Extracellular vesicles in S. aureus pathogenesis in a mastitis context

Abstract

Mastitis is an inflammation of the mammary gland associated with worldwide economic losses. Staphylococcus aureus is one of the main etiologic agents of mastitis and triggers several clinical manifestations in the host. Although S. aureus is extensively studied as an agent of nosocomial infections, the mechanisms involved in S. aureus pathogenesis in a mastitis context are not completely understood. Extracellular factors are important components of S. aureus virulence. The production of extracellular vesicles (EVs) by S. aureus has gained attention in the last years. EVs are nano-sized particles formed by the budding of the bacterial membrane. Nowadays, EVs are accepted as a conserved mechanism of secretion that enables inter-kingdom cellular communication. EVs have been purified from different clinical isolates of S. aureus and appear to be a key factor in the infectious process when evaluated using several in vitro and in vivo models. In this thesis, we purified EVs from phylogenetically distant strains of S. aureus isolated from bovine, ovine and human hosts. Ruminant strains were responsible for different degrees of severity of mastitis. S. aureus EVs were strain-dependent in terms of yield, proteins cargo and size. Overall, they were enriched with cytoplasmic and membrane-associated proteins, lipoproteins and virulence factors, including toxins (e.g. PSMs, δ-hemolysin), factors associated to adhesion and colonization (e.g. EbpS, FnBPs), and evasion of host immune system (e.g. Sbi, leukocidin). 44 proteins were shared between all strains, defining a core proteome for S. aureus EVs. We selected the bovine strain S. aureus N305 for further in vitro and in vivo investigations. Although S. aureus N305 EVs were not able to induce cytotoxic effects in bovine mammary epithelial cells (bMEC), they stimulated an immunomodulatory response with an increase of some key inflammatory markers, such as the chemokine IL-8. Purified S. aureus N305 EVs were then tested in a murine model of mastitis. Histopathological results were consistent with the levels of cytokine after 24 h of mammary infection. S. aureus N305 EVs induced a dose-dependent neutrophil recruitment to the alveolar space that can be correlated to the local levels of chemokines. EVs-induced symptoms were although distinct and milder than those induced by the live N305. These results suggest that EVs play a role in S. aureus pathogenesis and can induce an immune response to S. aureus mastitis. Overall, this work opens new perspectives in the development of diagnostic tools and vaccine formulations using native or engineered EVs against S. aureus mastitis.La mammite est une inflammation de la glande mammaire responsable de pertes lourdes économiques dans le monde. Staphylococcus aureus est l'un des principaux agents étiologiques de la mammite et déclenche plusieurs manifestations cliniques chez l'hôte. Bien que S. aureus soit largement étudié en tant qu'agent d’infections nosocomiales, les mécanismes impliqués dans la pathogenèse de S. aureus dans un contexte mammite sont encore inconnus. Les facteurs extracellulaires sont des composants importants de la virulence de S. aureus. La production de vésicules extracellulaires (VEs) par S. aureus a attiré l'attention au cours de ces dernières années. Les VEs sont des particules de taille nanométrique formées par le bourgeonnement de la membrane bactérienne. De nos jours, les VEs sont considérées comme un mécanisme de sécrétion conservé qui permet la communication cellulaire inter-royaume. Les VEs ont été purifiées à partir de différents isolats cliniques de S. aureus et semblent être un facteur clé dans le processus infectieux lorsqu'ils sont testés en modèles in vitro et in vivo. Dans cette thèse, nous avons purifié des VEs de souches phylogénétiquement distantes de S. aureus, isolées d'hôtes bovins, ovins et humains. Les souches de ruminants étaient responsables de différents degrés de sévérité de mammite. Les caractéristiques de VEs de S. aureus étaient souches-dépendantes en termes de rendement, de contenu protéique et de taille. Elles sont enrichies en protéines cytoplasmiques et membranaires, en lipoprotéines et en facteurs de virulence, notamment en toxines (ex. PSM, δ-hémolysine), en facteurs d'adhésion et de colonisation (ex. EbpS, FnBPs) et d'évasion du système immunitaire de l'hôte (ex. Sbi, leucocidine). 44 protéines sont communes à toutes les souches et définissent un protéome coeur pour les VEs de S. aureus. Nous avons sélectionné la souche bovine S. aureus N305 pour des études fonctionnelles in vitro et in vivo. Bien que les VEs de S. aureus N305 ne soient pas capables d'induire des effets cytotoxiques sur cellules épithéliales mammaires bovines (CEMb), elles induisent une réponse immunomodulatrice avec une augmentation de certains marqueurs inflammatoires clés, tels que la chimiokine IL-8. Des VEs de N305 purifiées ont ensuite été testées dans un modèle murin de mammite. Les résultats histopathologiques étaient en accord avec les taux de cytokines mesurés après 24 h d'infection mammaire. Les VEs de S. aureus N305 ont induit un recrutement de neutrophiles dose-dépendant dans l'espace alvéolaire qui peut être corrélé aux taux locaux de chimiokines. Les symptômes induits par les VEs étaient bien distincts et plus légers que ceux induits par la souches N305 vivante. Ces résultats suggèrent que les VEs jouent un rôle dans la pathogenèse de S. aureus et peuvent induire une réponse immunitaire lors de mammite à S. aureus. Dans l'ensemble, ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans le développement d'outils diagnostiques et de formulations de vaccins utilisant des VEs naturels ou artificiels contre la mammite à S. aureus