Study on the internalization mechanism of the ZEBRA cell-penetrating peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) represent a noninvasive method for delivering functional biomolecules into living cells. We have recently shown that the Epstein-Barr virus transcriptional factor ZEBRA contains a protein transduction domain, named Z9 or minimal domain (MD). Only few of currently identified CPPs including MD are able to rapidly cross the mammalian cell membrane without being entrapped into endosomal compartments, even when fused to cargo macromolecules. In this work, a series of MD deletion mutants has been engineered and their cellular uptake has been analyzed by confocal microscopy and FACS. We identified a domain MD11 (8 amino acids shorter than MD) able to enter mammalian cells via a mainly endocytosis-independent mechanism. All the other generated truncated forms exhibited reduced cellular uptake and penetrated into cells through endocytic mechanisms. These results have highlighted the role of the MD11 C-terminal region as essential for efficient cellular entry and endosomal escape  and open new perspectives for the use of this CPP as carrier for delivering biologically active macromolecules with therapeutic potential

Vectorisation de molécules biologiques par la protéine ZEBRA du Virus Epstein-Barr : applications en thérapie humaine

In recent years, the understanding of disease molecular mechanisms has led to the identification of genes and proteins that are altered in disease state and many therapeutic targets have been found located within cells. The protective and hydrophobic nature of plasma membrane prevents therapeutic drugs from entering cells. Cell-penetrating peptides (CPPs) or protein transduction domains (PTDs) have emerged as a group of non-invasive delivery vectors for various hydrophilic macromolecules, and several in vitro and in vivo applications as pharmaceutical carriers have been reported. A novel cell-penetrating peptide deriving from the Epstein-Barr virus ZEBRA transcription factor has been recently characterized in our laboratory. A reductionist study of full-length ZEBRA protein has allowed to identify the amino acid region (named as Minimal Domain, MD) implicated in cellular uptake. This peptide is able to cross the mammalian cell membranes via a direct translocation mechanism even when fused to cargo molecules such as eGFP reporter protein. The direct penetration mechanism represents a great advantage for therapeutic applications as the cargo molecules can be directly delivered into cells cytoplasm in a biological active form. The aim of this thesis is to explore the cell-penetrating properties of the MD peptide and evaluate its applications as therapeutic protein delivery system. This work is structured in three parts.The first part describes the study on the optimization of MD peptide sequence by size-reduction and the evaluation of its amino acid composition role in the translocation process across the cell membrane. This study has led to the identification of a shorter MD sequence (MD11) with unvaried mechanism of translocation. The second section describes a MD11-based therapeutic approach aiming at repair a dysfunction of the protein synthesis identified in most cancers. The regulation of the protein synthesis has a crucial role in governing the eukaryotic cell growth and subtle defects in the translational machinery can alter the cellular physiology and lead to cell malignancy. Among the different factors intervening in the regulation of this process, the eukaryotic initiation factor 3 (eIF3) contributes to oncogenesis and maintenance of the cancer state. This complex is composed of 13 subunits (designated eIF3 a-m). The expression of eIF3 subunits is altered in several cancers, and in particular the f subunit (eIF3f) is significantly down-regulated in pancreas, vulva, breast, melanoma, ovary and small intestine tumors. The eIF3f ectopic expression by transient gene transfection inhibits cellular protein synthesis and induces apoptosis in melanoma and pancreatic cancer cells. Starting from these observations, we developed an innovative therapeutic approach for cancer treatment in which the missing eIF3f protein is produced in vitro in fusion to MD11, and delivered to cells. These results have demonstrated that the MD11- based eIF3f transfer system may represent a powerful strategy to suppress the tumor-cell proliferation. The last part of this thesis explores the cell-penetrating property of MD11 in yeast cells, and in particular in the pathogenic fungus Candida albicans. The presented results demonstrate the versatility of MD11, functioning as vectors in both yeast and mammalian cells and as carrier for proteins with biological activity.The MD11 potential as protein delivery system is evident; however some improvements regarding the fusion protein formulation and in vivo studies should be realized to validate the effectiveness of its therapeutic application.La compréhension des mécanismes moléculaires de différentes pathologies a permis la caractérisation de gènes et de protéines impliqués dans la pathogénèse et l'identification de cibles thérapeutiques intracellulaires. La nature hydrophobique de la membrane cellulaire empêche le passage des médicaments dans les cellules. Les Cell-Penetrating Peptides (CPP) ou domaines de transduction protéiques (PTD) sont des peptides qui permettent l'internalisation de macromolécules hydrophiles in cellulo et in vivo. Un nouveau peptide issu du facteur de transcription ZEBRA du virus Epstein-Barr, et qui possède des propriétés de transduction a été caractérisé récemment dans notre laboratoire. Des études par mutagénèse de délétion de la protéine ZEBRA ont permis d'identifier la région d'acides aminés (nommé ainsi MD) impliquée dans la pénétration cellulaire. Ce peptide traverse les membranes des cellules de mammifères par un mécanisme de translocation directe, même lorsqu'il est fusionné à des molécules telles que la protéine reportrice eGFP. Le mécanisme de pénétration directe représente un grand avantage pour les applications thérapeutiques: les molécules cargos peuvent être internalisées directement dans le cytoplasme cellulaire sans dégradation et sous une forme biologiquement active. L'objectif de cette thèse est d'étudier les propriétés de pénétration cellulaire du peptide MD et d'évaluer ses applications thérapeutiques comme système de vectorisation des protéines. Ce travail est structuré en trois parties. La première partie porte sur l'étude de l'optimisation de la séquence peptidique MD par réduction de taille et l'évaluation du rôle de sa composition en acides aminés dans le processus de translocation à travers la membrane cellulaire. Cette étude a conduit à l'identification d'une séquence plus courte MD (MD11) possédant une efficacité et un mécanisme de translocation inchangés. La deuxième partie décrit une approche thérapeutique basée sur MD11 visant à la complémentation protéique d'un dysfonctionnement identifiée dans la plupart des cancers. Les cellules tumorales présentent des altérations dans la machinerie de traduction résultant dans une prolifération cellulaire incontrôlée. Parmi les différents facteurs intervenant dans la régulation de ce processus, le facteur eucaryote d'initiation 3 (eIF3) contribue à l'oncogenèse et au maintien de l'état cancéreux. Ce complexe est composé de 13 sous-unités, désignées eIF3 a-m. L'expression de certaines sous-unités est altérée dans plusieurs cancers, et en particulier la sous-unité f (eIF3f) est significativement diminuée dans le mélanome, les cancers du pancréas, de la vulve, du sein, de l'intestin et de l'ovaire. L'expression ectopique par transfection transitoire du gène eIF3f inhibe la synthèse protéique et induit l'apoptose dans le mélanome et dans les cellules cancéreuses pancréatiques. A partir de ces observations, nous avons développé une approche thérapeutique innovante pour le traitement des cancers dans lesquels la protéine manquante eIF3f est produite sous forme recombinante fusionnée à la séquence de MD11, et ensuite internalisée dans les cellules cibles tumorales. Ces résultats démontrent que le système de transfert de eIF3f basé sur MD11 représente une stratégie efficace pour supprimer la prolifération des cellules tumorales. La dernière partie de cette thèse explore la propriété de pénétration de MD11 dans les cellules de levure, et en particulier dans le champignon pathogène Candida albicans. Les résultats obtenus démontrent la polyvalence de MD11, qui fonctionne comme vecteur de protéines à activité biologique aussi bien dans la levure que dans les cellules de mammifères. Le potentiel de MD11 comme système de transport et de relargage des protéines a donc été établis, toutefois certaines améliorations en ce qui concerne la formulation des protéines de fusion et des études in vivo doivent être réalisées afin de valider son efficacité thérapeutique

Vectorisation de molécules biologiques par la protéine ZEBRA du Virus Epstein-Barr : applications en thérapie humaine

In recent years, the understanding of disease molecular mechanisms has led to the identification of genes and proteins that are altered in disease state and many therapeutic targets have been found located within cells. The protective and hydrophobic nature of plasma membrane prevents therapeutic drugs from entering cells. Cell-penetrating peptides (CPPs) or protein transduction domains (PTDs) have emerged as a group of non-invasive delivery vectors for various hydrophilic macromolecules, and several in vitro and in vivo applications as pharmaceutical carriers have been reported. A novel cell-penetrating peptide deriving from the Epstein-Barr virus ZEBRA transcription factor has been recently characterized in our laboratory. A reductionist study of full-length ZEBRA protein has allowed to identify the amino acid region (named as Minimal Domain, MD) implicated in cellular uptake. This peptide is able to cross the mammalian cell membranes via a direct translocation mechanism even when fused to cargo molecules such as eGFP reporter protein. The direct penetration mechanism represents a great advantage for therapeutic applications as the cargo molecules can be directly delivered into cells cytoplasm in a biological active form. The aim of this thesis is to explore the cell-penetrating properties of the MD peptide and evaluate its applications as therapeutic protein delivery system. This work is structured in three parts.The first part describes the study on the optimization of MD peptide sequence by size-reduction and the evaluation of its amino acid composition role in the translocation process across the cell membrane. This study has led to the identification of a shorter MD sequence (MD11) with unvaried mechanism of translocation. The second section describes a MD11-based therapeutic approach aiming at repair a dysfunction of the protein synthesis identified in most cancers. The regulation of the protein synthesis has a crucial role in governing the eukaryotic cell growth and subtle defects in the translational machinery can alter the cellular physiology and lead to cell malignancy. Among the different factors intervening in the regulation of this process, the eukaryotic initiation factor 3 (eIF3) contributes to oncogenesis and maintenance of the cancer state. This complex is composed of 13 subunits (designated eIF3 a-m). The expression of eIF3 subunits is altered in several cancers, and in particular the f subunit (eIF3f) is significantly down-regulated in pancreas, vulva, breast, melanoma, ovary and small intestine tumors. The eIF3f ectopic expression by transient gene transfection inhibits cellular protein synthesis and induces apoptosis in melanoma and pancreatic cancer cells. Starting from these observations, we developed an innovative therapeutic approach for cancer treatment in which the missing eIF3f protein is produced in vitro in fusion to MD11, and delivered to cells. These results have demonstrated that the MD11- based eIF3f transfer system may represent a powerful strategy to suppress the tumor-cell proliferation. The last part of this thesis explores the cell-penetrating property of MD11 in yeast cells, and in particular in the pathogenic fungus Candida albicans. The presented results demonstrate the versatility of MD11, functioning as vectors in both yeast and mammalian cells and as carrier for proteins with biological activity.The MD11 potential as protein delivery system is evident; however some improvements regarding the fusion protein formulation and in vivo studies should be realized to validate the effectiveness of its therapeutic application.La compréhension des mécanismes moléculaires de différentes pathologies a permis la caractérisation de gènes et de protéines impliqués dans la pathogénèse et l'identification de cibles thérapeutiques intracellulaires. La nature hydrophobique de la membrane cellulaire empêche le passage des médicaments dans les cellules. Les Cell-Penetrating Peptides (CPP) ou domaines de transduction protéiques (PTD) sont des peptides qui permettent l'internalisation de macromolécules hydrophiles in cellulo et in vivo. Un nouveau peptide issu du facteur de transcription ZEBRA du virus Epstein-Barr, et qui possède des propriétés de transduction a été caractérisé récemment dans notre laboratoire. Des études par mutagénèse de délétion de la protéine ZEBRA ont permis d'identifier la région d'acides aminés (nommé ainsi MD) impliquée dans la pénétration cellulaire. Ce peptide traverse les membranes des cellules de mammifères par un mécanisme de translocation directe, même lorsqu'il est fusionné à des molécules telles que la protéine reportrice eGFP. Le mécanisme de pénétration directe représente un grand avantage pour les applications thérapeutiques: les molécules cargos peuvent être internalisées directement dans le cytoplasme cellulaire sans dégradation et sous une forme biologiquement active. L'objectif de cette thèse est d'étudier les propriétés de pénétration cellulaire du peptide MD et d'évaluer ses applications thérapeutiques comme système de vectorisation des protéines. Ce travail est structuré en trois parties. La première partie porte sur l'étude de l'optimisation de la séquence peptidique MD par réduction de taille et l'évaluation du rôle de sa composition en acides aminés dans le processus de translocation à travers la membrane cellulaire. Cette étude a conduit à l'identification d'une séquence plus courte MD (MD11) possédant une efficacité et un mécanisme de translocation inchangés. La deuxième partie décrit une approche thérapeutique basée sur MD11 visant à la complémentation protéique d'un dysfonctionnement identifiée dans la plupart des cancers. Les cellules tumorales présentent des altérations dans la machinerie de traduction résultant dans une prolifération cellulaire incontrôlée. Parmi les différents facteurs intervenant dans la régulation de ce processus, le facteur eucaryote d'initiation 3 (eIF3) contribue à l'oncogenèse et au maintien de l'état cancéreux. Ce complexe est composé de 13 sous-unités, désignées eIF3 a-m. L'expression de certaines sous-unités est altérée dans plusieurs cancers, et en particulier la sous-unité f (eIF3f) est significativement diminuée dans le mélanome, les cancers du pancréas, de la vulve, du sein, de l'intestin et de l'ovaire. L'expression ectopique par transfection transitoire du gène eIF3f inhibe la synthèse protéique et induit l'apoptose dans le mélanome et dans les cellules cancéreuses pancréatiques. A partir de ces observations, nous avons développé une approche thérapeutique innovante pour le traitement des cancers dans lesquels la protéine manquante eIF3f est produite sous forme recombinante fusionnée à la séquence de MD11, et ensuite internalisée dans les cellules cibles tumorales. Ces résultats démontrent que le système de transfert de eIF3f basé sur MD11 représente une stratégie efficace pour supprimer la prolifération des cellules tumorales. La dernière partie de cette thèse explore la propriété de pénétration de MD11 dans les cellules de levure, et en particulier dans le champignon pathogène Candida albicans. Les résultats obtenus démontrent la polyvalence de MD11, qui fonctionne comme vecteur de protéines à activité biologique aussi bien dans la levure que dans les cellules de mammifères. Le potentiel de MD11 comme système de transport et de relargage des protéines a donc été établis, toutefois certaines améliorations en ce qui concerne la formulation des protéines de fusion et des études in vivo doivent être réalisées afin de valider son efficacité thérapeutique

Optimization of ZEBRA protein as an innovative delivery system for therapeutic molecules

La compréhension des mécanismes moléculaires de différentes pathologies a permis la caractérisation de gènes et de protéines impliqués dans la pathogénèse et l'identification de cibles thérapeutiques intracellulaires. La nature hydrophobique de la membrane cellulaire empêche le passage des médicaments dans les cellules. Les Cell-Penetrating Peptides (CPP) ou domaines de transduction protéiques (PTD) sont des peptides qui permettent l'internalisation de macromolécules hydrophiles in cellulo et in vivo. Un nouveau peptide issu du facteur de transcription ZEBRA du virus Epstein-Barr, et qui possède des propriétés de transduction a été caractérisé récemment dans notre laboratoire. Des études par mutagénèse de délétion de la protéine ZEBRA ont permis d'identifier la région d'acides aminés (nommé ainsi MD) impliquée dans la pénétration cellulaire. Ce peptide traverse les membranes des cellules de mammifères par un mécanisme de translocation directe, même lorsqu'il est fusionné à des molécules telles que la protéine reportrice eGFP. Le mécanisme de pénétration directe représente un grand avantage pour les applications thérapeutiques: les molécules cargos peuvent être internalisées directement dans le cytoplasme cellulaire sans dégradation et sous une forme biologiquement active. L'objectif de cette thèse est d'étudier les propriétés de pénétration cellulaire du peptide MD et d'évaluer ses applications thérapeutiques comme système de vectorisation des protéines. Ce travail est structuré en trois parties. La première partie porte sur l'étude de l'optimisation de la séquence peptidique MD par réduction de taille et l'évaluation du rôle de sa composition en acides aminés dans le processus de translocation à travers la membrane cellulaire. Cette étude a conduit à l'identification d'une séquence plus courte MD (MD11) possédant une efficacité et un mécanisme de translocation inchangés. La deuxième partie décrit une approche thérapeutique basée sur MD11 visant à la complémentation protéique d'un dysfonctionnement identifiée dans la plupart des cancers. Les cellules tumorales présentent des altérations dans la machinerie de traduction résultant dans une prolifération cellulaire incontrôlée. Parmi les différents facteurs intervenant dans la régulation de ce processus, le facteur eucaryote d'initiation 3 (eIF3) contribue à l'oncogenèse et au maintien de l'état cancéreux. Ce complexe est composé de 13 sous-unités, désignées eIF3 a-m. L'expression de certaines sous-unités est altérée dans plusieurs cancers, et en particulier la sous-unité f (eIF3f) est significativement diminuée dans le mélanome, les cancers du pancréas, de la vulve, du sein, de l'intestin et de l'ovaire. L'expression ectopique par transfection transitoire du gène eIF3f inhibe la synthèse protéique et induit l'apoptose dans le mélanome et dans les cellules cancéreuses pancréatiques. A partir de ces observations, nous avons développé une approche thérapeutique innovante pour le traitement des cancers dans lesquels la protéine manquante eIF3f est produite sous forme recombinante fusionnée à la séquence de MD11, et ensuite internalisée dans les cellules cibles tumorales. Ces résultats démontrent que le système de transfert de eIF3f basé sur MD11 représente une stratégie efficace pour supprimer la prolifération des cellules tumorales. La dernière partie de cette thèse explore la propriété de pénétration de MD11 dans les cellules de levure, et en particulier dans le champignon pathogène Candida albicans. Les résultats obtenus démontrent la polyvalence de MD11, qui fonctionne comme vecteur de protéines à activité biologique aussi bien dans la levure que dans les cellules de mammifères. Le potentiel de MD11 comme système de transport et de relargage des protéines a donc été établis, toutefois certaines améliorations en ce qui concerne la formulation des protéines de fusion et des études in vivo doivent être réalisées afin de valider son efficacité thérapeutique.In recent years, the understanding of disease molecular mechanisms has led to the identification of genes and proteins that are altered in disease state and many therapeutic targets have been found located within cells. The protective and hydrophobic nature of plasma membrane prevents therapeutic drugs from entering cells. Cell-penetrating peptides (CPPs) or protein transduction domains (PTDs) have emerged as a group of non-invasive delivery vectors for various hydrophilic macromolecules, and several in vitro and in vivo applications as pharmaceutical carriers have been reported. A novel cell-penetrating peptide deriving from the Epstein-Barr virus ZEBRA transcription factor has been recently characterized in our laboratory. A reductionist study of full-length ZEBRA protein has allowed to identify the amino acid region (named as Minimal Domain, MD) implicated in cellular uptake. This peptide is able to cross the mammalian cell membranes via a direct translocation mechanism even when fused to cargo molecules such as eGFP reporter protein. The direct penetration mechanism represents a great advantage for therapeutic applications as the cargo molecules can be directly delivered into cells cytoplasm in a biological active form. The aim of this thesis is to explore the cell-penetrating properties of the MD peptide and evaluate its applications as therapeutic protein delivery system. This work is structured in three parts.The first part describes the study on the optimization of MD peptide sequence by size-reduction and the evaluation of its amino acid composition role in the translocation process across the cell membrane. This study has led to the identification of a shorter MD sequence (MD11) with unvaried mechanism of translocation. The second section describes a MD11-based therapeutic approach aiming at repair a dysfunction of the protein synthesis identified in most cancers. The regulation of the protein synthesis has a crucial role in governing the eukaryotic cell growth and subtle defects in the translational machinery can alter the cellular physiology and lead to cell malignancy. Among the different factors intervening in the regulation of this process, the eukaryotic initiation factor 3 (eIF3) contributes to oncogenesis and maintenance of the cancer state. This complex is composed of 13 subunits (designated eIF3 a-m). The expression of eIF3 subunits is altered in several cancers, and in particular the f subunit (eIF3f) is significantly down-regulated in pancreas, vulva, breast, melanoma, ovary and small intestine tumors. The eIF3f ectopic expression by transient gene transfection inhibits cellular protein synthesis and induces apoptosis in melanoma and pancreatic cancer cells. Starting from these observations, we developed an innovative therapeutic approach for cancer treatment in which the missing eIF3f protein is produced in vitro in fusion to MD11, and delivered to cells. These results have demonstrated that the MD11- based eIF3f transfer system may represent a powerful strategy to suppress the tumor-cell proliferation. The last part of this thesis explores the cell-penetrating property of MD11 in yeast cells, and in particular in the pathogenic fungus Candida albicans. The presented results demonstrate the versatility of MD11, functioning as vectors in both yeast and mammalian cells and as carrier for proteins with biological activity.The MD11 potential as protein delivery system is evident; however some improvements regarding the fusion protein formulation and in vivo studies should be realized to validate the effectiveness of its therapeutic application

Vectorisation de molécules biologiques par la protéine ZEBRA du Virus Epstein-Barr : applications en thérapie humaine

In recent years, the understanding of disease molecular mechanisms has led to the identification of genes and proteins that are altered in disease state and many therapeutic targets have been found located within cells. The protective and hydrophobic nature of plasma membrane prevents therapeutic drugs from entering cells. Cell-penetrating peptides (CPPs) or protein transduction domains (PTDs) have emerged as a group of non-invasive delivery vectors for various hydrophilic macromolecules, and several in vitro and in vivo applications as pharmaceutical carriers have been reported. A novel cell-penetrating peptide deriving from the Epstein-Barr virus ZEBRA transcription factor has been recently characterized in our laboratory. A reductionist study of full-length ZEBRA protein has allowed to identify the amino acid region (named as Minimal Domain, MD) implicated in cellular uptake. This peptide is able to cross the mammalian cell membranes via a direct translocation mechanism even when fused to cargo molecules such as eGFP reporter protein. The direct penetration mechanism represents a great advantage for therapeutic applications as the cargo molecules can be directly delivered into cells cytoplasm in a biological active form. The aim of this thesis is to explore the cell-penetrating properties of the MD peptide and evaluate its applications as therapeutic protein delivery system. This work is structured in three parts.The first part describes the study on the optimization of MD peptide sequence by size-reduction and the evaluation of its amino acid composition role in the translocation process across the cell membrane. This study has led to the identification of a shorter MD sequence (MD11) with unvaried mechanism of translocation. The second section describes a MD11-based therapeutic approach aiming at repair a dysfunction of the protein synthesis identified in most cancers. The regulation of the protein synthesis has a crucial role in governing the eukaryotic cell growth and subtle defects in the translational machinery can alter the cellular physiology and lead to cell malignancy. Among the different factors intervening in the regulation of this process, the eukaryotic initiation factor 3 (eIF3) contributes to oncogenesis and maintenance of the cancer state. This complex is composed of 13 subunits (designated eIF3 a-m). The expression of eIF3 subunits is altered in several cancers, and in particular the f subunit (eIF3f) is significantly down-regulated in pancreas, vulva, breast, melanoma, ovary and small intestine tumors. The eIF3f ectopic expression by transient gene transfection inhibits cellular protein synthesis and induces apoptosis in melanoma and pancreatic cancer cells. Starting from these observations, we developed an innovative therapeutic approach for cancer treatment in which the missing eIF3f protein is produced in vitro in fusion to MD11, and delivered to cells. These results have demonstrated that the MD11- based eIF3f transfer system may represent a powerful strategy to suppress the tumor-cell proliferation. The last part of this thesis explores the cell-penetrating property of MD11 in yeast cells, and in particular in the pathogenic fungus Candida albicans. The presented results demonstrate the versatility of MD11, functioning as vectors in both yeast and mammalian cells and as carrier for proteins with biological activity.The MD11 potential as protein delivery system is evident; however some improvements regarding the fusion protein formulation and in vivo studies should be realized to validate the effectiveness of its therapeutic application.La compréhension des mécanismes moléculaires de différentes pathologies a permis la caractérisation de gènes et de protéines impliqués dans la pathogénèse et l'identification de cibles thérapeutiques intracellulaires. La nature hydrophobique de la membrane cellulaire empêche le passage des médicaments dans les cellules. Les Cell-Penetrating Peptides (CPP) ou domaines de transduction protéiques (PTD) sont des peptides qui permettent l'internalisation de macromolécules hydrophiles in cellulo et in vivo. Un nouveau peptide issu du facteur de transcription ZEBRA du virus Epstein-Barr, et qui possède des propriétés de transduction a été caractérisé récemment dans notre laboratoire. Des études par mutagénèse de délétion de la protéine ZEBRA ont permis d'identifier la région d'acides aminés (nommé ainsi MD) impliquée dans la pénétration cellulaire. Ce peptide traverse les membranes des cellules de mammifères par un mécanisme de translocation directe, même lorsqu'il est fusionné à des molécules telles que la protéine reportrice eGFP. Le mécanisme de pénétration directe représente un grand avantage pour les applications thérapeutiques: les molécules cargos peuvent être internalisées directement dans le cytoplasme cellulaire sans dégradation et sous une forme biologiquement active. L'objectif de cette thèse est d'étudier les propriétés de pénétration cellulaire du peptide MD et d'évaluer ses applications thérapeutiques comme système de vectorisation des protéines. Ce travail est structuré en trois parties. La première partie porte sur l'étude de l'optimisation de la séquence peptidique MD par réduction de taille et l'évaluation du rôle de sa composition en acides aminés dans le processus de translocation à travers la membrane cellulaire. Cette étude a conduit à l'identification d'une séquence plus courte MD (MD11) possédant une efficacité et un mécanisme de translocation inchangés. La deuxième partie décrit une approche thérapeutique basée sur MD11 visant à la complémentation protéique d'un dysfonctionnement identifiée dans la plupart des cancers. Les cellules tumorales présentent des altérations dans la machinerie de traduction résultant dans une prolifération cellulaire incontrôlée. Parmi les différents facteurs intervenant dans la régulation de ce processus, le facteur eucaryote d'initiation 3 (eIF3) contribue à l'oncogenèse et au maintien de l'état cancéreux. Ce complexe est composé de 13 sous-unités, désignées eIF3 a-m. L'expression de certaines sous-unités est altérée dans plusieurs cancers, et en particulier la sous-unité f (eIF3f) est significativement diminuée dans le mélanome, les cancers du pancréas, de la vulve, du sein, de l'intestin et de l'ovaire. L'expression ectopique par transfection transitoire du gène eIF3f inhibe la synthèse protéique et induit l'apoptose dans le mélanome et dans les cellules cancéreuses pancréatiques. A partir de ces observations, nous avons développé une approche thérapeutique innovante pour le traitement des cancers dans lesquels la protéine manquante eIF3f est produite sous forme recombinante fusionnée à la séquence de MD11, et ensuite internalisée dans les cellules cibles tumorales. Ces résultats démontrent que le système de transfert de eIF3f basé sur MD11 représente une stratégie efficace pour supprimer la prolifération des cellules tumorales. La dernière partie de cette thèse explore la propriété de pénétration de MD11 dans les cellules de levure, et en particulier dans le champignon pathogène Candida albicans. Les résultats obtenus démontrent la polyvalence de MD11, qui fonctionne comme vecteur de protéines à activité biologique aussi bien dans la levure que dans les cellules de mammifères. Le potentiel de MD11 comme système de transport et de relargage des protéines a donc été établis, toutefois certaines améliorations en ce qui concerne la formulation des protéines de fusion et des études in vivo doivent être réalisées afin de valider son efficacité thérapeutique

Herpesvirus Late Gene Expression: A Viral-Specific Pre-initiation Complex Is Key

International audienceDuring their productive cycle, herpesviruses exhibit a strictly regulated temporal cascade of gene expression that can be divided into three general stages: immediate-early (IE), early (E), and late (L). This expression program is the result of a complex interplay between viral and cellular factors at both the transcriptional and post-transcriptional levels, as well as structural differences within the promoter architecture for each of the three gene classes. Since the cellular enzyme RNA polymerase II (RNAP-II) is responsible for the transcription of herpesvirus genes, most viral promoters contain DNA motifs that are common with those of cellular genes, although promoter complexity decreases from immediate-early to late genes. Immediate-early and early promoters contain numerous cellular and viral cis-regulating sequences upstream of a TATA box, whereas late promoters differ significantly in that they lack cis-acting sequences upstream of the transcription start site (TSS). Moreover, in the case of the β-and γ-herpesviruses, a TATT box motif is frequently found in the position where the consensus TATA box of eukaryotic promoters usually localizes. The mechanisms of transcriptional regulation of the late viral gene promoters appear to be different between α-herpesviruses and the two other herpesvirus subfamilies (β and γ). In this review, we will compare the mechanisms of late gene transcriptional regulation between HSV-1, for which the viral IE transcription factors-especially ICP4-play an essential role, and the two other subfamilies of herpesviruses, with a particular emphasis on EBV, which has recently been found to code for its own specific TATT-binding protein

The translational factor eIF3f: the ambivalent eIF3 subunit.

International audienceThe regulation of the protein synthesis has a crucial role in governing the eukaryotic cell growth. Subtle changes of proteins involved in the translation process may alter the rate of the protein synthesis and modify the cell fate by shifting the balance from normal status into a tumoral or apoptotic one. The largest eukaryotic initiation factor involved in translation regulation is eIF3. Amongst the 13 factors constituting eIF3, the f subunit finely regulates this balance in a cell-type-specific manner. Loss of this factor causes malignancy in several cells, and atrophy in normal muscle cells. The intracellular interacting partners which influence its physiological significance in both cancer and muscle cells are detailed in this review. By delineating the global interaction network of this factor and by clarifying its intracellular role, it becomes apparent that the f subunit represents a promising candidate molecule to use for biotherapeutic applications

MD11-mediated delivery of recombinant eIF3f induces melanoma and colorectal carcinoma cell death

The f subunit of the eukaryotic initiation factor 3 (eIF3f) is downregulated in several cancers and in particular in melanoma and pancreatic cancer cells. Its enforced expression by transient gene transfection negatively regulates cancer cell growth by activating apoptosis. With the aim to increase the intracellular level of eIF3f proteins and activate apoptosis in cancer cell lines, we developed a protein transfer system composed of a cell-penetrating peptide sequence fused to eIF3f protein sequence (MD11 - eIF3f). To determine whether exogenously administered eIF3f proteins were able to compensate the loss of endogenous eIF3f and induce cancer cell death, we analyzed the therapeutic action of MD11 - eIF3f in several tumor cells. We identified four cell lines respondent to eIF3f-treatment and we evaluated the antitumor properties of the recombinant proteins using dose-and time-dependent studies. Our results demonstrate that this protein delivery approach represents an innovative and powerful strategy for cancer treatment

Reazioni avverse osservabili dopo vaccinazione

Per riconoscere le reazioni avverse dopo immunizzazione è fondamentale definire le caratteristiche cliniche della manifestazione, valutare la diagnosi sulla base dell’anamnesi raccolta e considerare se l’evento descritto risponda a una definizione di caso riconosciuta. Il Gruppo di Lavoro per la Vaccinovigilanza, istituito presso l’Agenzia Italiana del Farmaco (AIFA) ha elaborato una Guida, di grande utilità scientifica e pratica, per la valutazione delle reazioni avverse osservabili dopo vaccinazione. Si tratta del primo lavoro sistematico di questo tipo

Dilated and failing cardiomyopathy in bradykinin B₂ receptor knockout mice

Background - The activation of B2 receptors by kinins could exert cardioprotective effects in myocardial ischemia and heart failure. Methods and Results — To test whether the absence of bradykinin B2 receptors may affect cardiac structure and function, we examined the developmental changes in blood pressure (BP), heart rate, and heart morphology of bradykinin B2 receptor gene knockout (B2−/−), heterozygous (B2+/−), and wild-type (B2+/+) mice. The BP of B2−/− mice, which was still normal at 50 days of age, gradually increased, reaching a plateau at 6 months (136±3 versus 109±1 mm Hg in B2+/+, P<0.01). In B2+/− mice, BP elevation was delayed. At 40 days, the heart rate was higher (P<0.01) in B2−/− and B2+/− than in B2+/+ mice, whereas the left ventricular (LV) weight and chamber volume were similar among groups. Thereafter, the LV growth rate of B2−/− and B2+/− mice was accelerated, leading at 360 days to a LV weight–to–body weight ratio that was 9% and 17% higher, respectively, than that of B2+/+ mice. In B2−/− mice, hypertrophy was associated with a marked chamber dilatation (42% larger than that of B2+/+ mice), an elevation in LV end-diastolic pressure (25±3 versus 5±1 mm Hg in B2+/+ mice, P<0.01), and reparative fibrosis. Conclusions — The disruption of the bradykinin B2 receptor leads to hypertension, LV remodeling, and functional impairment, implying that kinins are essential for the functional and structural preservation of the heart