A gene truncation strategy generating N- and C-terminal deletion variants of proteins for functional studies: mapping of the Sec1p binding domain in yeast Mso1p by a Mu in vitro transposition-based approach

Bacteriophage Mu in vitro transposition constitutes a versatile tool in molecular biology, with applications ranging from engineering of single genes or proteins to modification of genome segments or entire genomes. A new strategy was devised on the basis of Mu transposition that via a few manipulation steps simultaneously generates a nested set of gene constructions encoding deletion variants of proteins. C-terminal deletions are produced using a mini-Mu transposon that carries translation stop signals close to each transposon end. Similarly, N-terminal deletions are generated using a transposon with appropriate restriction sites, which allows deletion of the 5′-distal part of the gene. As a proof of principle, we produced a set of plasmid constructions encoding both C- and N-terminally truncated variants of yeast Mso1p and mapped its Sec1p-interacting region. The most important amino acids for the interaction in Mso1p are located between residues T46 and N78, with some weaker interactions possibly within the region E79–N105. This general-purpose gene truncation strategy is highly efficient and produces, in a single reaction series, a comprehensive repertoire of gene constructions encoding protein deletion variants, valuable in many types of functional studies. Importantly, the methodology is applicable to any protein-encoding gene cloned in an appropriate vector

High-precision mapping of protein–protein interfaces: an integrated genetic strategy combining en masse mutagenesis and DNA-level parallel analysis on a yeast two-hybrid platform

Understanding networks of protein–protein interactions constitutes an essential component on a path towards comprehensive description of cell function. Whereas efficient techniques are readily available for the initial identification of interacting protein partners, practical strategies are lacking for the subsequent high-resolution mapping of regions involved in protein–protein interfaces. We present here a genetic strategy to accurately map interacting protein regions at amino acid precision. The system is based on parallel construction, sampling and analysis of a comprehensive insertion mutant library. The methodology integrates Mu in vitro transposition-based random pentapeptide mutagenesis of proteins, yeast two-hybrid screening and high-resolution genetic footprinting. The strategy is general and applicable to any interacting protein pair. We demonstrate the feasibility of the methodology by mapping the region in human JFC1 that interacts with Rab8A, and we show that the association is mediated by the Slp homology domain 1

Mu in vitro transposition applications in protein engineering

Transposons, mobile genetic elements that are ubiquitous in all living organisms have been used as tools in molecular biology for decades. They have the ability to move into discrete DNA locations with no apparent homology to the target site. The utility of transposons as molecular tools is based on their ability to integrate into various DNA sequences efficiently, producing extensive mutant clone libraries that can be used in various molecular biology applications. Bacteriophage Mu is one of the most useful transposons due to its well-characterized and simple in vitro transposition reaction. This study establishes the properties of the Mu in vitro transposition system as a versatile multipurpose tool in molecular biology. In addition, this study describes Mu-based applications for engineering proteins by random insertional transposon mutagenesis in order to study structure-function relationships in proteins. We initially characterized the properties of the minimal Mu in vitro transposition system. We showed that the Mu transposition system works efficiently and accurately and produces insertions into a wide spectrum of target sites in different DNA molecules. Then, we developed a pentapeptide insertion mutagenesis strategy for inserting random five amino acid cassettes into proteins. These protein variants can be used especially for screening important sites for protein-protein interactions. Also, the system may produce temperature-sensitive variants of the protein of interest. Furthermore, we developed an efficient screening system for high-resolution mapping of protein-protein interfaces with the pentapeptide insertion mutagenesis. This was accomplished by combining the mutagenesis with subsequent yeast two-hybrid screening and PCR-based genetic footprinting. This combination allows the analysis of the whole mutant library en masse, without the need for producing or isolating separate mutant clones, and the protein-protein interfaces can be determined at amino acid accuracy. The system was validated by analysing the interacting region of JFC1 with Rab8A, and we show that the interaction is mediated via the JFC1 Slp homology domain. In addition, we developed a procedure for the production of nested sets of N- and C-terminal deletion variants of proteins with the Mu system. These variants are useful in many functional studies of proteins, especially in mapping regions involved in protein-protein interactions. This methodology was validated by analysing the region in yeast Mso1 involved in an interaction with Sec1. The results of this study show that the Mu in vitro transposition system is versatile for various applicational purposes and can efficiently be adapted to random protein engineering applications for functional studies of proteins.Tässä väitöskirjatyössä olemme kehittäneet tutkijoiden käyttöön uusia menetelmiä proteiinien toiminnallisten alueiden selvittämiseen. Näissä menetelmissä olemme hyödyntäneet transposoneja, eli “hyppiviä geenejä” luonnollisten proteiinien muokkaamiseen. Proteiinit eli valkuaisaineet hoitavat keskeisimpiä tehtäviä elimistön soluissa. Esimerkiksi ihmiselimistössä on arvioitu esiintyvän jopa miljoona erilaista proteiinia. Yhä uusia proteiineja tunnistetaan jatkuvasti, sekä ihmisestä että muista eliölajeista. Edes monien jo tunnistettujen proteiinien toimintaa ja varsinkaan rakennetta ei tunneta tarkasti. Työssä kehitettyjä menetelmiä voidaan käyttää tutkimuksen apuvälineinä erilaisten proteiinien luonnehdinnassa. Transposonit ovat tarkoin rajattuja DNA-jaksoja, joilla on erityinen kyky siirtyä paikasta toiseen kromosomin sisällä tai jopa toiseen kromosomiin. Transposoneja on tavattu lähes kaikista tutkituista eliölajeista. Myös ihmisen perimässä on runsaasti transposoneja tai niiden toimintakyvyttömiä jäänteitä. Tässä työssä on käytetty hyväksi bakteriofagi Mu:n transpositiota. Mu käyttää transpositiomekanismia liittäessään oman perimäaineksensa isäntäbakteerinsa perimään infektion yhteydessä. Tässä väitöstutkimuksessa olemme tutkineet yksinkertaistetun, koeputkiolosuhteissa tapahtuvan Mu:n transpositioreaktion soveltuvuutta geeniteknologian työkaluksi ja erityisesti kehittäneet sovellutuksia proteiininmuokkaukseen. Transpositiota käyttäen voidaan tehokkaasti ja satunnaisesti viedä ylimääräisiä jaksoja (insertioita) plasmidivektoriin kloonattuun tutkittavan proteiinin geeniin. Olemme kehittäneet menetelmän jolla voidaan luoda kattavia proteiinikirjastoja, joissa jokaisessa proteiinimolekyylissä on yksi viiden aminohapon mittainen insertio eri kohdassa. Näiden insertioitten vaikutusta proteiinin toimintaan, ja erityisesti sen kykyyn sitoutua toisiin proteiineihin voidaan tutkia. Lisäksi kehitimme tehokkaan systeemin, jolla kokonainen proteiinikirjasto voidaan analysoida samalla kertaa ja näin voidaan tarkasti määrittää tutkittavasta proteiinista alue, joka osallistuu toisen, tietyn proteiinin sitomiseen. Lisäksi olemme kehittäneet menetelmän jolla voidaan tuottaa tutkittavasta proteiinista sarja eri pituisia lyhennettyjä muunnoksia. Näissä muunnelluissa proteiineissa niiden jommasta kummasta päästä puuttuu vaihtelevan pituinen jakso, ja myös nämä lyhennetyt proteiinit ovat käyttökelpoisia määritettäessä toisen proteiinin sitoutumiseen osallistuvaa aluetta. Työssä kehitettyjä uusia menetelmiä käyttäen olemme saaneet tärkeää uutta tietoa kahden proteiinin, hiivan Mso1:n ja ihmisen JFC1:n toiminnallisesta rakenteesta