12 research outputs found
Estudis sobre la conformació del segment d'activació de la procarboxipeptidasa A porcina i la seva relació amb les proteïnes fixadores de Ca²⁺ de la família EF-hand
Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaMolts enzims i proteïnes fisiològicament actives se sintetitzen en forma de precursors inactius o zimògens. La seva activació per proteòlisi limitada és un mecanisme de regulació enzimàtica. En aquesta treball s'ha estudiat el fragment alliberat en l'activació proteolítica d'un proenzim pancreàtic, la procarboxipeptidasa A (PCPA) monomèrica de pàncrees porcí. La caracterització estructural d'aquest segment es va portar a terme estudiant-lo aïllat i unit a l'enzim actiu amb la finalitat d'esbrinar si la conformació que presenta és la mateixa en els dos casos. Els resultats indicaren que un cop alliberat de l'enzim el segment d'activació de la PCPA presenta una conformació diferent amb un elevat grau de flexibilitat conformacional. El segment d'activació aïllat presentà una elevada termoestabilitat, molt superior a la del proenzim, essent el seu procés de desnaturalització reversible i presentant un únic domini estructural. Estudis per ressonància magnètica nuclear indicaren que aquest segment presenta una estructura globular, la qual es manté en un ample marge de valors de pH, i confirmaren l'elevada flexibilitat conformacional. La estructura primària del segment d'activació de la PCPA presentà una similitud important amb proteïnes fixadores de calci de la família EF-hand amb dos potencials regions fixadores de calci. Estudis teòrics de predicció de la seva estructura secundària corroboraren la presència d'aquestes dues regions. A fi de comprovar si aquest segment pertanyia a l'esmentada família proteica es comprovà experimentalment la seva capacitat per a fixar calci. Els resultats indicaren una feble unió de calci, per tant, no es podia considerar aquest segment com a membre de la família de proteïnes fixadores de calci de tipus EF-hand. No obstant, sí que la seva estructura es troba relacionada amb aquesta família de proteïnes ja que es va observar que presentava una sèrie de característiques que també acompleixen les proteïnes d'aquesta família. Va presentar capacitat per a fixar Tb3+, metall que pot substituir al Ca2+ i un comportament en interaccionar amb el colorant Stains-all semblant a la calmodulina, una proteïna que pertany a la família de proteïnes fixadores de calci tipus EF-hand. Els resultats, per tant, permeteren concloure que el segment d'activació de la PCPA de pàncrees porcí està estructuralment relacionat amb les proteïnes fixadores de calci de la família EF-hand. Aquest aspecte és interessant atesa la longitud del segment d'activació estudiat (94 aminoàcids) ja que permet hipotetitzar un possible origen evolutiu d'aquest segment. No és fàcil comprendre que un segment d'aquestes dimensions pugui tenir com a única funció actuar d'inhibidor d'un enzim.Muchos enzimas y proteínas fisiológicamente activas se sintetizan en forma de precursores inactivos o zimógenos. Su activación por proteólisis limitada es un mecanismo de regulación enzimática. En este trabajo se ha estudiado el fragmento liberado en la activación proteolítica de un proenzima pancreático, la procarboxipeptidasa A (PCPA) monomérica de páncreas porcino. La caracterización estructural de este segmento se llevó a cabo estudiándolo aislado y unido al enzima activo con la finalidad de discernir si la conformación que presenta es la misma en los dos casos. Los resultados indicaron que, un una vez liberado del enzima, el segmento de activación de la PCPA presenta una conformación diferente con un elevado grado de flexibilidad conformacional. El segmento de activación aislado presentó una elevada termoestabilidad, muy superior a la del proenzima, siendo su proceso de desnaturalización reversible y presentando un único dominio estructural. Estudios de resonancia magnética nuclear indicaron que este segmento presenta una estructura globular, la cual se mantiene en un amplio margen de valores de pH, y confirmaron la elevada flexibilidad conformacional. La estructura primaria del segmento de activación de la PCPA presentó una similitud importante con secuencias de proteínas fijadores de calcio de la familia EF-hand con dos potenciales regiones fijadores de este metal. Estudios teóricos de predicción de su estructura secundaria corroboraron la presencia de estas dos regiones. Con la finalidad de comprobar si este segmento pertenecía a la citada familia de proteínas se comprobó experimentalmente su capacidad para a fijar calcio. Los resultados indicaron una débil unión de este metal, por tanto, no se podía considerar este segmento como un miembro de la familia de proteínas fijadores de calcio del tipo EF-hand. No obstante, sí que su estructura se halla relacionada con esta familia de proteínas ya que se observó que presentaba una serie de características que también se dan en les proteínas de esta familia. Presentó capacidad para fijar Tb3+, metal que puede sustituir al Ca2+ y un comportamiento al interaccionar con el colorante Stains-all muy similar al que presenta la calmodulina, una proteína que pertenece a la familia de proteínas fijadoras de calcio tipo EF-hand. Los resultados, permitieron concluir que el segmento de activación de la PCPA de páncreas porcino está estructuralmente relacionado con les proteínas fijadores de calcio de la familia EF-hand. Este aspecto es interesante, teniendo en cuenta la longitud del segmento de activación estudiado (94 aminoácidos), ya que permite hipotetizar un posible origen evolutivo del mismo. No es fácil comprender que un segmento de estas dimensiones pueda tener como única función actuar de inhibidor de un enzima.Many enzymes and physiological active proteins are synthesized as inactive precursors or zymogens. Their activation by limited proteolysis is a mechanism of enzymatic regulation. In the present work, it has been studied the fragment released in the proteolytic activation of a porcine pancreatic zymogen, monomeric procarboxypeptidase A (PCPA). Its structural characterization was carried out studying the segment isolated and linked to the active enzyme forming the zymogen in order to test whether its conformation was the same in both cases. The results showed that, once released from the zymogene, the activation segment of PCPA presented a different conformation with a high conformational flexibility. The isolated activation segment showed a significant thermostability, higher than that presented by the proenzyme. Its thermal unfolding was completely reversible and it was observed that the protein was composed by single domain. NMR studies indicated that this segment is a globular protein, which structure is maintained in wide range of pH values, and confirmed its high degree of conformational flexibility. The activation segment of PCPA showed a significant degree of sequence homology with members of the EF-hand calcium binding protein family, with two potential sites for metal binding. Theoretical studies on the secondary structure prediction confirmed the presence of these two regions on its structure. To test whether this segment belonged to the above mentioned protein family, its ability to bind calcium was experimentally tested. The results showed a weak binding of this metal. Thus, it was not possible to consider this protein as a member of the EF-hand calcium binding protein family. Nevertheless, its structure was indeed related to this family of proteins because it was observed that the segment presented a set of characteristics typical of members of this family. It presented ability to bind Tb3+, a metal that can substitute Ca2+, and when its interaction with the dye Stains-all was tested, a similar behaviour to that presented by calmodulin, a protein that belongs to the calcium binding EF-hand protein family, was observed. In a whole the results allowed to conclude that the activation segment of monomeric porcine PCPA is structurally related to the members of the calcium binding EF-hand protein family. This finding is very interesting taking into account the length of this segment (94 residues. A possible evolutive origin can be envisaged. It is not easy to understand that such a long segment has as a unique function to act as inhibitor of an enzyme
Estudis sobre la conformació del segment d'activació de la procarboxipeptidasa A porcina i la seva relació amb proteïnes fixadores de Ca(2+) de la família EF-hand
Molts enzims i proteïnes fisiològicament actives se sintetitzen en forma de precursors inactius o zimògens. La seva activació per proteòlisi limitada és un mecanisme de regulació enzimàtica. En aquesta treball s'ha estudiat el fragment alliberat en l'activació proteolítica d'un proenzim pancreàtic, la procarboxipeptidasa A (PCPA) monomèrica de pàncrees porcí. La caracterització estructural d'aquest segment es va portar a terme estudiant-lo aïllat i unit a l'enzim actiu amb la finalitat d'esbrinar si la conformació que presenta és la mateixa en els dos casos. Els resultats indicaren que un cop alliberat de l'enzim el segment d'activació de la PCPA presenta una conformació diferent amb un elevat grau de flexibilitat conformacional. El segment d'activació aïllat presentà una elevada termoestabilitat, molt superior a la del proenzim, essent el seu procés de desnaturalització reversible i presentant un únic domini estructural. Estudis per ressonància magnètica nuclear indicaren que aquest segment presenta una estructura globular, la qual es manté en un ample marge de valors de pH, i confirmaren l'elevada flexibilitat conformacional. La estructura primària del segment d'activació de la PCPA presentà una similitud important amb proteïnes fixadores de calci de la família EF-hand amb dos potencials regions fixadores de calci. Estudis teòrics de predicció de la seva estructura secundària corroboraren la presència d'aquestes dues regions. A fi de comprovar si aquest segment pertanyia a l'esmentada família proteica es comprovà experimentalment la seva capacitat per a fixar calci. Els resultats indicaren una feble unió de calci, per tant, no es podia considerar aquest segment com a membre de la família de proteïnes fixadores de calci de tipus EF-hand. No obstant, sí que la seva estructura es troba relacionada amb aquesta família de proteïnes ja que es va observar que presentava una sèrie de característiques que també acompleixen les proteïnes d'aquesta família. Va presentar capacitat per a fixar Tb3+, metall que pot substituir al Ca2+ i un comportament en interaccionar amb el colorant Stains-all semblant a la calmodulina, una proteïna que pertany a la família de proteïnes fixadores de calci tipus EF-hand. Els resultats, per tant, permeteren concloure que el segment d'activació de la PCPA de pàncrees porcí està estructuralment relacionat amb les proteïnes fixadores de calci de la família EF-hand. Aquest aspecte és interessant atesa la longitud del segment d'activació estudiat (94 aminoàcids) ja que permet hipotetitzar un possible origen evolutiu d'aquest segment. No és fàcil comprendre que un segment d'aquestes dimensions pugui tenir com a única funció actuar d'inhibidor d'un enzim.Muchos enzimas y proteínas fisiológicamente activas se sintetizan en forma de precursores inactivos o zimógenos. Su activación por proteólisis limitada es un mecanismo de regulación enzimática. En este trabajo se ha estudiado el fragmento liberado en la activación proteolítica de un proenzima pancreático, la procarboxipeptidasa A (PCPA) monomérica de páncreas porcino. La caracterización estructural de este segmento se llevó a cabo estudiándolo aislado y unido al enzima activo con la finalidad de discernir si la conformación que presenta es la misma en los dos casos. Los resultados indicaron que, un una vez liberado del enzima, el segmento de activación de la PCPA presenta una conformación diferente con un elevado grado de flexibilidad conformacional. El segmento de activación aislado presentó una elevada termoestabilidad, muy superior a la del proenzima, siendo su proceso de desnaturalización reversible y presentando un único dominio estructural. Estudios de resonancia magnética nuclear indicaron que este segmento presenta una estructura globular, la cual se mantiene en un amplio margen de valores de pH, y confirmaron la elevada flexibilidad conformacional. La estructura primaria del segmento de activación de la PCPA presentó una similitud importante con secuencias de proteínas fijadores de calcio de la familia EF-hand con dos potenciales regiones fijadores de este metal. Estudios teóricos de predicción de su estructura secundaria corroboraron la presencia de estas dos regiones. Con la finalidad de comprobar si este segmento pertenecía a la citada familia de proteínas se comprobó experimentalmente su capacidad para a fijar calcio. Los resultados indicaron una débil unión de este metal, por tanto, no se podía considerar este segmento como un miembro de la familia de proteínas fijadores de calcio del tipo EF-hand. No obstante, sí que su estructura se halla relacionada con esta familia de proteínas ya que se observó que presentaba una serie de características que también se dan en les proteínas de esta familia. Presentó capacidad para fijar Tb3+, metal que puede sustituir al Ca2+ y un comportamiento al interaccionar con el colorante Stains-all muy similar al que presenta la calmodulina, una proteína que pertenece a la familia de proteínas fijadoras de calcio tipo EF-hand. Los resultados, permitieron concluir que el segmento de activación de la PCPA de páncreas porcino está estructuralmente relacionado con les proteínas fijadores de calcio de la familia EF-hand. Este aspecto es interesante, teniendo en cuenta la longitud del segmento de activación estudiado (94 aminoácidos), ya que permite hipotetizar un posible origen evolutivo del mismo. No es fácil comprender que un segmento de estas dimensiones pueda tener como única función actuar de inhibidor de un enzima.Many enzymes and physiological active proteins are synthesized as inactive precursors or zymogens. Their activation by limited proteolysis is a mechanism of enzymatic regulation. In the present work, it has been studied the fragment released in the proteolytic activation of a porcine pancreatic zymogen, monomeric procarboxypeptidase A (PCPA). Its structural characterization was carried out studying the segment isolated and linked to the active enzyme forming the zymogen in order to test whether its conformation was the same in both cases. The results showed that, once released from the zymogene, the activation segment of PCPA presented a different conformation with a high conformational flexibility. The isolated activation segment showed a significant thermostability, higher than that presented by the proenzyme. Its thermal unfolding was completely reversible and it was observed that the protein was composed by single domain. NMR studies indicated that this segment is a globular protein, which structure is maintained in wide range of pH values, and confirmed its high degree of conformational flexibility. The activation segment of PCPA showed a significant degree of sequence homology with members of the EF-hand calcium binding protein family, with two potential sites for metal binding. Theoretical studies on the secondary structure prediction confirmed the presence of these two regions on its structure. To test whether this segment belonged to the above mentioned protein family, its ability to bind calcium was experimentally tested. The results showed a weak binding of this metal. Thus, it was not possible to consider this protein as a member of the EF-hand calcium binding protein family. Nevertheless, its structure was indeed related to this family of proteins because it was observed that the segment presented a set of characteristics typical of members of this family. It presented ability to bind Tb3+, a metal that can substitute Ca2+, and when its interaction with the dye Stains-all was tested, a similar behaviour to that presented by calmodulin, a protein that belongs to the calcium binding EF-hand protein family, was observed. In a whole the results allowed to conclude that the activation segment of monomeric porcine PCPA is structurally related to the members of the calcium binding EF-hand protein family. This finding is very interesting taking into account the length of this segment (94 residues. A possible evolutive origin can be envisaged. It is not easy to understand that such a long segment has as a unique function to act as inhibitor of an enzyme
A human ribonuclease induces apoptosis associated with p21WAF1/CIP1 induction and JNK inactivation
Ribonucleases are promising agents for use in anticancer therapy. Among the different ribonucleases described to be cytotoxic, a paradigmatic example is onconase which manifests cytotoxic and cytostatic effects, presents synergism with several kinds of anticancer drugs and is currently in phase II/III of its clinical trial as an anticancer drug against different types of cancer. The mechanism of cytotoxicity of PE5, a variant of human pancreatic ribonuclease carrying a nuclear localization signal, has been investigated and compared to that of onconase. Methods: Cytotoxicity was measured by the MTT method and by the tripan blue exclusion assay. Apoptosis was assessed by flow cytometry, caspase enzymatic detection and confocal microscopy. Cell cycle phase analysis was performed by flow cytometry. The expression of different proteins was analyzed by western blot.n Results: We show that the cytotoxicity of PE5 is produced through apoptosis, that it does not require the proapoptotic activity of p53 and is not prevented by the multiple drug resistance phenotype. We also show that PE5 and onconase induce cell death at the same extent although the latter is also able to arrest the cell growth. We have compared the cytotoxic effects of both ribonucleases in the NCI/ADR-RES cell line by measuring their effects on the cell cycle, on the activation of different caspases and on the expression of different apoptosis- and cell cycle-related proteins. PE5 increases the number of cells in S and G2/M cell cycle phases, which is accompanied by the increased expression of cyclin E and p21WAF1/CIP1 together with the underphosphorylation of p46 forms of JNK. Citotoxicity of onconase in this cell line does not alter the cell cycle phase distribution and it is accompanied by a decreased expression of XIAP. Conclusions: We conclude that PE5 kills the cells through apoptosis associated with the p21WAF1/CIP1 induction and the inactivation of JNK. This mechanism is significantly different from that found for onconas
A nuclear-directed human pancreatic ribonuclease (PE5) targets the metabolic phenotype of cancer cells
Ribonucleases represent a new class of antitumor RNA-damaging drugs.
However, many wild-type members of the vertebrate secreted ribonuclease family are
not cytotoxic because they are not able to evade the cytosolic ribonuclease inhibitor.
We previously engineered the human pancreatic ribonuclease to direct it to the cell
nucleus where the inhibitor is not present. The best characterized variant is PE5 that
kills cancer cells through apoptosis mediated by the p21WAF1/CIP1 induction and the
inactivation of JNK. Here, we have used microarray-derived transcriptional profiling
to identify PE5 regulated genes on the NCI/ADR-RES ovarian cancer cell line. RT-qPCR
analyses have confirmed the expression microarray findings. The results show that
PE5 cause pleiotropic effects. Among them, it is remarkable the down-regulation of
multiple genes that code for enzymes involved in deregulated metabolic pathways
in cancer cellsThis work has been supported by grants BFU2009-06935 and BIO2013-43517 from MINECO (Spain) and SING12/0 from UdG (Spain)
Transcriptional profiling of NCI/ADR-RES cells unveils a complex network of signaling pathways and molecular mechanisms of drug resistance
Ovarian cancer has the highest mortality rate among all the gynecological cancers. This is mostly due to the resistance of ovarian cancer to current chemotherapy regimens. Therefore, it is of crucial importance to identify the molecular mechanisms associated with chemoresistance.
Methods: NCI/ADR-RES is a multidrug-resistant cell line that is a model for the study of drug resistance in ovarian cancer. We carried out a microarray-derived transcriptional profiling analysis of NCI/ADR-RES to identify differentially expressed genes relative to its parental OVCAR-8.
Results: Gene-expression profiling has allowed the identification of genes and pathways that may be important for the development of drug resistance in ovarian cancer. The NCI/ADR-RES cell line has differential expression of genes involved in drug extrusion, inactivation, and efficacy, as well as genes involved in the architectural and functional reorganization of the extracellular matrix. These genes are controlled through different signaling pathways, including MAPK–Akt, Wnt, and Notch.
Conclusion: Our findings highlight the importance of using orthogonal therapies that target completely independent pathways to overcome mechanisms of resistance to both classical chemotherapeutic agents and molecularly targeted drug
Activating transcription factor 3 is crucial for antitumor activity and to strengthen the antiviral properties of onconase
Onconase is a ribonuclease that presents both antitumor and antiviral properties linked to its ribonucleolytic activity and represents a new class of RNA-damaging drugs. It has reached clinical trials for the treatment of several cancers and human papilloma virus warts. Onconase targets different RNAs in the cell cytosol but Onconase-treated cells present features that are different from a simple arrest of protein synthesis. We have used microarray-derived transcriptional profiling to identify Onconase-regulated genes in two ovarian cancer cell lines (NCI/ADR-RES and OVCAR-8). RT-qPCR analyses have confirmed the microarray findings. We have identified a network of up-regulated genes implicated in different signaling pathways that may explain the cytotoxic effects exerted by Onconase. Among these genes, activating transcription factor 3 (ATF3) plays a central role in the key events triggered by Onconase in treated cancer cells that finally lead to apoptosis. This mechanism, mediated by ATF3, is cell-type independent. Up-regulation of ATF3 may also explain the antiviral properties of this ribonuclease because this factor is involved in halting viral genome replication, keeping virus latency or preventing viral oncogenesis. Finally, Onconase-regulated genes are different from those affected by nuclear-directed ribonuclease
A human ribonuclease induces apoptosis associated with p21WAF1/CIP1 induction and JNK inactivation
Background: Ribonucleases are promising agents for use in anticancer therapy. Among the different ribonucleases described to be cytotoxic, a paradigmatic example is onconase which manifests cytotoxic and cytostatic effects, presents synergism with several kinds of anticancer drugs and is currently in phase II/III of its clinical trial as an anticancer drug against different types of cancer. The mechanism of cytotoxicity of PE5, a variant of human pancreatic ribonuclease carrying a nuclear localization signal, has been investigated and compared to that of onconase. Methods: Cytotoxicity was measured by the MTT method and by the tripan blue exclusion assay. Apoptosis was assessed by flow cytometry, caspase enzymatic detection and confocal microscopy. Cell cycle phase analysis was performed by flow cytometry. The expression of different proteins was analyzed by western blot. Results: We show that the cytotoxicity of PE5 is produced through apoptosis, that it does not require the proapoptotic activity of p53 and is not prevented by the multiple drug resistance phenotype. We also show that PE5 and onconase induce cell death at the same extent although the latter is also able to arrest the cell growth. We have compared the cytotoxic effects of both ribonucleases in the NCI/ADR-RES cell line by measuring their effects on the cell cycle, on the activation of different caspases and on the expression of different apoptosis- and cell cycle-related proteins. PE5 increases the number of cells in S and G2/M cell cycle phases, which is accompanied by the increased expression of cyclin E and p21WAF1/CIP1 together with the underphosphorylation of p46 forms of JNK. Citotoxicity of onconase in this cell line does not alter the cell cycle phase distribution and it is accompanied by a decreased expression of XIAP. Conclusions: We conclude that PE5 kills the cells through apoptosis associated with the p21WAF1/CIP1 induction and the inactivation of JNK. This mechanism is significantly different from that found for onconase
Aprenentatge basat en objectius aplicat a un mòdul docent de continguts preclínics del grau de Medicina
L’experiència que es presenta s’ha dut a terme en el mòdul “Morfologia, estructura i funció del cos humà I” de primer curs del Grau de Medicina per tal d’adaptar-se a l’Espai Europeu d’Educació Superior. Particularment es va tenir en compte el fort debat existent en els darrers anys sobre els ensenyaments de pre-grau en àmbits de Ciències de la Salut [1-5] Els objectius principals plantejats en aquest projecte van ser dos: 1) convertir un ensenyament fragmentat de tres matèries afins en un ensenyament integrat i focalitzat per a estudiants de medicina; 2) fer protagonista directe del seu aprenentatge a aquests estudiants procedents d’un ensenyament molt dirigit (ESO i Batxillerat). El mòdul conté coneixements teòrics i pràctics de Biologia Cel·lular, Genètica i Bioquímica, amb la finalitat de donar una visió integrada de l’estructura i funció cel·lular i per tant de l’homeòstasi del cos humà a nivell molecular i cel·lular. La metodologia docent s’ha basat en aprenentatge per objectius. El mòdul s’ha dividit en cinc períodes anomenats Unitats d’Aprenentatge per Objectius (UAOs). S’han dissenyat diferents eines d’ajuda per a aquest autoaprenentatge i a més el seguiment d’aquest procés s’ha realitzat utilitzant diferents tipus de tutories. El contingut del mòdul es completa amb unes sessions pràctiques al laboratori que es fan de forma intensiva amb la finalitat de familiaritzar els estudiants amb les tècniques bàsiques d’un laboratori de recerca biomèdic
Aproximació a la docència de Bioquímica, Biologia Cel·lular i Genètica emprant la metodologia basada en problemes
Publicació que és el resultat d'un grup de docents que, aplicant metodologies d' aprenentatge centrades en l'estudiant, van construir un mòdul per el primer curs de grau de Medicina de la Universitat de Girona. Els estudiants havien d'assolir uns objectius d'aprenentatge que integren coneixements del que tradicionalment han estat les assignatures de Bioquímica, Biologia Molecular, Biologia Cel·lular i Genètica. En aquesta publicació es fan diferents propostes de problemes aplicats a les diferents metodologies docents (Aprenentatge Basat en Problemes, anàlisi de casos i pràctica), de temporalització, d'avaluació i de suport bibliogràfi
Aproximació a la docència de Bioquímica, Biologia Cel·lular i Genètica emprant la metodologia basada en problemes [versió html]
Publicació que és el resultat d'un grup de docents que, aplicant metodologies d' aprenentatge centrades en l'estudiant, van construir un mòdul per el primer curs de grau de Medicina de la Universitat de Girona. Els estudiants havien d'assolir uns objectius d'aprenentatge que integren coneixements del que tradicionalment han estat les assignatures de Bioquímica, Biologia Molecular, Biologia Cel·lular i Genètica. En aquesta publicació es fan diferents propostes de problemes aplicats a les diferents metodologies docents (Aprenentatge Basat en Problemes, anàlisi de casos i pràctica), de temporalització, d'avaluació i de suport bibliogràfi