlich aus einer Inhibition der GABAergen Interneurone durch PDF resultiert. Diese Daten lassen vermuten, dass die Kontrolle der Phasenlage von ultradianen Aktionspotentialoszillationen ein wichtiger Bestandteil der Funktionsweise des circadianen Netzwerks ist. Offensichtlich wird diese Kontrolle der Phasenlage nicht ausschließlich über chemische Synapsen vermittelt. Die vollständige Blockade der synaptischen Übertragung durch die Entfernung extrazellulären Calciums führte zu einer Erhöhung der elektrischen Aktivität, wahrscheinlich durch den Verlust von inhibitorischen Eingängen auf spontanaktive Zellen, aber nicht zum Verlust von koordinierten Phasenbeziehungen. Die Phasenlage wurde lediglich von null Phasenunterschied zu einer neuen konstanten Phasenbeziehung verschoben. Kapitel II: Elektrische Synapsen zwischen Neuronen der akzessorischen Medulla scheinen circadiane Schrittmacherzellen der Schabe Leucophaea maderae zu synchronisieren Im ersten Kapitel wurde gezeigt, dass GABAerge synaptische Interaktionen zur Bildung neuronalen Ensembles führen. Während alle Neurone eines Ensembles mit der gleichen Phasenlage und gleicher Periodenlänge Aktionspotentiale generieren, zeigen unterschiedliche Ensembles unterschiedliche Periodenlängen und Phasenlagen. Allerdings führt die Blockade von synaptischer Übertragung nicht zu einem völligen Verlust von synchronisierten Aktionspotentialoszillationen, sondern zu einem graduellen Verschieben der Phasenlagen, bis hin zu einem konstanten Phasenunterschied. Daraus lässt sich schließen, dass zusätzliche Synchronisationswege in der aMe eine wichtige Rolle spielen, welche nicht von chemischen Synapsen getragen werden. Um zu untersuchen, ob elektrische Synapsen (gap junctions) an dieser Synchronisation beteiligt sind, verwendeten wir die aus Vertebraten bekannten gap junction Blocker Halothane, Octanol und Carbenoxolon (CBX). Die Effekte der Applikation von verschiedenen gap junction Blockern in Gegenwart und Abwesenheit von synaptischer Übertragung in der aMe, lassen darauf schließen, dass verschiedene Populationen von aMe Interneuronen durch gap junctions zu einer stabilen Phasendifferenz synchronisiert werden. Diese Synchronisation schafft die notwendige Voraussetzung für die synaptische Kopplung zu Ensembles von aMe Neuronen mit identischer Phasenlage. Kapitel III: Extrazelluläre Langzeitableitungen vom circadianen Schrittmacherzentrum der Schabe Leucophaea maderae offenbaren circadiane wie auch ultradiane Rhythmen Die elektrische Aktivität der isolierten aMe konnte im Dauerdunkel extrazellulär bis zu fünf Tagen gemessen werden. Bei extrazellulären Saugelektrodenableitungen, wie sie hier durchgeführt wurden ist die gemessene Frequenz unter anderem vom Synchronisationsgrad der einzelnen Neurone abhängig. Hohe Synchronisation zu identischer Phasenlage führt zu einer Verringerung der gemessenen Frequenz und umgekehrt. Da wir zeigen konnten, dass die Synchronisation von Phasenlagen und Periodenlängen ein integraler Bestandteil des aMe Netzwerkes ist, wurde das zeitliche Auftreten von definierten Frequenzmaxima unabhängig von der absoluten gemessenen Frequenz analysiert. Die gemessenen Frequenzmaxima zeigten eine signifikant höhere Verteilung in der Mitte der subjektiven Nacht. Die Untersuchung der Intervallverteilung zwischen den Frequenzmaxima ergab eine vorherrschende ultradiane Periodenlänge von circa zwei Stunden. Zusätzlich traten gehäuft Perioden auf, deren Länge ganzzahlige Vielfache von zwei Stunden waren. Die zeitliche Verteilung dieser periodisch auftretenden Frequenzmaxima, bzw. Frequenzänderungen steht in guter Korrelation zu den Zeiträumen in denen Injektionen von PDF, Allatotropin, GABA und Serotonin die Phasenlage der Lokomotion im Dauerdunkel am stärksten beeinflussen. Es lässt sich vermuten, dass die zeitliche Koordination des aMe Netzwerkes durch die Kontrolle der Phasenbeziehungen ultradianer Oszillatoren bewerkstelligt wird

12-h clock regulation of genetic information flow by XBP1s

© The Author(s), 2020. This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License. The definitive version was published in Pan, Y., Ballance, H., Meng, H., Gonzalez, N., Kim, S., Abdurehman, L., York, B., Chen, X., Schnytzer, Y., Levy, O., Dacso, C. C., McClung, C. A., O'Malley, B. W., Liu, S., & Zhu, B. 12-h clock regulation of genetic information flow by XBP1s. Plos Biology, 18(1), (2020): e3000580, doi:10.1371/journal.pbio.3000580.Our group recently characterized a cell-autonomous mammalian 12-h clock independent from the circadian clock, but its function and mechanism of regulation remain poorly understood. Here, we show that in mouse liver, transcriptional regulation significantly contributes to the establishment of 12-h rhythms of mRNA expression in a manner dependent on Spliced Form of X-box Binding Protein 1 (XBP1s). Mechanistically, the motif stringency of XBP1s promoter binding sites dictates XBP1s’s ability to drive 12-h rhythms of nascent mRNA transcription at dawn and dusk, which are enriched for basal transcription regulation, mRNA processing and export, ribosome biogenesis, translation initiation, and protein processing/sorting in the Endoplasmic Reticulum (ER)-Golgi in a temporal order consistent with the progressive molecular processing sequence described by the central dogma information flow (CEDIF). We further identified GA-binding proteins (GABPs) as putative novel transcriptional regulators driving 12-h rhythms of gene expression with more diverse phases. These 12-h rhythms of gene expression are cell autonomous and evolutionarily conserved in marine animals possessing a circatidal clock. Our results demonstrate an evolutionarily conserved, intricate network of transcriptional control of the mammalian 12-h clock that mediates diverse biological pathways. We speculate that the 12-h clock is coopted to accommodate elevated gene expression and processing in mammals at the two rush hours, with the particular genes processed at each rush hour regulated by the circadian and/or tissue-specific pathways.This study was supported by the American Diabetes Association junior faculty development award 1-18-JDF-025 to B.Z., by funding from National Institute of Health HD07879 and 1P01DK113954 to B.W.O, by funding from National Science Foundation award 1703170 to C.C.D. and B.Z., and by funding from Brockman Foundation to C.C.D and B.W.O. This work was further supported by the UPMC Genome Center with funding from UPMC’s Immunotherapy and Transplant Center. This research was supported in part by the University of Pittsburgh Center for Research Computing through the resources provided. Research reported in this publication was further supported by the National Institute of Diabetes And Digestive And Kidney Diseases of the National Institutes of Health under award number P30DK120531 to Pittsburgh Liver Research Center, in which both S.L. and B.Z. are members. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript

Olfactory Inputs Modulate Respiration-Related Activity In The Prefrontal Cortex And Fear Behavior

Voluntary control of respiration, especially via rhythmic nasal breathing, alleviates negative feelings such as fear and is used clinically to manage certain types of panic attacks. However, the neural substrates that link nasal breathing to fear circuits remains unknown. Here we show that during conditioned fear-induced freezing behavior, mice breathe at a steady rate (~4 Hz) which is strongly correlated with a predominant 4 Hz oscillation observed in the olfactory bulb and the prelimbic prefrontal cortex (plPFC), a structure critical for the expression of conditioned fear behaviors. We demonstrate anatomical and functional connectivity between the olfactory pathway and plPFC via circuit tracing and optogenetic approaches. Disrupting olfactory inputs significantly reduces the 4 Hz oscillation in the plPFC suggesting that respiration-related signals from the olfactory system play a role in entraining this fear-related signal. Surprisingly, we find that without olfactory inputs, freezing times are significantly prolonged. Collectively, our results indicate that olfactory inputs modulate rhythmic activity in fear circuits and suggest a neural pathway that may underlie the behavioral benefits of respiration-entrained olfactory signals

A cellular model for human daily behaviour

All the biochemical, physiological or behavioural processes whose period is about 24 hours possess a circadian rhythm. In mammals circadian rhythms control almost all aspects of human daily behaviour and physiology. Dysregulation of circadian rhythms leads to several pathologies, such as depression, cancer and metabolic syndromes. Mammalian circadian system is organized in a hierarchic fashion: suprachiasmatic nucleus (SCN) is master clock and governs the circadian rhythms of all peripheral oscillators, virtually all the other cells of the body. The study of human circadian rhythms in subjects in vivo is expensive, time consuming and invading. However, since SCN and peripheral oscillators share the same circadian molecular machinery, it is possible to use peripheral oscillator as model to study molecular mechanisms of circadian rhythms. To visualize in real-time cellular circadian rhythms, fibroblasts were infected with a lentivirus coding for the circadian reporter firefly luciferase under a clock gene promoter (Bmal1). After the synchronization of circadian rhythms, the measurement of the light emitted by the cells gave a representation of fibroblast circadian oscillations. The aim of the thesis was to establish the use of human primary skin fibroblasts as a valuable model to study different aspects of human circadian rhythms. To address these questions three projects were designed. A first set of experiments aimed at validating human skin fibroblast model, ascertaining that this in vitro model parallels in vivo human circadian parameters. We found a very good correlation between the in vivo and the in vitro period length in the three groups of subjects (two sighted and one blind) recruited for this study. Interestingly, although the in vivo period obtained from the blind group was longer than the in vivo period obtained from the sighted groups, the in vitro period length from the three groups of subjects was similar, revealing that human skin fibroblasts are insensitive to the after-effects caused by light. In summary, human circadian period can be approximated by measurement in fibroblasts. In a second project human age-related circadian impairments were studied in the cellular skin fibroblasts model. Indeed sleep-wake cycle alterations and phase advancing of gene expression and behaviour can be found in elder individuals. To better understand the rebound of ageing on the circadian rhythms we characterized the period length of skin fibroblasts from young and elder persons. No differences in amplitude, phase and period length were found between cells from the two groups. However, in the presence of sera from older donors human fibroblasts showed a reduced period length and a shorter phase of entrainment compared to the same cells measured in the presence of sera from young donors. These differences are likely due to one or more thermolabile substances, since heat-inactivation of sera from older donors almost undid the reduction of the circadian period length. Thus, these results suggest that during ageing the molecular machinery of peripheral circadian clocks does not change per se, but some age-related circadian changes observed in vivo might be caused by circulating molecules. Human fibroblasts were also used to investigate the role of melatonin as zeitgeber on peripheral oscillators. Melatonin is secreted in a circadian fashion and was demonstrated to regulate the SCN firing rate and to entrain the sleep-wake cycle of most mammals and humans. The circadian presence of melatonin is well conserved in all biological fluids, suggesting that melatonin may be one of the molecules that the master clock uses to synchronize peripheral oscillators. This hypothesis was tested in damped fibroblasts, using a wide range of concentrations of melatonin to restore the amplitude of the rhythms. However, no increase of amplitude or phase shift of the rhythms was observed after treating cells with melatonin. Moreover, the application of the hormone to newly synchronized oscillators decreased their bioluminescence. In summary, the experiments demonstrated that melatonin does not play a direct role as peripheral oscillator zeitgeber. In conclusion, the studies of the present thesis succeeded in revealing three primary findings: first, fibroblast circadian rhythms parallel human circadian physiology, such as circadian period length. Second, apparently, during ageing the molecular components of peripheral circadian clocks in skin fibroblasts do not change per se, but some age-related circadian changes observed in vivo might be caused by one or more heat-sensitive substances present in the blood of older subjects. Finally, melatonin does not possess direct synchronizing properties on peripheral oscillators like fibroblasts. In total, the present thesis revealed that primary human skin fibroblasts are an easily accessible, cheap and reliable model to enlighten our understanding of human circadian mechanisms