Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways

Tolerance to high levels of ethanol is an ecologically and industrially relevant phenotype of microbes, but the molecular mechanisms underlying this complex trait remain largely unknown. Here, we use long-term experimental evolution of isogenic yeast populations of different initial ploidy to study adaptation to increasing levels of ethanol. Whole-genome sequencing of more than 30 evolved populations and over 100 adapted clones isolated throughout this two-year evolution experiment revealed how a complex interplay of de novo single nucleotide mutations, copy number variation, ploidy changes, mutator phenotypes, and clonal interference led to a significant increase in ethanol tolerance. Although the specific mutations differ between different evolved lineages, application of a novel computational pipeline, PheNetic, revealed that many mutations target functional modules involved in stress response, cell cycle regulation, DNA repair and respiration. Measuring the fitness effects of selected mutations introduced in non-evolved ethanol-sensitive cells revealed several adaptive mutations that had previously not been implicated in ethanol tolerance, including mutations in PRT1, VPS70 and MEX67. Interestingly, variation in VPS70 was recently identified as a QTL for ethanol tolerance in an industrial bio-ethanol strain. Taken together, our results show how, in contrast to adaptation to some other stresses, adaptation to a continuous complex and severe stress involves interplay of different evolutionary mechanisms. In addition, our study reveals functional modules involved in ethanol resistance and identifies several mutations that could help to improve the ethanol tolerance of industrial yeasts

Development of a D-xylose fermenting and inhibitor tolerant industrial Saccharomyces cerevisiae strain with high performance in lignocellulose hydrolysates using metabolic and evolutionary engineering

Background: The production of bioethanol from lignocellulose hydrolysates requires a robust, D-xylose-fermenting and inhibitor-tolerant microorganism as catalyst. The purpose of the present work was to develop such a strain from a prime industrial yeast strain, Ethanol Red, used for bioethanol production. Results: An expression cassette containing 13 genes including Clostridium phytofermentans XylA, encoding D-xylose isomerase (XI), and enzymes of the pentose phosphate pathway was inserted in two copies in the genome of Ethanol Red. Subsequent EMS mutagenesis, genome shuffling and selection in D-xylose-enriched lignocellulose hydrolysate, followed by multiple rounds of evolutionary engineering in complex medium with D-xylose, gradually established efficient D-xylose fermentation. The best-performing strain, GS1.11-26, showed a maximum specific D-xylose consumption rate of 1.1 g/g DW/h in synthetic medium, with complete attenuation of 35 g/L D-xylose in about 17 h. In separate hydrolysis and fermentation of lignocellulose hydrolysates of Arundo donax (giant reed), spruce and a wheat straw/hay mixture, the maximum specific D-xylose consumption rate was 0.36, 0.23 and 1.1 g/g DW inoculum/h, and the final ethanol titer was 4.2, 3.9 and 5.8% (v/v), respectively. In simultaneous saccharification and fermentation of Arundo hydrolysate, GS1.11-26 produced 32% more ethanol than the parent strain Ethanol Red, due to efficient D-xylose utilization. The high D-xylose fermentation capacity was stable after extended growth in glucose. Cell extracts of strain GS1.11-26 displayed 17-fold higher XI activity compared to the parent strain, but overexpression of XI alone was not enough to establish D-xylose fermentation. The high D-xylose consumption rate was due to synergistic interaction between the high XI activity and one or more mutations in the genome. The GS1.11-26 had a partial respiratory defect causing a reduced aerobic growth rate. Conclusions: An industrial yeast strain for bioethanol production with lignocellulose hydrolysates has been developed in the genetic background of a strain widely used for commercial bioethanol production. The strain uses glucose and D-xylose with high consumption rates and partial cofermentation in various lignocellulose hydrolysates with very high ethanol yield. The GS1.11-26 strain shows highly promising potential for further development of an all-round robust yeast strain for efficient fermentation of various lignocellulose hydrolysates

Isolation, screening and characterization of microorganisms with potential for biofuels production

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Rapid global population growth has increased the demand for food and energy supply. The limited oil reserves, pollution concerns, global warming and political instability and disagreements, lead to an increased financial support for sustainable and environmental sources of energy, biofuels. In the last decades there is an increasing interest in the development of the bioethanol production from lignocellulosic residues, which do not compete directly with food. However, the low efficient conversion of cellulosic biomass to biofuels hinders its success. Alternative substrates are inulin containing plants, as Jerusalem artichoke, representing a renewable and inexpensive raw material for industry and biofuel production. In this work, the main goal was to search for new microorganisms, with high potential to produce bioethanol, due to the presence of better ethanologenic characteristics or ability to produce relevant hydrolytic enzymatic machinery. From the isolation and screening of 98 novel strains, 7 were selected and further characterized. A preliminary identification was performed using FISH. Three isolates which showed inulinase capacity gave a putative identification as Z. bailii strains, and the best (Talf1) was optimized and characterized for inulinase production. Talf1 enzymatic extract presented maximum activity (8.7 U/ml) at 45 ºC and pH 5.5, and high stability at 30ºC. Talf1 isolate was used in a Consolidated Bioprocessing (CBP) and its enzymatic extract in a Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) process, for bioethanol production, obtaining an ethanol yield of 45% and 47% from pure inulin; and a yield of 51% and 48% from Jerusalem artichoke juice, respectively. Four selected isolates from strawberry tree fruit (STF) were used in a fermentation assay using STF juice, producing 86 - 100 g/l of ethanol from this raw material, at a very high yield (47-50%). These results show the enormous potential of inulin and Jerusalem artichoke as substrates for bioethanol production and the application of these novel yeasts as ethanol and/or inulinase producers.A exploração de novos recursos energéticos foi crucial para a revolução tecnológica que ocorreu no início do século 19. Já nesse século se conhecia o enorme potencial do álcool como fonte de energia, visto que o primeiro protótipo de motor de ignição foi desenhado para funcionar com este combustível. No início do século 20, a produção de etanol foi substituída pela gasolina, devido ao baixo custo de extração. Os combustíveis fósseis têm sido, desde então, a principal fonte de energia utilizada. O rápido aumento da população tem intensificado a necessidade do aumento de produção alimentar e energética. As limitadas reservas de petróleo, preocupações ambientais, o aquecimento global e a instabilidade política renovaram o interesse e, consequentemente, o apoio financeiro direcionada para o desenvolvimento de fontes renováveis de energia, como os biocombustíveis. Vários tipos de biocombustíveis têm sido estudados, mas apenas dois são produzidos à escala industrial: o biodiesel e o bioetanol. O bioetanol apresenta as melhores qualidades para a sua utilização nos atuais motores, podendo ser utilizado como aditivo na gasolina, sendo por isso, o biocombustível mais utilizado a nível mundial (Antoni et al., 2007). A produção mundial de bioetanol à escala industrial utiliza principalmente duas fontes naturais: Saccharum officinarum (cana-de-açúcar) e Zea mays L. (milho). A cana-de-açúcar é sobretudo utilizada no Brasil, sendo o segundo maior produtor mundial de bioetanol, enquanto o milho é a principal fonte natural utilizada nos E.U.A., o maior produtor mundial. Estes dois países representam 88% da produção global (REN21). Na produção de bioetanol ocorre a fermentação alcoólica dos substratos naturais, diretamente a partir da cana-de-açúcar (que contém principalmente sacarose); para a bioconversão do milho (composto principalmente por amido) há necessidade de um passo prévio de hidrólise enzimática para a sua conversão em açúcares simples. O bioetanol obtido a partir de culturas agrícolas produzidas exclusivamente para esse fim, ocupando assim área cultivável, denomina-se Bioetanol de 1ª Geração (1G). Este tipo de produção levanta questões morais e éticas porque, deste modo, o bioetanol compete diretamente com a produção alimentar (Luo et al., 2009). Para ultrapassar este problema, tem sido proposto a utilização de resíduos lenhocelulósicos, como substratos, para produção de Bioetanol de 2ª Geração (2G). Este bioetanol não compete diretamente com a produção alimentar, apesar de consumir recursos agroindustriais. Atualmente a conversão de biomassa lenhocelulósica em bioetanol é ainda um procedimento caro e de baixa eficiência, sendo economicamente desfavorável a sua aplicação (Gibbons and Hughes, 2009). O principal obstáculo é o custo do pré-tratamento para conversão dos vários polímeros (celulose, hemicelulose, xilano, etc.) em açucares simples (glucose e xilose principalmente) que esta biomassa necessita, quer seja por degradação enzimática (com custos associados de produção de extratos enzimáticos); quer seja a aplicação de métodos químicos, como hidrólise ácida (que para além do seu custo, leva à produção de composto inibidores do crescimento microbiano). Existem vários bioprocessos propostos para a produção em larga escala de 2G nomeadamente a hidrólise separada da fermentação (SHF), em que o passo de hidrólise da biomassa lenhocelulósica antecede a fase de produção de bioetanol; a fermentação e sacarificação simultâneas (SSF), neste caso há a adição exógena de enzimas ou a co-fermentação de biomassa com um microrganismo produtor das enzimas necessárias à conversão dos polímeros nos seus monómeros, disponibilizando assim os açúcares simples para o microrganismo etanologénico os converter em etanol; e o bioprocesso consolidado (CBP), em que a produção de enzimas para a hidrólise enzimática e a produção de etanol ocorrem por ação do mesmo microrganismo (considerado o melhor processo conceptual) (Lynd, 1996). Infelizmente não está descrito nenhum microrganismo que, simultaneamente, seja capaz de produzir a maquinaria enzimática necessária para a hidrólise da biomassa lenhocelulósica e que a produção de etanol atinja valores de rendimento e produtividade economicamente viáveis. Dadas as dificuldades de implementação à escala industrial do 2G e movidos por preocupações ambientais, de utilização de solos cultiváveis e o desequilíbrio atual no ciclo de carbono, levou alguns cientistas a desenvolver o Bioetanol de 3ª Geração (3G). Este bioetanol recorre a microalgas com elevado conteúdo nutritivo para a sua produção. Ao invés de aproveitar resíduos agroindustriais como substrato, as algas são produzidas explorando os recursos hídricos para a produção de biomassa. Desta forma, não há competição com produção alimentar nem área cultivável e não há utilização de recursos agroindustriais. No entanto, o baixo rendimento de produção de biomassa torna este processo, ainda, economicamente inviável à escala industrial (Goh and Lee, 2010). Uma alternativa a estas opções é a utilização de plantas produtoras de inulina, como Helianthus tuberosus (tupinambo), que representam um recurso renovável, barato e abundante para a produção de bioetanol. O tupinambo tem várias características importantes que justificam a sua utilização, nomeadamente a tolerância a frio, à seca, ao vento e a terrenos arenosos e/ou salinos, com uma alta taxa de fertilidade e de resistência a pestes e doenças, não necessitando obrigatoriamente de terrenos férteis para se desenvolver. Estas características tornam-no numa fonte apetecível de biomassa para conversão em bioetanol que não compete pelos terrenos cultiváveis utilizados para produção alimentar (Neagu and Bahrim, 2011; Chi et al., 2011; Bajpai and Margaritis, 1982). Este trabalho teve como objetivo a procura de novos microrganismos, especialmente leveduras, a partir de isolamentos de diferentes fontes naturais, nomeadamente dos frutos de alfarrobeira (Ceratonia síliqua), ameixeira (Prunus domestica), cerejeira (Prunus avium), figueira (Ficus carica), medronheiro (Arbutus unedo) e pessegueiro (Prunus persica) e tubérculos de tupinambo (Helianthus tuberosus). Os microrganismos foram selecionados com base nas suas características etanologénicas (maior tolerância a elevadas concentrações de etanol, pH e temperatura e, por isso, capazes de fermentações alcoólicas mais longas); e/ou na capacidade de produção de enzimas relevantes, como inulinases, para posterior aplicação em bioprocessos industriais. A partir de 98 isolados, dos quais 90 eram leveduras e 8 bactérias, foram selecionados 7 isolados diferentes. Destes, 3 isolados foram selecionados porque apresentaram capacidade de converter inulina purificada em etanol; os outros 4 isolados foram selecionados porque foram capazes de produzir etanol mais rapidamente, utilizando sumo de medronho como meio completo. Às 7 estirpes foi aplicado um procedimento de identificação preliminar, utilizando sondas marcadas com um fluoróforo, para hibridação de fluorescência in situ (FISH), especificas para várias espécies de leveduras vínicas, nomeadamente: Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Metschnikowia pulcherrima, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii e Zygosaccharomyces bailii. As 7 estirpes apresentaram um resultado positivo para apenas uma destas sondas, distribuindo-se por três espécies diferentes: Lachancea thermotolerans (AP1), Saccharomyces cerevisiae (DP2 e GluP4) e Zygosaccharomyces bailii (GerP3, Calf2, Talf1 e Talf2). Foi realizado um controlo positivo em cada experiencia de FISH para cada sonda testada, utilizaram-se estirpes identificadas e existentes no laboratório, nomeadamente: CBS 314 (Hanseniaspora uvarum), Kluyveromyces marxianus 516F, CBS 2803 (Lachancea thermotolerans), NRRL Y-987 (Metschnikowia pulcherrima), Saccharomyces cerevisiae CCMI 885, PYCC 4478 (Torulaspora delbrueckii) e Zygosaccharomyces bailii 518F. Foi também utilizada uma sonda universal para células eucariotas (EUK516) em todas as células utilizadas, como controlo positivo, de forma a assegurar a presença de RNA acessível nas células após o procedimento de fixação, essencial na técnica de FISH. Esta identificação preliminar deverá ser validada com técnicas moleculares mais precisas, complementadas com estudos completos de morfologia e fisiologia. Das estirpes preliminarmente identificadas como Z. bailii, três (Calf2, Talf1 e Talf2) apresentaram capacidade de produção de inulinases, uma caraterística não referenciada em estirpes desta espécie (Kurtzman et al., 2011). Foi traçado um perfil metabólico das estirpes, Calf2, Talf1 e Talf2, em confronto com a estirpe Z. bailii 518F utilizando duas galerias API distintas: API ZYM and the API 20C AUX. Conclui-se que as três estirpes têm perfiz metabólicos semelhantes entre si e com Z. bailii 518F, revelando características fisiológicas importantes para aplicação futura. A produção de inulinases é uma característica essencial para a fermentação de inulina em etanol, permitindo a utilização de matérias-primas ricas em inulina como substrato para produção de bioetanol. Com esta finalidade, foi avaliada a produção de inulinases extracelulares das 3 estirpes, utilizando dois substratos indutores: a inulina (extraída de chicória) e o sumo de tupinambo. A estirpe Talf1 apresentou maior atividade enzimática extracelular quando induzida com sumo de tupinambo (8,7 U/ml) do que a estirpe Calf2 e Talf2, que atingiram 4,1 e 7,8 U/ml respetivamente. Utilizando inulina purificada como substrato indutor, todas as estirpes atingiram aproximadamente 0,6 U/ml de atividade enzimática no extrato celular, o que demonstra a fraca capacidade de indução por parte da inulina purificada. De forma a otimizar a produção de inulinases, utilizando a estirpe Talf1, foram testados outros substratos como indutores de inulinases: duas inulinas comerciais, extraídas de fontes naturais diferentes; e três matérias-primas: raízes de acelga, tubérculos de dália e o resíduo sólido de tupinambo, obtido após extração do sumo. Conclui-se que as inulinas comerciais purificadas são fracos indutores, não atingindo valores superiores a 0,6 U/ml, enquanto todas as matérias-primas naturais induziram positivamente a produção de inulinases, obtendo 1,9 U/ml com raízes de acelga, 1,5 U/ml com tubérculos de dália e 5,9 com o resíduo sólido de tupinambo. Concluiu-se que o tupinambo, em particular o sumo, é o melhor substrato indutor, para a produção de inulinases extracelulares utilizando a estirpe Talf1. Foi feita a caracterização bioquímica do extrato enzimático desta estirpe, revelando que a temperatura e o pH ótimos de atividade são 45ºC e 5,5 respetivamente. Foi determinada a estabilidade à temperatura e ao pH; o extrato enzimático manteve 57% da sua atividade inicial ao fim de 24 dias, quando mantido a 30ºC e ao pH natural (5,5). No entanto alterações de pH diminuem drasticamente a estabilidade do extrato (a 30 ºC). As características do extrato enzimático da estirpe Talf1 são promissoras para a sua posterior utilização em bioprocessos que utilizem inulina ou fontes ricas em inulina como substrato desde que ocorram a pH ácido (aproximadamente 5,5) e à temperatura de 30ºC. Dadas as características descritas, a estirpe Talf1 foi utilizada num bioprocesso consolidado (CBP) e o respetivo extrato enzimático utilizado num processo de fermentação e sacarificação simultâneas (SSF) para produção de bioetanol. Para o processo SSF foi utilizada a estirpe etanologénica S. cerevisiae CCMI 885 e o meio foi suplementado com o extrato enzimático produzido por Talf1. Na utilização de inulina como única fonte de carbono, o processo SSF apresentou maior rendimento e produtividade máximos de etanol (47% e 2,75 g.l-1.h-1) e obteve-se maior concentração de etanol no meio (78 g/l), enquanto no processo CBP produziram-se 67 g/l de etanol, com um rendimento e produtividade máximos de 45% e 1,70 g.l-1.h-1 respetivamente. Foi realizado, em paralelo, um crescimento controlo com S. cerevisiae CCMI 885 e inulina como única fonte de carbono. Nestas condições, foram produzidas apenas 50 g/l de etanol, o que demonstra que a adição do extrato enzimático levou à hidrólise de polímeros de inulina que não são utilizados naturalmente por S. cerevisiae, apesar desta estirpe conseguir produzir enzimas que degradam parcialmente polímeros de inulina. A produção de bioetanol a partir diretamente de sumo de tupinambo foi testada pelos dois bioprocessos (SSF e CBP). Neste caso obtiveram-se melhores resultados utilizando a levedura Talf1 no bioprocesso consolidado. A estirpe Talf1 atingiu melhor produtividade (3,62 g.l-1.h-1,), rendimento (51%) e concentração máximas de etanol (67 g/l), do que a estirpe S. cerevisiae CCMI 885 em sumo de tupinambo (SSF), suplementado com o extrato enzimático contendo inulinases, que produziu 62 g/l de etanol, com um rendimento e produtividade máximos de 48% e 2,40 g.l-1.h-1, respetivamente. No ensaio controlo, utilizando a levedura S. cerevisiae CCMI 885 sem adição de qualquer enzima, obtiveram-se menores resultados de rendimento e produtividade máxima (42% e 2,07 g.l-1.h-1) e apenas 55 g/l de etanol produzido, um valor inferior aos resultados obtidos com os anteriores bioprocessos. Estes resultados são consistentes com os obtidos apenas com inulina como fonte de carbono, reforçando a hipótese de que esta estirpe, S. cerevisiae CCMI 885, seja capaz de hidrolisar algumas cadeias de inulina, mas não utilizar todos os açúcares presentes no sumo de tupinambo. Estes resultados mostram o potencial da inulina e fontes naturais ricas em inulina, como o tupinambo, para fontes alternativas na produção de bioetanol. No entanto para a aplicação industrial das estirpes descritas neste trabalho, será necessária posterior otimização de todo o processo. As 4 leveduras selecionadas a partir do rastreio inicial de fermentação de sumo de medronho (L. thermotolerans AP1, S. cerevisiae DP2, S. cerevisiae GluP4 e Z. bailii GerP3), foram utilizadas num ensaio de fermentação de sumo de medronho, em comparação com S. cerevisiae CCMI 885. O melhor resultado foi obtido com a estirpe S. cerevisiae CCMI 885, atingindo-se 108 g/l de etanol, com um rendimento máximo de 51%, igual ao teórico possível, e uma produtividade máxima de 1,29 g.l-1.h-1. No entanto, a estirpe de Z. bailii GerP3, com valores máximos de etanol, produtividade e rendimento máximos de 100 g/l, 1,11 g.l-1.h-1 e 50%, respetivamente, são próximos daqueles obtidos com a levedura S. cerevisiae. A estirpe Z. bailii GerP3 obteve, por isso, os resultados mais promissores para a aplicação num sistema de fermentação em estado sólido diretamente a partir de medronho. O desenvolvimento de um processo eficiente e economicamente viável para produção de bioetanol é crucial para a sociedade atual, servindo como alternativa à utilização de combustíveis fósseis, para uma população mundial que requer cada vez mais energia. A utilização de fontes naturais como o tupinambo e o medronho, para a produção de bioetanol, pode ajudar a reduzir a dependência energética dos combustíveis fósseis. No entanto, para produzir industrialmente bioetanol a partir destas fontes naturais renováveis, e ainda necessária a otimização do processo a escala industrial

125th anniversary review: fuel alcohol: current production and future challenges

Global research and industrial development of liquid transportation biofuels are moving at a rapid pace. This is mainly due to the significant roles played by biofuels in decarbonising our future energy needs, since they act to mitigate the deleterious impacts of greenhouse gas emissions to the atmosphere that are contributors of climate change. Governmental obligations and international directives that mandate the blending of biofuels in petrol and diesel are also acting as great stimuli to this expanding industrial sector. Currently, the predominant liquid biofuel is bioethanol (fuel alcohol) and its worldwide production is dominated by maize-based and sugar cane-based processes in North and South America, respectively. In Europe, fuel alcohol production employs primarily wheat and sugar beet. Potable distilled spirit production and fuel alcohol processes share many similarities in terms of starch bioconversion, fermentation, distillation and co-product utilisation, but there are some key differences. For example, in certain bioethanol fermentations, it is now possible to yield consistently high ethanol concentrations of ~20% (v/v). Emerging fuel alcohol processes exploit lignocellulosic feedstocks and scientific and technological constraints involved in depolymerising these materials and efficiently fermenting the hydrolysate sugars are being overcome. These so-called secondgeneration fuel alcohol processes are much more environmentally and ethically acceptable compared with exploitation of starch and sugar resources, especially when considering utilisation of residual agricultural biomass and biowastes. This review covers both first and second-generation bioethanol processes with a focus on current challenges and future opportunities of lignocellulose-to-ethanol as this technology moves from demonstration pilot-plants to full-scale industrial facilities

Adaptive laboratory evolution principles and applications for biotechnology

Adaptive laboratory evolution is a frequent method in biological studies to gain insights into the basic mechanisms of molecular evolution and adaptive changes that accumulate in microbial populations during long term selection under specified growth conditions. Although regularly performed for more than 25 years, the advent of transcript and cheap next-generation sequencing technologies has resulted in many recent studies, which successfully applied this technique in order to engineer microbial cells for biotechnological applications. Adaptive laboratory evolution has some major benefits as compared with classical genetic engineering but also some inherent limitations. However, recent studies show how some of the limitations may be overcome in order to successfully incorporate adaptive laboratory evolution in microbial cell factory design. Over the last two decades important insights into nutrient and stress metabolism of relevant model species were acquired, whereas some other aspects such as niche-specific differences of non-conventional cell factories are not completely understood. Altogether the current status and its future perspectives highlight the importance and potential of adaptive laboratory evolution as approach in biotechnological engineering.(VLID)90682

Strategies to increase tolerance and robustness of industrial microorganisms

The development of a cost-competitive bioprocess requires that the cell factory converts the feedstock into the product of interest at high rates and yields. However, microbial cell factories are exposed to a variety of different stresses during the fermentation process. These stresses can be derived from feedstocks, metabolism, or industrial production processes, limiting production capacity and diminishing competitiveness. Improving stress tolerance and robustness allows for more efficient production and ultimately makes a process more economically viable. This review summarises general trends and updates the most recent developments in technologies to improve the stress tolerance of microorganisms. We first look at evolutionary, systems biology and computational methods as examples of non-rational approaches. Then we review the (semi-)rational approaches of membrane and transcription factor engineering for improving tolerance phenotypes. We further discuss challenges and perspectives associated with these different approaches

Addressing Fatty Acids Toxicity and Production in Biocatalysts

Fatty acids recently gain more attentions due to its potentials as fuel and chemicals. However, they are toxic to biocatalysts like many other biofuel compounds. Understanding the inhibitory mechanism can help to improve the production of fatty acids. In current study, the toxicity of short chain fatty acids: hexanoic, octanoic, and decanoic acid on Saccharomyces. cerevisiae and Escherichia.coli were inverstigated with a focus on octanoic acid. The toxicity of fatty acids (hexanoic, octanoic, and decanoic acid) in S. cerevisiae is dependent on doses and chain lengths, and also leads to damaged membrane intergirity, which was confirmed by increased membreane leakage. This induction of membrane leakage could be significantly decreased by inctroducing endogenous oleic acid into cell membrane. Although E.coli cells showed different response from S. cerevisiae when stressed by hexanoic, octanoic, and decanoic acid, similar disrupted membrane intergirity also occurred under octanoic acid stress. Futhermore, increased saturated:unsaturated lipid ratio in E. coli was also reported. Thus, manipulating memberane lipid to restore membrane integrity possibly overcome toxicity of fatty acids and improve production. Medium chain length carboxylic acids drive more attention because of their broad application in our life. In this thesis, Transcriptomic analysis was applied to construct a robust E.coli strain for production of medium chain length fatty acids. The first generation engineered strain ML103 (pXZ18Z) (deletion of fatty acid β-oxidation pathway, over-expression of fatty acid elongation gene (fabZ) and acyl-ACP thioesterase from R. communis ) was used as a host strain to study the possible pathway. Transcriptome analysis revealed a series of disturbed genes and transcription factors including stress response, biofilm, transporters, nitrogen limitation and membrane disruption

Short-term adaptation of S. cerevisiae to lignocellulosic inhibitors: Underlying metabolic and physiological changes

The limited tolerance of Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) to inhibitors present in lignocellulosic hydrolysates is a major challenge in second-generation bioethanol production. Short-term adaptation of the yeast to lignocellulosic hydrolysates during cell propagation has been shown to improve its tolerance, and thus its performance in lignocellulose fermentation. The overall aim of this thesis was to identify molecular and physiological changes during short-term adaptation.In order to facilitate testing of S. cerevisiae physiology in lignocellulosic hydrolysate, a high-throughput methodology for the analysis of yeast strains in dark medium was developed. This methodology allows for monitoring of both aerobic and anaerobic growth of yeast in medium containing different hydrolysates at high reproducibility. The effect that individual nutrient components during propagation, rather than fermentation, has on lignocellulose fermentation performance is lacking. A high-throughput screening of certain vitamins, trace metals and nitrogen sources was performed. It was found that adding a mixture of pyridoxine, thiamine, and biotin to unadapted propagation cultures improved cell growth and ethanol yields during fermentation in wheat straw hydrolysate. Supplementing the propagation medium with nutrients in combination with short-term adaptation was thus demonstrated to be a promising strategy to improve the efficiency of industrial lignocellulosic fermentation.Different S. cerevisiae strain backgrounds are used in the production of a suitable second-generation bioethanol host. In order to facilitate application of results obtained in laboratory experiments it is important to know whether short-term adaptation affects different strains differently. The physiology of two industrial S. cerevisiae strains were investigated while being short-term adapted. During propagation, fed with a hydrolysate containing feed, ethanol accumulation was observed for strain CR01 but not for KE6-12. Additionally, a larger increase in specific ethanol productivity for CR01 was observed than for KE6-12. Thus, short-term adaptation was found to affect S. cerevisiae physiology differently depending on strain background. To gain a more complete insight into the metabolic changes that S. cerevisiae experiences during short‑term adaptation, RNA sequencing was performed on a time-series of samples taken from propagation cultures undergoing short-term adaptation. Expression data was compared to a non‑adapted control using differential gene expression analysis. Results demonstrate, among others, an interesting role for multidrug proton antiporters YHK8 and FLR1 in the process of short-term adaptation

Quantitative evaluation of yeast's requirement for glycerol formation in very high ethanol performance fed-batch process

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Glycerol is the major by-product accounting for up to 5% of the carbon in <it>Saccharomyces cerevisiae </it>ethanolic fermentation. Decreasing glycerol formation may redirect part of the carbon toward ethanol production. However, abolishment of glycerol formation strongly affects yeast's robustness towards different types of stress occurring in an industrial process. In order to assess whether glycerol production can be reduced to a certain extent without jeopardising growth and stress tolerance, the yeast's capacity to synthesize glycerol was adjusted by fine-tuning the activity of the rate-controlling enzyme glycerol 3-phosphate dehydrogenase (GPDH). Two engineered strains whose specific GPDH activity was significantly reduced by two different degrees were comprehensively characterized in a previously developed Very High Ethanol Performance (VHEP) fed-batch process.</p> <p>Results</p> <p>The prototrophic strain CEN.PK113-7D was chosen for decreasing glycerol formation capacity. The fine-tuned reduction of specific GPDH activity was achieved by replacing the native <it>GPD1 </it>promoter in the yeast genome by previously generated well-characterized <it>TEF </it>promoter mutant versions in a <it>gpd2</it>Δ background. Two <it>TEF </it>promoter mutant versions were selected for this study, resulting in a residual GPDH activity of 55 and 6%, respectively. The corresponding strains were referred to here as <it>TEFmut7 </it>and <it>TEFmut2</it>. The genetic modifications were accompanied to a strong reduction in glycerol yield on glucose; the level of reduction compared to the wild-type was 61% in <it>TEFmut7 </it>and 88% in <it>TEFmut2</it>. The overall ethanol production yield on glucose was improved from 0.43 g g^-1in the wild type to 0.44 g g^-1measured in <it>TEFmut7 </it>and 0.45 g g^-1in <it>TEFmut2</it>. Although maximal growth rate in the engineered strains was reduced by 20 and 30%, for <it>TEFmut7 </it>and <it>TEFmut2 </it>respectively, strains' ethanol stress robustness was hardly affected; i.e. values for final ethanol concentration (117 ± 4 g L^-1), growth-inhibiting ethanol concentration (87 ± 3 g L^-1) and volumetric ethanol productivity (2.1 ± 0.15 g l^-1h^-1) measured in wild-type remained virtually unchanged in the engineered strains.</p> <p>Conclusions</p> <p>This work demonstrates the power of fine-tuned pathway engineering, particularly when a compromise has to be found between high product yield on one hand and acceptable growth, productivity and stress resistance on the other hand. Under the conditions used in this study (VHEP fed-batch), the two strains with "fine-tuned" <it>GPD1 </it>expression in a <it>gpd2</it>Δ background showed slightly better ethanol yield improvement than previously achieved with the single deletion strains <it>gpd1</it>Δ or <it>gpd2</it>Δ. Although glycerol reduction is known to be even higher in a <it>gpd1</it>Δ <it>gpd2</it>Δ double deletion strain, our strains could much better cope with process stress as reflected by better growth and viability.</p