Roadblocks to translational challenges on viral pathogenesis.

Distinct roadblocks prevent translating basic findings in viral pathogenesis into therapies and implementing potential solutions in the clinic. An ongoing partnership between the Volkswagen Foundation and Nature Medicine resulted in an interactive meeting in 2012, as part of the "Herrenhausen Symposia" series. Current challenges for various fields of viral research were recognized and discussed with a goal in mind--to identify solutions and propose an agenda to address the translational barriers. Here, some of the researchers who participated at the meeting provide a concise outlook at the most pressing unmet research and clinical needs, identifying these key obstacles is a necessary step towards the prevention and cure of human viral diseases

Targeting the MAPK Pathway in KRAS-Driven Tumors.

KRAS mutations occur in a quarter of all of human cancers, yet no selective drug has been approved to treat these tumors. Despite the recent development of drugs that block KRASG12C, the majority of KRAS oncoproteins remain undruggable. Here, we review recent efforts to validate individual components of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway as targets to treat KRAS-mutant cancers by comparing genetic information derived from experimental mouse models of KRAS-driven lung and pancreatic tumors with the outcome of selective MAPK inhibitors in clinical trials. We also review the potential of RAF1 as a key target to block KRAS-mutant cancers.This work was supported by grants from the European Research Council (ERC-AG/695566, THERACAN), the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities (RTI2018-094664-B-I00 and RTC2017-6576-1), the Autonomous Community of Madrid (B2017/BMD-3884 iLUNG-CM), and the Asociacion Espanola contra el Cancer (GC166173694BARB). M.B. is a recipient of an Endowed Chair from the AXA Research Fund.S

Targeting KRAS mutant lung cancer: light at the end of the tunnel.

For decades, KRAS mutant lung adenocarcinomas (LUAD) have been refractory to therapeutic strategies based on personalized medicine owing to the complexity of designing inhibitors to selectively target KRAS and downstream targets with acceptable toxicities. The recent development of selective KRASG12C inhibitors represents a landmark after 40 years of intense research efforts since the identification of KRAS as a human oncogene. Here, we discuss the mechanisms responsible for the rapid development of resistance to these inhibitors, as well as potential strategies to overcome this limitation. Other therapeutic strategies aimed at inhibiting KRAS oncogenic signaling by targeting either upstream activators or downstream effectors are also reviewed. Finally, we discuss the effect of targeting the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, both based on the failure of MEK and ERK inhibitors in clinical trials, as well as on the recent identification of RAF1 as a potential target due to its MAPK-independent activity. These new developments, taken together, are likely to open new avenues to effectively treat KRAS mutant LUAD.This work was supported by grants from the European Research Council (ERC-2015-AdG/695566, THERACAN), the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities (RTC-2017-6576, RTI2018-094664-BI00) the Autonomous Community of Madrid (B2017/BMD-3884 iLUNG-CM) and the CRIS Cancer Foundation (to MB) as well as the Spanish Ministry of Science and Innovation (PID2020-116705RB-100) (to MD). MB is a recipient of an Endowed Chair from the AXA Research Fund.S

Plaque assay for human coronavirus NL63 using human colon carcinoma cells

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Coronaviruses cause a broad range of diseases in animals and humans. Human coronavirus (hCoV) NL63 is associated with up to 10% of common colds. Viral plaque assays enable the characterization of virus infectivity and allow for purifying virus stock solutions. They are essential for drug screening. Hitherto used cell cultures for hCoV-NL63 show low levels of virus replication and weak and diffuse cytopathogenic effects. It has not yet been possible to establish practicable plaque assays for this important human pathogen.</p> <p>Results</p> <p>12 different cell cultures were tested for susceptibility to hCoV-NL63 infection. Human colon carcinoma cells (CaCo-2) replicated virus more than 100 fold more efficiently than commonly used African green monkey kidney cells (LLC-MK2). CaCo-2 cells showed cytopathogenic effects 4 days post infection. Avicel, agarose and carboxymethyl-cellulose overlays proved suitable for plaque assays. Best results were achieved with Avicel, which produced large and clear plaques from the 4^thday of infection. The utility of plaque assays with agrose overlay was demonstrated for purifying virus, thereby increasing viral infectivity by 1 log 10 PFU/mL.</p> <p>Conclusion</p> <p>CaCo-2 cells support hCoV-NL63 better than LLC-MK2 cells and enable cytopathogenic plaque assays. Avicel overlay is favourable for plaque quantification, and agarose overlay is preferred for plaque purification. HCoV-NL63 virus stock of increased infectivity will be beneficial in antiviral screening, animal modelling of disease, and other experimental tasks.</p

Chikungunya Fever in Travelers Returning to Europe from the Indian Ocean Region, 2006

Chikungunya fever should be added to the list of differential diagnoses for ill travelers returning from this region

Gentherapeutische Intervention beim medullären Schilddrüsenkarzinom durch adenoviral vermittelte Expression dominant-negativer RET Proto-Onkogen Mutanten

Als Ursache für das Auftreten sowohl sporadischer als auch hereditärer Formen des medullären Schilddrüsenkarzinoms (MTC) gelten aktivierende Mutationen im RET Proto-Onkogen, die in über 95% aller untersuchten Karzinome gefunden wurden. Das RET Proto-Onkogen kodiert für eine Rezeptor-Tyrosinkinase, die im Normalfall an Entwicklungsprozessen beteiligt ist. Durch onkogene Mutationen kommt es dabei zur konstitutiven Aktivierung der Tyrosinkinase, was hier eine entscheidende Bedeutung für die Tumorentstehung hat. Ziel der Arbeit war es daher, durch Gentransfer dominant-negativer Mutanten des RET Rezeptors, die onkogen veränderten RET Proteine in einer MTC-Zelllinie (TT) zu inhibieren und die daraus entstehenden Konsequenzen in Bezug auf eine potenzielle therapeutische Anwendung hin zu untersuchen. Zum Gentransfer dieser Mutanten wurden demzufolge adenovirale Vektoren eingesetzt, wobei ein synthetischer Calcitonin-Promotor (TSE2.CP1) zur Gewährleistung einer Zielzell-selektiven Expression verwendet wurde. Durch Reportergenanalysen konnte hier verdeutlicht werden, dass der TSE2.CP1-Promotor, auch im Kontext adenoviraler Vektoren, die Selektivität für C-Zellen, wie hier am Beispiel der TT-Zelllinie gezeigt, behält. Zwei zuvor beschriebene, dominant-negative RET Mutanten (RET HSCR32 und RET flag) wurden so unter der Kontrolle des TSE2.CP1-Promotors mit Hilfe adenoviraler Vektoren in der TT-Zelllinie, die eine häufige MTC-assoziierte RET Mutation trägt, exprimiert. Durch Mutationen in der extrazytoplasmatischen Region werden diese Mutanten nicht auf der Zelloberfläche exprimiert und stattdessen im endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten. Der dominant-negative Effekt der Mutanten beruht dabei auf der intrazellulären Dimerisierung mit onkogenen RET Mutanten. Wie hier gezeigt wurde, wird endogenes onkogenes RET in TT-Zellen nach Gentransfer der dominant-negativen Mutanten effizient im ER zurückgehalten. Darüber hinaus war eine ausgeprägte Zytotoxizität bei Expression von RET HSCR32 und RET flag zu beobachten, die auf Apoptose-Induktion beruhte. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Untersuchungen lag in der in vivo-Analyse des Antitumor-Potenzials der dominant-negativen Mutante RET flag, exemplarisch für beide extrazytoplasmatischen Mutanten, im Xenotransplantatmodell.. Die erzielten Ergebnisse verdeutlichten dabei, dass eine signifikante Lebensverlängerung der so behandelten Mäuse zu beobachten war. In einem einzigen Fall (10 %) konnte darüber hinaus eine vollständige Heilung erzielt werden. Da der pro-apoptotische Effekt von RET HSCR32 und RET flag jedoch, wie anschließend gezeigt werden konnte, unabhängig von ihren dominant-negativen Eigenschaften war und stattdessen auf Apoptose-Mechanismen, die zu Stressreaktionen im endoplasmatischen Retikulum führten, zurückzuführen war, wurde weiterhin das Antitumor-Potenzial einer Tyrosinkinase-deletierten RET Mutante (RET DTK) untersucht, die keine extrazytoplasmatischen Mutationen aufwies. Diese Mutante dimerisiert mit onkogenem RET an der Zelloberfläche und inhibiert dadurch die RET trans-Autophosphorylierung. Der adenovirale Gentransfer von RET DTK unter der Kontrolle des CMV-Promotors in TT-Zellen bestätigt diesen Sachverhalt. Nach Inhibition der endogenen trans-Autophosphorylierung onkogener RET Mutanten war eine signifikante Wachstumsreduktion von TT-Zellen zu beobachten. Diese war selektiv auf die Inhibition der RET trans-Autophosphorylierung zurückzuführen, da RET-negative Zellen unbeeinflusst blieben. Als Ursache konnte sowohl eine gesteigerte Apoptoserate wie auch eine reduzierte Proliferationsrate identifiziert werden. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate liefern also einen ersten Hinweis darauf, dass die Inhibition von onkogen aktiviertem RET durch dominant-negative Mutanten in der Zukunft eine alternative Strategie zur Behandlung von MTCs darstellen könnte

Coordinated Implementation of Chikungunya Virus Reverse Transcription–PCR

A preformulated chikungunya virus real-time reverse transcription–PCR, quality-confirmed oligonucleotides, and noninfectious virus controls were distributed by the European Network for the Diagnosis of Imported Viral Diseases. An international proficiency study with 31 participants demonstrated that ad hoc implementation of molecular diagnostics was feasible and successful