Expression and functionality of Toll-Like receptors by B-chronic lymphocytic leukemia cells

La leucémie lymphoïde chronique reste une pathologie incurable même si les nouveaux moyens thérapeutiques permettent d’obtenir des réponses de bonne qualité. Les déterminants idiotypiques des lymphocytes B représentent une cible idéale pour la génération de cellules T spécifiques dirigées contre le clone malin. Dans ce cadre, l’induction d’une réponse immunitaire efficace semble donc intéressante. L’objectif principal de cette étude était d’augmenter l’immunogénicité des cellules tumorales de LLC-B. Pour cela, la possibilité d'une activation de ces cellules par des agonistes de Toll-like récepteurs (TLRs) a été explorée. Tout d’abord, le profil d’expression protéique des TLRs a été recherché au niveau des lymphocytes B sains et pathologiques par cytométrie de flux. La mise en évidence d'une expression significative de TLR-7 et TLR-9 a ensuite permis d'analyser l’effet d'une stimulation par des ligands de ces TLRs par immunophénotyage, cytomorphologie, analyse de l’apoptose par la méthode TUNEL et étude de la prolifération par marquage CFSE. Le profil cytokinique des suspensions cellulaires stimulées ou non a également été examiné par cytométrie de flux. Enfin, une analyse fonctionnelle a été réalisée dans un modèle de stimulation allogénique afin de mesurer la capacité de ces cellules stimulées à activer des lymphocytes T naïfs. Les résultats obtenus montrent un profil d’expression des TLR-4, -7, -9 et -10 similaire pour les cellules B de LLC et les lymphocytes B sains avec toutefois une expression plus importante de TLR-9 dans les cellules tumorales. L’engagement de TLR-4 a pour conséquence une faible activation de HLA-DR sur les cellules B saines et tumorales. L’activation de TLR-7 via les plus fortes concentrations d'imiquimod R837 induit surtout une apoptose rapide et importante des cellules de LLC-B ainsi qu'une augmentation modérée de l'expression des marqueurs de costimulation et de présentation des cellules B saines et tumorales. La stimulation de TLR-9 via les ODN CpG entraîne une activation des cellules B saines et tumorales et protège les cellules tumorales de l'apoptose. Les profils cytokiniques des suspensions cellulaires ont montré que ces ligands de TLRs orientent les réponses cellulaires vers un profil pro-inflammatoire, éventuellement propice à la génération de réponses cellulaires, potentiellement anti-tumorales via la production d'IL-8 et de TNF. Enfin, il est apparu que les cellules amygdaliennes et tumorales stimulées avec les ODN CpG n'étaient pas capables d'activer des lymphocytes T naïfs allogéniques, ce qui pourrait être lié à la faible production d'IL-2 ou à la production d'IL-10 par ces cellules. En conclusion, TLR-7 et TLR-9 représentent des cibles thérapeutiques intéressantes dans le traitement de la LLC-B. L’imiquimod R837 pourrait aider à la clairance tumorale dans les LLC-B. L’activation cellulaire induite par via les ODN CpG M362 pourrait par contre être utilisée pour augmenter le potentiel de cellules présentatrices d’antigènes des cellules B de LLC à condition de parvenir à contrecarrer l'environnement tolérogène et à différencier les cellules B en cellules activatrices de réponses Th1 et cytotoxiques.thesi

Expression et fonctionnalité des Toll-Like récepteurs par les cellules de leucémie lymphoïde chronique B

UnavailableLa leucémie lymphoïde chronique reste une pathologie incurable même si les nouveaux moyens thérapeutiques permettent d'obtenir des réponses de bonne qualité. Les déterminants idiotypiques des lymphocytes B représentent une cible idéale pour la génération de cellules T spécifiques dirigées contre le clone malin. Dans ce cadre, l'induction d'une réponse immunitaire efficace semble donc intéressante. L'objectif principal de cette étude était d'augmenter l'immunogénicité des cellules tumorales de LLC-B. Pour cela, la possibilité d'une activation de ces cellules par des agonistes de Toll-like récepteurs (TLRs) a été explorée. Tout d'abord, le profil d'expression protéique des TLRs a été recherché au niveau des lymphocytes B sains et pathologiques par cytométrie de flux. La mise en évidence d'une expression significative de TLR-7 et TLR-9 a ensuite permis d'analyser l'effet d'une stimulation par des ligands de ces TLRs par immunophénotyage, cytomorphologie, analyse de l'apoptose par la méthode TUNEL et étude de la prolifération par marquage CFSE. Le profil cytokinique des suspensions cellulaires stimulées ou non a également été examiné par cytométrie de flux. Enfin, une analyse fonctionnelle a été réalisée dans un modèle de stimulation allogénique afin de mesurer la capacité de ces cellules stimulées à activer des lymphocytes T naïfs. Les résultats obtenus montrent un profil d'expression des TLR-4, -7, -9 et -10 similaire pour les cellules B de LLC et les lymphocytes B sains avec toutefois une expression plus importante de TLR-9 dans les cellules tumorales. L'engagement de TLR-4 a pour conséquence une faible activation de HLA-DR sur les cellules B saines et tumorales. L'activation de TLR-7 via les plus fortes concentrations d'imiquimod R837 induit surtout une apoptose rapide et importante des cellules de LLC-B ainsi qu'une augmentation modérée de l'expression des marqueurs de costimulation et de présentation des cellules B saines et tumorales. La stimulation de TLR-9 via les ODN CpG entraîne une activation des cellules B saines et tumorales et protège les cellules tumorales de l'apoptose. Les profils cytokiniques des suspensions cellulaires ont montré que ces ligands de TLRs orientent les réponses cellulaires vers un profil pro-inflammatoire, éventuellement propice à la génération de réponses cellulaires, potentiellement anti-tumorales via la production d'IL-8 et de TNF. Enfin, il est apparu que les cellules amygdaliennes et tumorales stimulées avec les ODN CpG n'étaient pas capables d'activer des lymphocytes T naïfs allogéniques, ce qui pourrait être lié à la faible production d'IL-2 ou à la production d'IL-10 par ces cellules. En conclusion, TLR-7 et TLR-9 représentent des cibles thérapeutiques intéressantes dans le traitement de la LLC-B. L'imiquimod R837 pourrait aider à la clairance tumorale dans les LLC-B. L'activation cellulaire induite par via les ODN CpG M362 pourrait par contre être utilisée pour augmenter le potentiel de cellules présentatrices d'antigènes des cellules B de LLC à condition de parvenir à contrecarrer l'environnement tolérogène et à différencier les cellules B en cellules activatrices de réponses Th1 et cytotoxiques

Expression et fonctionnalité des Toll-Like récepteurs par les cellules de leucémie lymphoïde chronique B

La leucémie lymphoïde chronique reste une pathologie incurable même si les nouveaux moyens thérapeutiques permettent d obtenir des réponses de bonne qualité. Les déterminants idiotypiques des lymphocytes B représentent une cible idéale pour la génération de cellules T spécifiques dirigées contre le clone malin. Dans ce cadre, l induction d une réponse immunitaire efficace semble donc intéressante. L objectif principal de cette étude était d augmenter l immunogénicité des cellules tumorales de LLC-B. Pour cela, la possibilité d'une activation de ces cellules par des agonistes de Toll-like récepteurs (TLRs) a été explorée. Tout d abord, le profil d expression protéique des TLRs a été recherché au niveau des lymphocytes B sains et pathologiques par cytométrie de flux. La mise en évidence d'une expression significative de TLR-7 et TLR-9 a ensuite permis d'analyser l effet d'une stimulation par des ligands de ces TLRs par immunophénotyage, cytomorphologie, analyse de l apoptose par la méthode TUNEL et étude de la prolifération par marquage CFSE. Le profil cytokinique des suspensions cellulaires stimulées ou non a également été examiné par cytométrie de flux. Enfin, une analyse fonctionnelle a été réalisée dans un modèle de stimulation allogénique afin de mesurer la capacité de ces cellules stimulées à activer des lymphocytes T naïfs. Les résultats obtenus montrent un profil d expression des TLR-4, -7, -9 et -10 similaire pour les cellules B de LLC et les lymphocytes B sains avec toutefois une expression plus importante de TLR-9 dans les cellules tumorales. L engagement de TLR-4 a pour conséquence une faible activation de HLA-DR sur les cellules B saines et tumorales. L activation de TLR-7 via les plus fortes concentrations d'imiquimod R837 induit surtout une apoptose rapide et importante des cellules de LLC-B ainsi qu'une augmentation modérée de l'expression des marqueurs de costimulation et de présentation des cellules B saines et tumorales. La stimulation de TLR-9 via les ODN CpG entraîne une activation des cellules B saines et tumorales et protège les cellules tumorales de l'apoptose. Les profils cytokiniques des suspensions cellulaires ont montré que ces ligands de TLRs orientent les réponses cellulaires vers un profil pro-inflammatoire, éventuellement propice à la génération de réponses cellulaires, potentiellement anti-tumorales via la production d'IL-8 et de TNF. Enfin, il est apparu que les cellules amygdaliennes et tumorales stimulées avec les ODN CpG n'étaient pas capables d'activer des lymphocytes T naïfs allogéniques, ce qui pourrait être lié à la faible production d'IL-2 ou à la production d'IL-10 par ces cellules. En conclusion, TLR-7 et TLR-9 représentent des cibles thérapeutiques intéressantes dans le traitement de la LLC-B. L imiquimod R837 pourrait aider à la clairance tumorale dans les LLC-B. L activation cellulaire induite par via les ODN CpG M362 pourrait par contre être utilisée pour augmenter le potentiel de cellules présentatrices d antigènes des cellules B de LLC à condition de parvenir à contrecarrer l'environnement tolérogène et à différencier les cellules B en cellules activatrices de réponses Th1 et cytotoxiques.thesisNANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocSudocFranceF

5-aza-2′-deoxycytidine-mediated c-myc Down-regulation Triggers Telomere-dependent Senescence by Regulating Human Telomerase Reverse Transcriptase in Chronic Myeloid Leukemia

Increased proliferation rates as well as resistance to apoptosis are considered major obstacles for the treatment of patients with chronic myelogenous leukemia (CML), thus highlighting the need for novel therapeutic approaches. Since senescence has been recognized as a physiological barrier against tumorigenesis, senescence-based therapy could represent a new strategy against CML. DNA demethylating agent 5-aza-2′-deoxycytidine (DAC) was reported to induce cellular senescence but underlying mechanisms remain to be elucidated. Here, we report that exposure to DAC triggers senescence in chronic leukemia cell lines as evidenced by increased senescence-associated β-galactosidase activity and lysosomal mass, accompanied by an up-regulation of cell cycle-related genes. We provide evidence that DAC is able to decrease telomere length, to reduce telomerase activity and to decrease human telomerase reverse transcriptase (hTERT) expression through decreased binding of c-myc to the hTERT promoter. Altogether, our results reveal the role of c-myc in telomere-dependent DAC-induced senescence and therefore provide new clues for improving chronic human leukemia treatments

Properly Substituted Analogues of BIX-01294 Lose Inhibition of G9a Histone Methyltransferase and Gain Selective Anti-DNA Methyltransferase 3A Activity

International audienceChemical manipulations performed on the histone H3 lysine 9 methyltransferases (G9a/GLP) inhibitor BIX-01294 afforded novel desmethoxyquinazolines able to inhibit the DNA methyltransferase DNMT3A at low micromolar levels without any significant inhibition of DNMT1 and G9a. In KG-1 cells such compounds, when tested at sub-toxic doses, induced the luciferase re-expression in a stable construct controlled by a cytomegalovirus (CMV) promoter silenced by methylation (CMV-luc assay). Finally, in human lymphoma U-937 and RAJI cells, the N-(1-benzylpiperidin-4-yl)-2-(4-phenylpiperazin-1-yl)quinazolin-4-amine induced the highest proliferation arrest and cell death induction starting from 10 µM, in agreement with its DNMT3A inhibitory potency

Inhibition values of 4, 10, 13 and 14 against the catalytic domain of hDNMT3A, hDNMT1 and G9a.

<p>^*Values are means of at least three experiments. ^†Compounds were tested in a 10-dose IC₅₀ mode with 2-fold serial dilution starting at 400 µM. For <b>4</b>, <b>13</b> and <b>14</b> it was no possible to determine IC₅₀ values (see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0096941#pone.0096941.s001" target="_blank">File S1</a>).</p

Docking studies of 4 and 14 into the DNMT3A active site.

<p>Experimental (A) and theoretical (B and C) binding mode of AdoHcy (A), <b>4</b> (B) and <b>14</b> (C) in the DNMT3A active site. Protein is depicted as light yellow ribbons and sticks while ligands are depicted as red sticks. Hydrogen-bonds are depicted as dashed blue lines.</p

Quinazoline-based modulators of epigenetic targets.

<p>(A) Known quinazolines (<b>1–3</b>) as G9a/GLP inhibitors. (B) Novel 6,7-desmethoxyquinazolines <b>4–18</b>. (C) Synthetic scheme for the preparation of <b>4–18</b>.</p

Effect of selected quinazoline analogues <b>4</b>, <b>10</b>, <b>13</b> and <b>14</b> on human lymphoma U-937 and RAJI cell viability at 48 h^*.

<p>*Data represent the mean (± SD) of at least three independent experiments.</p