Einfluss eines hypoxischen Sauerstoffgehaltes auf entwicklungsbiologisch relevante Signalwege in humanen embryonalen Stammzellen und deren differenzierten Derivate

Im Rahmen dieser Dissertation wurden erstmals ausführlich die verschiedenen Effekte einer Kultivierung von hES Zellen und unterschiedlichen Differenzierungsstadien unter einem physiologisch, niedrigem Sauerstoffgehalt analysiert.  Für die Kultivierung von hES Zellen und deren differenzierenden Derivate wurde zunächst eine Kultivierungsmethode anhand von hES Zellen entwickelt, die eine hypoxische Kultivierung ohne Gelöstsauerstoff-schwankungen ermöglichte. Darüber hinaus konnte erstmals in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die direkte Konversion von hES Zellen in neurale Vorläuferzellen und die Kultivierung von hESNS Zellen unter einem niedrigen Sauerstoffgehalt möglich ist. Die Kultivierung der verschiedenen Differenzierungsstadien von hES Zellen löst abhängig von diesem Stadium eine Reduktion der Proliferation hervor. Darüber hinaus wirkt sich ein niedriger Sauerstoffgehalt nicht förderlich auf die Pluripotenz-Erhaltung und Reduktion der Spontandifferenzierung von hES Zellen aus, welches durch eine gesunkene RNA- und Protein-Expression Pluripotenz-assoziierter Marker wie Tra-1-60, Oct-4, Sox-2, Nanog und durch eine erhöhte RNA-Expression Multipotenz-assoziierter Marker wie Vimentin gezeigt werden konnte. Für direkt in neuroepithelialen Zellen konvertierte hES Zellen und hESNS Zellen konnte keine verbesserte Multipotenzerhaltung unter einem niedrigen Sauerstoffgehalt festgestellt werden. Bei einer hypoxischen Kultivierung von hES Zellen wurde der Wnt-Signalweg durch erhöhte GSK3ß-Proteinexpression reprimiert und der BMP-Signalweg durch erhöhte Smad1/5/8-Signaltransduktion induziert. Diese Signalwegregulation unter einem physiologisch niedrigen Sauerstoffgehalt ist ein erstes Indiz für die Einleitung der Differenzierung von hES Zellen in mesodermale und entodermale Zellen, und spiegelt die in vivo Entwicklung und Regelung der einzelnen Signalwege im Primitivstreifen wieder. Darüber hinaus wurde in direkt konvertierten hES Zellen der TGFβ/BMP-Signalweg reprimiert und der Notch-Signalweg induziert, welches auch in neuralen Vorläuferzellen beobachtet werden konnte. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten können die Grundlage für ausführliche Analysen des Effektes eines niedrigen Sauerstoffgehaltes auf verschiedenste Signalwege, die in der Embryonalentwicklung involviert sind, an hES Zellen und differenzierten Derivaten bieten. Darüber hinaus bietet eine hypoxische Kultivierung und Differenzierung die Möglichkeit die in vivo Entwicklung des humanen Embryos in vitro nachzuvollziehen. Eine hypoxische Kultivierung von hES Zellen und differenzierten Phänotypen bietet zusätzlich die Möglichkeit pharmakologische Screenings unter in vivo Bedingungen zu simulieren und eröffnet somit ein neues Feld für pharmazeutische Industrie. So könnte eine hypoxische Kultivierung es ermöglichen in vitro die in vivo Embryotoxizität von Medikamenten nachzuvollziehen

Hybrid-organische Photodioden für die Radiographie

Lösungsprozessierte Detektoren ermöglichen eine kosteneffiziente und großflächige Abscheidung mittels Sprühbeschichtung. In einer organischen Halbleitermatrix aus P3HT:PCBM wurden anorganische GOS:Tb Szintillatoren eingebettet und ermöglichen eine hochauflösende quasi-direkte Detektion von Röntgenstrahlen. Mit einer pixelierten Backplane mit einem Pixelpitch von 98µm wurde eine räumliche Frequenz von 4.75lp/mm bei einer MTF=0.2 erreicht

Charakterisierung mikrobieller Elektrosynthesewege

Als Alternative zur Photosynthese bietet die mikrobielle Elektrosynthese eine vielversprechende Technologie, welche eine direkte Konversion von CO$_{2}$ durch den Eintrag elektrischer Energie ermöglicht. Kathodische Elektronen dienen dabei elektroautotrophen Mikroorganismen als alleinige Energie- und Elektronenquelle. In der Literatur beschriebene Organismen sind jedoch fast ausschließlich von einen wasserstoffvermittelten Elektronentransport abhängig. Da sich bei der kathodischen Wasserstoffentstehung abiotische mit biotischen Effekten überlagern, ist eine Charakterisierung der mikroben-Elektroden-Interaktion in diesem Fall jedoch kaum möglich. In dieser Arbeit wurde daher gezielt nach elektroautotrophen Organismen gesucht, welche nicht in der Lage sind Wasserstoff zu verwerten. Durch die Charakterisierung von $\textit{Sulfolobus acidocaldarius}$ auf einer Kathode gelang erstmals der Nachweis eines elektroautotrophen Wachstums mit einem alternativen extrazellulären Elektronenaufnahme (EEA)-Mechanismus. Entscheidende Elemente darin scheinen Schwefeltransferasen einzunehmen. In einem zweiten Ansatz wurde für die Identifikation natürlicher EEAs eine kathodische Umweltanreicherungskultur charakterisiert. Ein vergleichbarer Mechanismus auf Basis von Schwefeltransferasen konnte ebenfalls im Hauptakteur der Kultur identifiziert werden. Dieser Stamm, welcher einen bisher unbekannten Vertreter der Chromatiaceae darstellt, besitzt eine Verwandtschaft zu " `$\textit{Ca}$. Tenderia electrophaga\u27\u27, einem elektrotrophen Bakterium aus einer marinen, kathodischen Anreicherung. Der Elektronentransport in diesem neuen Organismus scheint dabei neben Schwefeltransferasen auch über $\textit{c}$-Typ Cytochrome vermittelt zu werden. $\textit{C}$-Typ Cytochrome spielen in bioelektrochemischen Systemen eine entscheidende Rolle und wurden insbesondere in exoelektrogenen Stämmen an Anoden intensiv erforscht. Als zweites Ziel dieser Arbeit wurde daher eine Methode entwickelt um verbesserte, synthetische Elektronentransportketten zu identifizieren. Basierend auf der heterologen Expression von verschiedenen, homologen Genen für $\textit{c}$-Typ Cytochrome, konnte eine verbesserte Elektronentransferrate in $\textit{E. coli}$ erreicht werden. Diese setzt sich durch Gene aus den Modellorganismen $\textit{Shewanella oneidensis}$ und $\textit{Rhodopseudomonas palustris}$ zusammen. Insgesamt konnten in dieser Arbeit grundlegende Erkenntnisse zur Identifikation und Entwicklung neuer elektroautotropher Organismen gewonnen werden

Determination of the DQE of digital mammography devices

Die detektive Quantenausbeute (DQE) erlaubt eine umfassende Charakterisierung bildgebender Systeme, da sie sowohl etwas über das Auflösungsvermögen, als auch über die Rauscheigenschaften des Systems aussagt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die DQE zweier digitaler Mammographie-Einrichtungen bestimmt, wobei für vergleichbare Dosisniveaus folgende Ergebnisse erzielt wurden: Für eine Ortsfrequenz von einem Lp/mm beträgt die DQE des indirekten Systems ca. 42% und die des direkten Systems auf Basis von amorphem Selen ca. 62%.The detective quantum efficiency (DQE) is considered to be the most suitable parameter to characterise imaging systems. The DQE provides information about both, the spatial resolution and noise chracteristics of the system. Within the scope of this thesis the DQE of two digital mammography devices were determined. The results are as follows: for comparable exposure levels and a spatial frequency of one cycle/mm the DQE for the indirect system was found to be 42% and for the direct system based on amorphous selenia a DQE value of 62% was measured

Methodische Verbesserungen in der Mikrosporenkultur von Brassica napus L.

Bei der routinemäßigen Anwendung der Mikrosporenkultur zur Herstellung doppelt-haploider Linien kommt es bis heute zu Engpässen in der praktischen Rapszüchtung. Die Hauptprobleme stellen eine unzureichende Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate und eine niedrige direkte Regeneration von Pflanzen aus Mikrosporen-Embryonen dar. Ein hoher Prozentsatz an Rapsembryonen aus Mikrosporenkultur durchläuft den Prozess der sekundären Embryogenese, der eine zeitintensive Subkultivierung erfordert. Hierbei werden die direkten Sprossansätze wiederholt von undifferenziertem Gewebe freigeschnitten bis eine Überführung in Erde und die letztendliche Regeneration zu doppelt-haploiden Pflanzen möglich ist. Die vorliegende Doktorarbeit besteht aus zwei Studien, die sich mit dem Thema: „Methodische Verbesserungen der Mikrosporenkultur in Brassica napus L.“ auseinandersetzen. Ziel der ersten Studie war die Erhöhung der Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate von Mikrosporen ohne die Regeneration von Pflanzen aus den Mikrosporen-Embryonen zu verringern und damit die Entwicklung zu doppelt-haploiden Pflanzen zu verzögern. Aufgrund der hohen Toxizität von Colchizin wurden die weniger toxischen Mitosehemmstoffe Amiprophos-methyl (APM) und Pronamid, die eine höhere Affinität zu Pflanzentubulin als Colchizin besitzen, allein und in Kombination mit Colchizin untersucht. Eine Kombination dieser Mitosehemmstoffe führte zu keiner effizienten Diploidisierungsrate; demnach konnte ein synergistischer Effekt ausgeschlossen werden. Die acht untersuchten Winterrapsgenotypen erzielten eine Diploidisierungsrate von 40% bis 64%. Die Mitosehemmstoff-Behandlungen der isolierten Mikrosporen variierten hierbei zwischen 33% (3 µM APM, 72 Stunden) und 70% (25 µM Colchizin, 72 Stunden). Ein signifikanter Einfluss der Mitosehemmstoffe auf die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen konnte nicht nachgewiesen werden. In Abhängigkeit der Genotypen konvertierten 14% bis 23% direkt. Unterschiedliche getestete Colchizinkonzentrationen (250, 150, 125, 25 µM) zeigten für 4 untersuchte Genotypen eine Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate von 58% bis 66%, wobei die Behandlung 250 µM Colchizin für 48h die höchste Rate aufwies. Ein signifikanter Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO), das oftmals als Lösungsmittel der angewendeten Mitosehemmstoffe verwendet wird, konnte jedoch nicht in den untersuchten Konzentrationen (0,3% und 3%) in Kombination mit der Colchizin-Behandlung (250 µM, 72 Stunden) auf die Diploidisierungsrate und die direkte Konversionsrate nachgewiesen werden. Weiterhin wurden 17 Winterrapsgenotypen bezüglich ihrer spontanen und ihrer Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate untersucht und deren Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen bestimmt. Die ausgewählten Genotypen enthielten sowohl Sorten als auch F1–Hybriden. Die spontan-induzierte Diploidisierungsrate zeigte eine große Variation von 15% bis 69%. Im Vergleich dazu erreichte die Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate Werte von 40% bis 83%. Die Mikrosporen-Embryonen der getesteten Genotypen wiesen ebenfalls eine große Spannbreite bezüglich ihrer direkten Konversionsrate auf. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Einfluss der Mitosehemmstoff-Behandlung auf den Regenerationserfolg der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen. Sowohl die beobachtete spontane und die Mitosehemmstoff-induzierte Diploidisierung als auch die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen waren stark Genotyp-abhängig. Ziel der zweiten Studie war die Erhöhung der direkten Regeneration der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen trotz der starken Abhängigkeit der Genotypen. Zunächst wurde der Einfluss von zehn unterschiedlichen Sprossregenerationsmedien mit und ohne Phytohormone (Gibberellinsäure, 6-Benzylaminopurin, 3-Indolylbuttersäure) und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen von 5 Winterrapsgenotypen untersucht. Die 14-tägige Kältebehandlung erfolgte sowohl unter acht Stunden Licht als auch in Dunkelheit. Die Standardkultivierung der Mikrosporen-Embryonen erfolgte im Kulturraum bei 26 °C und 12 Stunden Licht. 13% bis 39% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt, wobei die höchste Rate von 43% nach Kultivierung der Embryonen auf Gamborg B5-Medium mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure resultierte. Die Mittelwerte der Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen aller untersuchten Genotypen und Kulturmedien wurden durch die 14-tägige Kältebehandlung (28%) gegenüber der Standardkultivierung (14%) signifikant erhöht. Nachfolgend wurde der Einfluss der vier effizientesten Sprossregenerationsmedien und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 1.5 °C und bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die Konversionsrate von Mikrosporen-Embryonen von 13 Winterrapsgenotypen untersucht. Die Kältebehandlung bei 1.5 °C erfolgte unter Lichtabwesenheit als auch unter acht Stunden Licht. Die Kältebehandlung bei 4 °C erfolgte dagegen in Dauerlicht und Dauerdunkel. Zwischen 29% und 76% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt. Im Vergleich zur Kultivierung unter Standardbedingungen konnte mit der Kältebehandlung eine signifikante Erhöhung erzielt werden (von 21% auf bis zu 71%). Nach vorheriger Kultivierung der Mikrosporen-Embryonen auf den unterschiedlichen Kulturmedien variierte die Konversionsrate zwischen 50% (MS) und 60% (B5 mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure). Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass trotz einer vorherrschenden starken Abhängigkeit vom Genotyp, die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen mit Kältebehandlung (1.5 °C im Dauerdunkel) signifikant erhöht werden konnte. Fast alle Genotypen zeigten Konversionsraten der Mikrosporen-Embryonen von über 70%. Es ist demnach möglich die sekundäre Embryogenese und die damit verbundene zeitintensive in vitro-Subkultivierung erheblich zu reduzieren, und dadurch den Entwicklungsprozess von doppelt-haploiden Linien zur Verwendung in der praktischen Rapszüchtung zu beschleunigen

Radialgliaähnliche Vorläuferzellen aus pluripotenten Stammzellen : ein stabiles Intermediat zur effizienten Generierung humaner Oligodendrozyten

Als myelinproduzierende Zellen spielen die Oligodendrozyten eine essenzielle Rolle für die Funktionalität des Zentralnervensystems (ZNS). Sie bilden die isolierenden Myelinscheiden der Neurone und garantieren so eine einwandfreie Reizweiterleitung selbst über große Distanzen. Myelinassoziierte Erkrankungen wie beispielsweise die Multiple Sklerose oder die Metachromatische Leukodystrophie können bislang lediglich symptomatisch behandelt aber nicht geheilt werden und demonstrieren mit ihrer schwerwiegenden Symptomatik die Bedeutung der Oligodendrozyten für das Nervensystem. Ein zentrales Kriterium für die Entwicklung verbesserter Therapiestrategien stellt das grundlegende Verständnis der Entwicklung und Funktion des betroffenen Zelltyps dar. Der Zugang zu humanen Oligodendrozyten kann über die eingeschränkte Bereitstellung von Primärgewebe oder die Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen (pluripotent stem cells, PSC) in den gewünschten Zelltyp erfolgen. Bislang erfolgt die Gewinnung von humanen Oligodendrozyten in vitro über direkte, langwierige Differenzierungsstrategien, welche abhängig sind von der sensiblen Qualität der humanen PSC. Weiterhin beeinflussen lange Differenzierungszeiträume die Stabilität und Qualität der resultierenden Kulturen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nun ein Zugang zu Oligodendrozyten aus humanen neuralen Vorläuferzellen (neural precursor cells, NPC) ermöglicht, um die beschriebenen Komplikationen in der Generierung der Oligodendrozyten zu umgehen. Zu diesem Zweck werden humane embryonale Stammzellen sowie induziert pluripotente Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPSC) neural differenziert und radialgliaähnliche NPC (radial glia like NPC, RGL-NPC) über einen Antikörper gegen den NSC-Marker CD133 immunisoliert. Die resultierenden RGL-NPC bilden eine über mindestens 40 Passagen hinweg stabil adhärent proliferierende, kryokonservierbare Kultur, welche Marker von NSC und Radialglia wie Nestin, SOX2, ASCL1, BLBP und Vimentin exprimieren. Diese Zellen lassen sich unter Entzug der Wachstumsfaktoren tripotent in die Hauptzelltypen des ZNS, Neurone, Astrozyten und Oligodendrozyten, differenzieren. Die Entwicklung eines spezifischen oligodendroglialen Differenzierungsschemas ermöglicht die Induktion der essenziellen oligodendroglialen Transkriptionsfaktoren OLIG1/2, NKX6-2 und SOX10, wodurch NG2- positive Oligodendrozytenvorläufer generiert werden können, welche sich weiter in O4-, 4860- und MBP-positive Oligodendrozyten entwickeln. Nach Transplantation in die hypomyelinisierte Shiverer-Maus reifen die RGL-NPC zu funktionellen myelinisierenden Oligodendrozyten heran. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die Generierung eines stabilen Intermediats zwischen humanen PSC und Oligodendrozyten. Die Gewinnung humaner Oligodendrozyten kann somit erfolgen, ohne wiederholt auf sensible PSC zurückgreifen zu müssen. Die Möglichkeit der Generierung iPSC-abgeleiteter Oligodendrozyten verschafft darüber hinaus einen Zugang zu patientenspezifischen Zellen, welche einen essenziellen Beitrag zur Untersuchung myelinassoziierter Erkrankungen sowie der Entwicklung potenzieller Therapien liefern können