Exfoliative toxin E, a new Staphylococcus aureus virulence factor with host-specific activity

Exfoliative toxin E, a new [i]Staphylococcus aureus[/i] virulence factor with host-specific activity. Microbes, 15e Congrès National de la SF

Extracellular vesicles in <em>S. aureus</em> pathogenesis in a mastitis context

Mastitis is an inflammation of the mammary gland associated with worldwide economic losses. Staphylococcus aureus is one of the main etiologic agents of mastitis and triggers several clinical manifestations in the host. Although S. aureus is extensively studied as an agent of nosocomial infections, the mechanisms involved in S. aureus pathogenesis in a mastitis context are not completely understood. Extracellular factors are important components of S. aureus virulence. The production of extracellular vesicles (EVs) by S. aureus has gained attention in the last years. EVs are nano-sized particles formed by the budding of the bacterial membrane. Nowadays, EVs are accepted as a conserved mechanism of secretion that enables inter-kingdom cellular communication. EVs have been purified from different clinical isolates of S. aureus and appear to be a key factor in the infectious process when evaluated using several in vitro and in vivo models. In this thesis, we purified EVs from phylogenetically distant strains of S. aureus isolated from bovine, ovine and human hosts. Ruminant strains were responsible for different degrees of severity of mastitis. S. aureus EVs were strain-dependent in terms of yield, proteins cargo and size. Overall, they were enriched with cytoplasmic and membrane-associated proteins, lipoproteins and virulence factors, including toxins (e.g. PSMs, δ-hemolysin), factors associated to adhesion and colonization (e.g. EbpS, FnBPs), and evasion of host immune system (e.g. Sbi, leukocidin). 44 proteins were shared between all strains, defining a core proteome for S. aureus EVs. We selected the bovine strain S. aureus N305 for further in vitro and in vivo investigations. Although S. aureus N305 EVs were not able to induce cytotoxic effects in bovine mammary epithelial cells (bMEC), they stimulated an immunomodulatory response with an increase of some key inflammatory markers, such as the chemokine IL-8. Purified S. aureus N305 EVs were then tested in a murine model of mastitis. Histopathological results were consistent with the levels of cytokine after 24 h of mammary infection. S. aureus N305 EVs induced a dose-dependent neutrophil recruitment to the alveolar space that can be correlated to the local levels of chemokines. EVs-induced symptoms were although distinct and milder than those induced by the live N305. These results suggest that EVs play a role in S. aureus pathogenesis and can induce an immune response to S. aureus mastitis. Overall, this work opens new perspectives in the development of diagnostic tools and vaccine formulations using native or engineered EVs against S. aureus mastitis.La mammite est une inflammation de la glande mammaire responsable de pertes lourdes économiques dans le monde. Staphylococcus aureus est l'un des principaux agents étiologiques de la mammite et déclenche plusieurs manifestations cliniques chez l'hôte. Bien que S. aureus soit largement étudié en tant qu'agent d’infections nosocomiales, les mécanismes impliqués dans la pathogenèse de S. aureus dans un contexte mammite sont encore inconnus. Les facteurs extracellulaires sont des composants importants de la virulence de S. aureus. La production de vésicules extracellulaires (VEs) par S. aureus a attiré l'attention au cours de ces dernières années. Les VEs sont des particules de taille nanométrique formées par le bourgeonnement de la membrane bactérienne. De nos jours, les VEs sont considérées comme un mécanisme de sécrétion conservé qui permet la communication cellulaire inter-royaume. Les VEs ont été purifiées à partir de différents isolats cliniques de S. aureus et semblent être un facteur clé dans le processus infectieux lorsqu'ils sont testés en modèles in vitro et in vivo. Dans cette thèse, nous avons purifié des VEs de souches phylogénétiquement distantes de S. aureus, isolées d'hôtes bovins, ovins et humains. Les souches de ruminants étaient responsables de différents degrés de sévérité de mammite. Les caractéristiques de VEs de S. aureus étaient souches-dépendantes en termes de rendement, de contenu protéique et de taille. Elles sont enrichies en protéines cytoplasmiques et membranaires, en lipoprotéines et en facteurs de virulence, notamment en toxines (ex. PSM, δ-hémolysine), en facteurs d'adhésion et de colonisation (ex. EbpS, FnBPs) et d'évasion du système immunitaire de l'hôte (ex. Sbi, leucocidine). 44 protéines sont communes à toutes les souches et définissent un protéome coeur pour les VEs de S. aureus. Nous avons sélectionné la souche bovine S. aureus N305 pour des études fonctionnelles in vitro et in vivo. Bien que les VEs de S. aureus N305 ne soient pas capables d'induire des effets cytotoxiques sur cellules épithéliales mammaires bovines (CEMb), elles induisent une réponse immunomodulatrice avec une augmentation de certains marqueurs inflammatoires clés, tels que la chimiokine IL-8. Des VEs de N305 purifiées ont ensuite été testées dans un modèle murin de mammite. Les résultats histopathologiques étaient en accord avec les taux de cytokines mesurés après 24 h d'infection mammaire. Les VEs de S. aureus N305 ont induit un recrutement de neutrophiles dose-dépendant dans l'espace alvéolaire qui peut être corrélé aux taux locaux de chimiokines. Les symptômes induits par les VEs étaient bien distincts et plus légers que ceux induits par la souches N305 vivante. Ces résultats suggèrent que les VEs jouent un rôle dans la pathogenèse de S. aureus et peuvent induire une réponse immunitaire lors de mammite à S. aureus. Dans l'ensemble, ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans le développement d'outils diagnostiques et de formulations de vaccins utilisant des VEs naturels ou artificiels contre la mammite à S. aureus

Le rôle des vésicules extracellulaires dans la pathogenèse de S. aureus dans un contexte de mammite

Staphylococcus aureus est l'un des principaux agents étiologiques de la mammite et déclenche plusieurs manifestations cliniques chez l`hôte. Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des particules de taille nanométrique formées par le bourgeonnement de la membrane bactérienne, et elles sont des composantes importantes de la virulence de S. aureus. Dans cette thèse, les VEs ont été purifiées à partir de différents isolats cliniques de S. aureus et semblent être un facteur clé dans le processus infectieux lorsqu'elles sont testées dans des modèles in vitro et in vivo. Les caractéristiques de VEs de S. aureus étaient souches-dépendantes en termes de rendement, de contenu protéique et de taille. Elles sont enrichies en lipoprotéines membranaires et en facteurs de virulence, notamment en toxines, en facteurs d'adhésion et de colonisation et d`évasion du système immunitaire de l'hôte. La souche bovine S. aureus N305 a été utilisée pour des études fonctionnelles in vitro et in vivo. Bien que les VEs de S. aureus N305 ne soient pas capables d'induire des effets cytotoxiques sur les cellules épithéliales mammaires bovines (CEMb), elles induisent une réponse immunomodulatrice avec une augmentation de certains marqueurs inflammatoires clés, tels que la chimiokine IL-8. Dans un modèle murin de mammite, les VEs de S. aureus N305 ont induit un recrutement de neutrophiles dose-dépendant dans l'espace alvéolaire mammaire, ce qui peut être corrélé aux taux locaux de chimiokines. Ces résultats suggèrent que les VEs jouent un rôle dans la pathogenèse de S. aureus et peuvent induire une réponse immunitaire lors de mammite à S. aureus. Dans l'ensemble, ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans le développement d'outils diagnostiques et de formulations de vaccins utilisant des VEs contre la mammite à S. aureus.Staphylococcus aureus is one of the main etiologic agents of mastitis and triggers several clinical manifestations in the host. Extracellular vesicles (EVS) are nano-sized particles formed by the budding of the bacterial membrane, which are important components of S. aureus virulence. EVs have been purified from different clinical isolates of S. aureus and appear to be a key factor in the infectious process when evaluated using several in vitro and in vivo models. ln this work, S. aureus EVs were strain-dependent in terms of yield, proteins cargo, and size. Overall, they were enriched with membrane-associated proteins, lipoproteins, and virulence factors, including toxins, factors associated with adhesion and colonization, and evasion from the host immune system. We selected the bovine strain S. aureus N305 for further in vitro and in vivo investigations. Although S. aureus N305 EVs were not able to induce cytotoxic effects in bovine mammary epithelial cells (bMEC), they stimulated an immunomodulatory response with an increase of some key inflammatory markers, such as the chemokine IL-8. Using a murine model of mastitis, S. aureus N305 EVs induced a dose-dependent neutrophil recruitment to the alveolar space that could be correlated to the local levels of chemokines. EVs-induced symptoms were although distinct and milder than those induced by the live N305. These results suggest that EVs play a role in S. aureus pathogenesis and can induce an immune response during S. aureus mastitis. Overall, this work opens new perspectives in the development of diagnostic tools and vaccine formulations using native or engineered EVs against S. aureus mastitis

Le rôle des vésicules extracellulaires dans la pathogenèse de S. aureus dans un contexte de mammite

Staphylococcus aureus is one of the main etiologic agents of mastitis and triggers several clinical manifestations in the host. Extracellular vesicles (EVS) are nano-sized particles formed by the budding of the bacterial membrane, which are important components of S. aureus virulence. EVs have been purified from different clinical isolates of S. aureus and appear to be a key factor in the infectious process when evaluated using several in vitro and in vivo models. ln this work, S. aureus EVs were strain-dependent in terms of yield, proteins cargo, and size. Overall, they were enriched with membrane-associated proteins, lipoproteins, and virulence factors, including toxins, factors associated with adhesion and colonization, and evasion from the host immune system. We selected the bovine strain S. aureus N305 for further in vitro and in vivo investigations. Although S. aureus N305 EVs were not able to induce cytotoxic effects in bovine mammary epithelial cells (bMEC), they stimulated an immunomodulatory response with an increase of some key inflammatory markers, such as the chemokine IL-8. Using a murine model of mastitis, S. aureus N305 EVs induced a dose-dependent neutrophil recruitment to the alveolar space that could be correlated to the local levels of chemokines. EVs-induced symptoms were although distinct and milder than those induced by the live N305. These results suggest that EVs play a role in S. aureus pathogenesis and can induce an immune response during S. aureus mastitis. Overall, this work opens new perspectives in the development of diagnostic tools and vaccine formulations using native or engineered EVs against S. aureus mastitis.Staphylococcus aureus est l'un des principaux agents étiologiques de la mammite et déclenche plusieurs manifestations cliniques chez l`hôte. Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des particules de taille nanométrique formées par le bourgeonnement de la membrane bactérienne, et elles sont des composantes importantes de la virulence de S. aureus. Dans cette thèse, les VEs ont été purifiées à partir de différents isolats cliniques de S. aureus et semblent être un facteur clé dans le processus infectieux lorsqu'elles sont testées dans des modèles in vitro et in vivo. Les caractéristiques de VEs de S. aureus étaient souches-dépendantes en termes de rendement, de contenu protéique et de taille. Elles sont enrichies en lipoprotéines membranaires et en facteurs de virulence, notamment en toxines, en facteurs d'adhésion et de colonisation et d`évasion du système immunitaire de l'hôte. La souche bovine S. aureus N305 a été utilisée pour des études fonctionnelles in vitro et in vivo. Bien que les VEs de S. aureus N305 ne soient pas capables d'induire des effets cytotoxiques sur les cellules épithéliales mammaires bovines (CEMb), elles induisent une réponse immunomodulatrice avec une augmentation de certains marqueurs inflammatoires clés, tels que la chimiokine IL-8. Dans un modèle murin de mammite, les VEs de S. aureus N305 ont induit un recrutement de neutrophiles dose-dépendant dans l'espace alvéolaire mammaire, ce qui peut être corrélé aux taux locaux de chimiokines. Ces résultats suggèrent que les VEs jouent un rôle dans la pathogenèse de S. aureus et peuvent induire une réponse immunitaire lors de mammite à S. aureus. Dans l'ensemble, ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans le développement d'outils diagnostiques et de formulations de vaccins utilisant des VEs contre la mammite à S. aureus

Caracterização estrutural e funcional de um homólogo à exotoxina esfoliativa D de Staphylococcus aureus envolvido na mastite subclínica de pequenos ruminantes

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-13T03:29:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o___natayme_r._tartaglia.pdf: 2715300 bytes, checksum: 3763779082a208afe16456259401f744 (MD5) Previous issue date: 25A mastite é a mais comum e cara doença que afeta o gado leiteiro, sendo o Staphylococcus aureus o micro-organismo mais frequentemente isolado de casos clínicos dessa infecção. A enfermidade é caracterizada pela inflamação da glândula mamária, com sintomas locais que podem resultar em infecção sistêmica. Uma melhor compreensão dos fatores envolvidos na patogenicidade, assim como da resposta do hospedeiro à infecção por esse micro-organismo, são pontos essenciais para o desenvolvimento eficiente e satisfatório de terapias que permitam prevenir e combater a mastite. Embora considerado um patógeno oportunista, certas linhagens de S. aureus são mais aptas a causar patologias do que outras, devido a grande variedade de fatores de virulência associados a eles. Sendo assim, através de análises sorológicas do proteoma (SERPA), que permitem a identificação de proteínas imunorreativas diferencialmente expressas, o perfil patogênico das linhagens S. aureus O46, característica de mastite subclínica, e S. aureus O11, característica de uma mastite gangrenosa, foi avaliado. Baseado nesses dados, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar uma proteína, codificada pela ORF O46_2740, imunoreativa somente na S. aureus O46 e homóloga a toxina esfoliativa D. Essa toxina é descrita como epidermiolítica e já foi associada a formação de impetigo bolhoso e síndrome da pele escaldada estafilocócica (SSSS). O modelo tridimensional por homologia da ORF O46_2740 foi elaborado in silico, utilizando um molde ETB depositado em bancos de dados. Para a caracterização in vivo, construímos linhagens recombinantes de L. lactis na forma secretada, utilizando o sistema de expressão XIES, induzido por xilose. Os clones foram avaliados por imunodetecção e não foi possível confirmar a expressão nesse sistema. Como alternativa, a ORF foi sintetizada com códons preferenciais para E. coli e avaliado em cinco linhagens de expressão, o qual uma obteve melhor resultado. A ETD-like foi purificada e posteriormente confirmada por Western blotting utilizando anticorpo monoclonal anti-His. A fração solúvel foi dosada e aplicada no dorso de camundongos neonatos Balb/c para avaliação da formação de bolhas e esfoliação característica da toxina. Os resultados preliminares da avaliação in vivo apontam reações bolhosas, porém, novos ensaios são necessários para corroborar a atividade esfoliativa.Mastitis is the most common and costly disease affecting dairy cattle, being S. aureus the most frequently isolated microorganism from clinical cases of this infection. This disease is characterized by inflammation of the mammary gland, with local symptoms that can result in systemic infection. A better understanding of the factors involved in pathogenicity, as well as the host response to infection by this microorganism, are key points for an efficient and satisfactory development of therapies to prevent and combat mastitis. Although considered an opportunistic pathogen, certain strains of S. aureus are more prone to cause pathologies than others, due to the variety of virulence factors associated to them. Through serological proteome analysis (SERPA) that enables the identification of differentially expressed immunoreactive proteins, the pathogenic profiles of S. aureus strains O46 - characteristic of subclinical mastitis - and O11 - characteristic of gangrenous mastitis - were evaluated. Based on these data, the aim of this study was to characterize a protein, encoded by the ORF O46_2740, immunoreactive only in S. aureus O46 and homologous to exfoliative toxin D. This protein is considered epidermolytic toxin and was associated to bullous impetigo and staphylococcal scalded skin syndrome (SSSS). A three-dimensional homology model was designed in silico using an ETB mold deposited in databases. For in vivo characterization we obtained recombinant strains of L. lactis containing the ORF O46_2740 coupled with the XIES expression system, but Western blotting did not confirm the production of ETD-like protein. Alternatively, the ORF was introduced in E. coli under control of T5 promoter, and the expression of ETD-like was successfully confirmed by Western blotting. ETD-like was purified using anti-His monoclonal antibody and applied on the back of newborn Balb/c mice to evaluate its effects on the skin. Preliminary results of in vivo assessment indicated the formation of bullous reactions also caused by the epidermolytic activity of S. aureus ETD; however, no exfoliative activity was observed

Extracellular vesicles in S. aureus pathogenesis in a mastitis context

Mastitis is an inflammation of the mammary gland associated with worldwide economic losses. Staphylococcus aureus is one of the main etiologic agents of mastitis and triggers several clinical manifestations in the host. Although S. aureus is extensively studied as an agent of nosocomial infections, the mechanisms involved in S. aureus pathogenesis in a mastitis context are not completely understood. Extracellular factors are important components of S. aureus virulence. The production of extracellular vesicles (EVs) by S. aureus has gained attention in the last years. EVs are nano-sized particles formed by the budding of the bacterial membrane. Nowadays, EVs are accepted as a conserved mechanism of secretion that enables inter-kingdom cellular communication. EVs have been purified from different clinical isolates of S. aureus and appear to be a key factor in the infectious process when evaluated using several in vitro and in vivo models. In this thesis, we purified EVs from phylogenetically distant strains of S. aureus isolated from bovine, ovine and human hosts. Ruminant strains were responsible for different degrees of severity of mastitis. S. aureus EVs were strain-dependent in terms of yield, proteins cargo and size. Overall, they were enriched with cytoplasmic and membrane-associated proteins, lipoproteins and virulence factors, including toxins (e.g. PSMs, δ-hemolysin), factors associated to adhesion and colonization (e.g. EbpS, FnBPs), and evasion of host immune system (e.g. Sbi, leukocidin). 44 proteins were shared between all strains, defining a core proteome for S. aureus EVs. We selected the bovine strain S. aureus N305 for further in vitro and in vivo investigations. Although S. aureus N305 EVs were not able to induce cytotoxic effects in bovine mammary epithelial cells (bMEC), they stimulated an immunomodulatory response with an increase of some key inflammatory markers, such as the chemokine IL-8. Purified S. aureus N305 EVs were then tested in a murine model of mastitis. Histopathological results were consistent with the levels of cytokine after 24 h of mammary infection. S. aureus N305 EVs induced a dose-dependent neutrophil recruitment to the alveolar space that can be correlated to the local levels of chemokines. EVs-induced symptoms were although distinct and milder than those induced by the live N305. These results suggest that EVs play a role in S. aureus pathogenesis and can induce an immune response to S. aureus mastitis. Overall, this work opens new perspectives in the development of diagnostic tools and vaccine formulations using native or engineered EVs against S. aureus mastitis.La mammite est une inflammation de la glande mammaire responsable de pertes lourdes économiques dans le monde. Staphylococcus aureus est l'un des principaux agents étiologiques de la mammite et déclenche plusieurs manifestations cliniques chez l'hôte. Bien que S. aureus soit largement étudié en tant qu'agent d’infections nosocomiales, les mécanismes impliqués dans la pathogenèse de S. aureus dans un contexte mammite sont encore inconnus. Les facteurs extracellulaires sont des composants importants de la virulence de S. aureus. La production de vésicules extracellulaires (VEs) par S. aureus a attiré l'attention au cours de ces dernières années. Les VEs sont des particules de taille nanométrique formées par le bourgeonnement de la membrane bactérienne. De nos jours, les VEs sont considérées comme un mécanisme de sécrétion conservé qui permet la communication cellulaire inter-royaume. Les VEs ont été purifiées à partir de différents isolats cliniques de S. aureus et semblent être un facteur clé dans le processus infectieux lorsqu'ils sont testés en modèles in vitro et in vivo. Dans cette thèse, nous avons purifié des VEs de souches phylogénétiquement distantes de S. aureus, isolées d'hôtes bovins, ovins et humains. Les souches de ruminants étaient responsables de différents degrés de sévérité de mammite. Les caractéristiques de VEs de S. aureus étaient souches-dépendantes en termes de rendement, de contenu protéique et de taille. Elles sont enrichies en protéines cytoplasmiques et membranaires, en lipoprotéines et en facteurs de virulence, notamment en toxines (ex. PSM, δ-hémolysine), en facteurs d'adhésion et de colonisation (ex. EbpS, FnBPs) et d'évasion du système immunitaire de l'hôte (ex. Sbi, leucocidine). 44 protéines sont communes à toutes les souches et définissent un protéome coeur pour les VEs de S. aureus. Nous avons sélectionné la souche bovine S. aureus N305 pour des études fonctionnelles in vitro et in vivo. Bien que les VEs de S. aureus N305 ne soient pas capables d'induire des effets cytotoxiques sur cellules épithéliales mammaires bovines (CEMb), elles induisent une réponse immunomodulatrice avec une augmentation de certains marqueurs inflammatoires clés, tels que la chimiokine IL-8. Des VEs de N305 purifiées ont ensuite été testées dans un modèle murin de mammite. Les résultats histopathologiques étaient en accord avec les taux de cytokines mesurés après 24 h d'infection mammaire. Les VEs de S. aureus N305 ont induit un recrutement de neutrophiles dose-dépendant dans l'espace alvéolaire qui peut être corrélé aux taux locaux de chimiokines. Les symptômes induits par les VEs étaient bien distincts et plus légers que ceux induits par la souches N305 vivante. Ces résultats suggèrent que les VEs jouent un rôle dans la pathogenèse de S. aureus et peuvent induire une réponse immunitaire lors de mammite à S. aureus. Dans l'ensemble, ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans le développement d'outils diagnostiques et de formulations de vaccins utilisant des VEs naturels ou artificiels contre la mammite à S. aureus

MRIC TEM Combinaison de techniques à l'échelle cellulaire et moléculaire

Dans le domaine de la biologie, la microscopie électronique à transmission est une des méthodes de choix permettant des analyses à l’échelle ultrastructurale. Au travers d’un exemple exploitant à la fois les informations acquises en microscopie électronique conventionnelle et en cryo-tomographie, nous montrerons les potentialités de ces techniques

Qualitative Changes in the Proteome of Milk-derived Extracellular Vesicles in response to intra-mammary infection by Staphylococcus aureus

Qualitative Changes in the Proteome of Milk-derived Extracellular Vesicles in response to intra-mammary infection by Staphylococcus aureus . 6. annual meeting of the International Society for Extracellular Vesicle

Biosensing Extracellular Vesicle Subpopulations in Neurodegenerative Disease Conditions

International audienc

Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles induce an inflammatory response in murine model of mastitis

Staphylococcus aureus is one of the main causative agents of mastitis, an inflammation of the mammary gland that affects bovines and small ruminants. The severity of staphylococcal infections is highly variable mainly due to the virulence factors secreted by different strains. Gram-positive bacteria, including S. aureus, produce and release extracellular vesicles (EVs) that play fundamental roles in cell-to-cell communication. In this study we report the isolation and the functional characterization of EVs produced by S. aureus Newbould 305, a bovine strain able to induce chronic mastitis in cows. Vesicles were recovered from the culture supernatants by density gradient ultracentrifugation, visualized by transmission electron microscopy and characterized by Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The mean diameter of purified EVs were 177 nm ± 46 nm with concentration of 3.86 x 1013 vesicles per mL of culture. 222 different proteins involved in a number of bacterial cellular processes were identified in EVs by LC-MS/MS. EVs also contained numerous virulence-associated proteins such as -hemolysin, immunoglobulin G-binding protein and phenol soluble modulins suggesting a physiological role for EVs in pathogenicity. The effect of intra-mammary injections of purified EVs on CD-1 lactating female mice was then evaluated. 24 h post infection, macroscopic signs of inflammation as well as a dose dependent neutrophil recruitment were observed from histological sections of mammary glands of mice treated with EVs. In addition, EVs induced the local level of key pro-inflammatory mediators such as IL-8. The overall response to EVs was comparable to that obtained with heat-inactivated N305 and was milder than the response to live N305. Our findings provide evidence of the importance of the release of EVs as a mechanism of secretion of bacterial effectors in the pathogenesis of mastitis and correspond to the first work characterizing EVs of a strain of veterinary interest