Isolamento e construção de cassetes de inativação de genes codificadores de colagenases de Streptococcus mutans com possível envolvimento na degradação colagenolítica em Cárie Radicular

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Odontologia, Programa de Pós-Graduação em em Odontologia, 2020.A função das bactérias no estágio de desmineralização do desenvolvimento de cárie é bem conhecida. Porém, sabe-se muito pouco de sua função na fase de degradação da matriz colagenolítica. Tendo em vista o pouco conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo, o estudo constitui a investigação biomolecular acerca da atividade de proteases em lesões cariosas radiculares. O objetivo foi realizar uma manipulação genética de duas colagenases putativas do Streptococcus mutans UA159, codificadas pelos genes SMU_761 e SMU_759 (família PrtC - pepitidase U32), capazes de degradar colágeno tipo I, possivelmente envolvidas no processo de degradação da matriz colagenolítica em lesões cariosas radiculares. Para isto, colônias de S. mutans UA159 foram cultivadas em ágar BHI, por 18h, a 37oC em microaerofilia. Primers específicos para os genes alvo foram desenhados para isolamento por PCR das regiões codantes de interesse (SMU_761 e SMU_759). Os isolados foram clonados no vetor pGEM®-T (Promega) e analisados por digestão com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI. Uma segunda PCR com primers de sítios BamHI e EcoRI foi necessária para o gene SMU_759. A análise dos amplicons revelou tamanhos esperados dos genes SMU_761 (1287pb) e SMU_759 (927 pb) no gel de eletroforese. Uma segunda clonagem foi realizada em plasmídeo denominado pSC, também digerido com as enzimas da primeira clonagem, derivado do plasmídeo altamente sensível à temperatura pHY304, com intuito de paralisar ou inativar as colagenases estudadas. A clonagem e análises de restrição confirmaram a expressão dos genes alvos. Conclui-se que os genes SMU_759 e SMU_761 são de fácil manipulação. Sugerimos, porém, que pode haver importância no genoma pela dificuldade de transformação no S. mutans. As perspectivas desse estudo consideram a transformação e teste dos mutantes com as colagenases inativadas para avaliar se existe influência na formação de lesões cariosas radiculares. Os resultados são essenciais para futura confirmação da função colagenolítica e cariogenicidade em lesões radiculares.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The role of bacteria in the demineralization stage of caries development is well established. However, little is known about its function in the collagenolytic matrix degradation stage. Due to the lack knowledge about the molecular mechanisms involved in this process, this study constitutes a biomolecular investigation on the activity of proteases in root caries lesions. The aim was to genetically manipulate two putative collagenases of the Streptococcus mutans UA159, encoded by the SMU_761 and SMU_759 genes (PrtC family - pepitidase U32), capable of degrading type I collagen and possibly involved in the degradation process of the collagenolytic matrix in root caries lesions. Colonies of S. mutans UA159 were grown on BHI agar, for 18h, at 37oC in microaerophilia. Specific primers for the target genes were designed for PCR isolation of the coding regions of interest (SMU_761 and SMU_759. The amplicons were analysed on a 1% agarose gel, cloned in the vector pGEM®-T (Promega), and, then, analysed by digestion with the restriction enzymes EcoRI and BamHI. A second PCR with primers from BamHI and EcoRI sites was required for the SMU_759 gene. An analysis of the amplicons revealed expected sizes of the SMU_761 (1287bp) and SMU_759 (927bp) genes in the electrophoresis gel. A second cloning was performed on a plasmid pSC, also digested with the enzymes of the first cloning, derived from the plasmid highly sensitive to temperature pHY304, in order to interrupt or inactivate the studied collagenases. Cloning and restriction analyzes confirmed the expression of the target genes. It can be concluded that the SMU_759 and SMU_761 genes are easy to manipulate. We suggest, however, an importance of those genes in the genome due to the struggling transformation. In our perspectives, a transformation and testing of mutants with inactivated collagenases will be performed to assess whether there is an influence on the development of root caries lesions. These results are essential for further confirmation of collagenolytic function and cariogenicity in root surfaces

Streptococcus mutans e seu metabolismo a nível molecular no contexto ecológico da doença cárie

Aim: For decades, the Streptococcus mutans was considered the main agent of caries. This review will show its history and metabolism at the molecular level. By understanding its metabolic pathways involved in the development of carious lesions, it can be possible to develop new methods of modulating biofilms in the control of caries, as well as to elucidate the need to continue researching this bacterium. Literature review: Although S. mutans does not constitute a significant proportion in the colonization of the oral microbiota of the sound dentition, its proportion increases when there is continuous acidification of the biofilm, associated with excess carbohydrates in the host diet. This is due to a set of virulence factors, such as adhesion, biofilm formation, acidogenicity, aciduricity, proteases activity, mutacins production and signal transduction pathways. Each of these properties coordinately alters the ecology of the dental biofilm.  Discussion: It is still relevant to understand the metabolism of S. mutans as a model microorganism in carious lesions due to its numerous virulence factors. However, in the context of caries as a dysbiosis, antimicrobial therapeutic strategies, more specifically anti-S.mutans, aiming to eliminate the microorganism, may not be the key to caries control, and the microbiome modulation may become the future of dental clinics. Conclusion: Biofilms associated with caries disease comprise a diverse ecosystem, suggesting a polymicrobial etiology, however, future studies aimed at the prospection, development and interrelationship of S. mutans with other microorganisms and with the human host are still justified in order to unravel the 'homeostasis-dysbiosis' transition.Objetivo: Durante décadas, o Streptococcus mutans foi considerado o principal agente etiológico da doença cárie. Esta revisão apresentará seu histórico e metabolismo a nível molecular. Ao entender as vias metabólicas do S.mutans envolvidas no  desenvolvimento de lesões cariosas, será possível desenvolver novos métodos de modulação de biofilmes no controle da doença cárie e elucidar a necessidade de continuar pesquisando essa bactéria. Revisão de literatura: Embora o S. mutans não constitua uma proporção significativa na colonização da microbiota bucal da dentição hígida, essa proporção aumenta quando há acidificação contínua do biofilme, associada ao excesso de carboidratos na dieta do hospedeiro. Isso ocorre devido a um conjunto de fatores de virulência, tais como, adesão, formação de biofilme, acidogenicidade, aciduricidade, atividades de proteases, produção de mutacinas e vias de transdução de sinal. Cada uma dessas propriedades, coordenadamente, alteram a ecologia do biofilme dental. Discussão: Ainda é relevante entender o metabolismo do S. mutans como microrganismo modelo em lesões cariosas devido a seus inúmeros fatores de virulência. Porém, no contexto da doença cárie como uma disbiose, estratégias terapêuticas antimicrobianas, mais especificamente anti-S.mutans, voltadas para a eliminação do microrganismo, podem não ser a chave do controle da doença cárie, enquanto a modulação do microbioma poderá se tornar o futuro das clínicas odontológicas. Conclusão: Biofilmes associados a doença cárie compreendem um ecossistema diverso, sugerindo uma etiologia polimicrobiana, porém, estudos futuros que visem à prospecção, ao desenvolvimento e à inter-relação do S. mutans com outros microrganismos e com o hospedeiro humano ainda são justificados a fim de desvendar a transição ‘homeostase-disbiose’

Presence of host and bacterial-derived collagenolytic proteases in carious dentin: a systematic review of ex vivo studies

Introduction and aimThe presence of host collagenases in the degradation of the protein matrix at later stages of carious dentin lesions development, as well as the potential involvement of bacterial collagenases, have been suggested but lack conclusive evidence. This study aims to conduct a systematic review to comprehensively assess the profile of host and bacterial-derived collagenolytic proteases in both root and coronal dentin carious lesions.MethodsThe search was performed in eight databases and the grey literature. Studies evaluating ex vivo dentin, extracted teeth, or biofilms from natural caries lesions were included. The methodological quality of studies was assessed using the Joanna Briggs Institute tool. Synthesis of the results and the certainty of evidence were performed following the Synthesis without Meta-analysis (SWiM) checklist and GRADE approach for narrative synthesis, respectively.ResultsFrom 935 recovered articles, 18 were included. Although the evidence was very uncertain, it was possible to suggest that 1) MMP-2, MMP-9, MMP-13, and CT-B may be increased in carious dentin when compared to sound dentin; 2) there is no difference in MMP-2 presence, while MMP-13 may be increased in root when compared to coronal carious dentin; 3) there is no difference of MMP-2 and MMP-9 expression/activity before and after cavity sealing; 4) MMP-8 may be increased in the dentin before cavity sealing compared to dentin after cavity sealing; 5) there is no difference of MMP-20 in irradiated vs. non-irradiated carious dentin. MMP-20 probably reduces in carious outer dentin when compared to carious inner dentin (moderate certainty). Genes encoding bacterial collagenolytic proteases and protein-degrading bacteria were detected in coronal and root carious lesions.ConclusionTrends in the direction of the effect were observed for some collagenolytic proteases in carious dentin, which may represent a potential target for the development of new treatments. (Protocol register-PROSPERO: CRD42020213141)

Anais da XXV Jornada Odontológica da Universidade de Brasília (UnB)

Resumos dos trabalhos aprovados e apresentados durante a XXV Jornada Odontológica da Universidade de Brasília (JOUnB), realizada em Brasília, entre os dias 19 a 22 de julho de 2022, evento organizado pelos discentes e docentes da Universidade de Brasília

Manejo de cárie radicular: um guia para o dentista brasileiro baseado na tradução e adaptação cultural do consenso internacional/ORCA E EFCD

Aim: Root caries are a problem in modern dentistry, but the lack of guidelines regarding their management is notable. We aim to develop and adapt a guide based on the translation of the recommendations of the international consensus as outlined by the European Organization for Caries Research (ORCA) and the European Federation of Conservative Dentistry (EFCD) for clinical decision-making in the intervention of the caries process in the elderly, with a focus on root caries. Materials and methods: The protocol for translating the recommendations of the international consensus consisted of the following steps: (1) initial translation, (2) synthesis of the translation, (3) back-translation, (4) review by an expert committee with cultural adaptation. Based on the translation, a guide was developed with guidelines for the treatment of root caries in Brazil. Results: To prevent new lesions, daily brushing with toothpaste >1,500ppm/F is recommended. Toothpaste with 5,000ppm/F or varnishes (>20,000ppm/F) may be recommended to paralyze active root lesions and for prevention in elderly people with high susceptibility to root caries, and Silver Diamine Fluoride (>30%) to paralyze active lesions. Direct invasive interventions are indicated depending on the clinical situation. Discussion: There is a lack of interest in primary studies on treatments for root caries, thus creating a gap in relation to its management, which is reflected by the level of evidence detected in the consensus. Conclusion: Clinical guidelines are important to reduce the gap between research and clinical practice. This translation into Portuguese will facilitate access by Brazilian dentists to the consolidated evidence gathered to date for the management of root caries.Objetivo: A cárie radicular é um problema da Odontologia moderna, porém é notável a falta de diretrizes sobre o seu manejo. Objetivamos elaborar e adaptar um guia a partir da tradução das recomendações do consenso internacional European Organization for Caries Research (ORCA) e European Federation of Conservative Dentistry (EFCD) para as tomadas de decisão clínica na intervenção do processo de cárie na pessoa idosa, com foco na cárie radicular. Materiais e métodos: O protocolo de tradução das recomendações do consenso internacional consistiu nas etapas: (1) tradução inicial, (2) síntese da tradução, (3) retradução, (4) revisão por comitê de especialistas, com adaptação cultural. A partir da tradução, foi desenvolvido um guia com diretrizes para tratamento de cárie radicular no Brasil. Resultados: Para prevenção de novas lesões é recomendada a escovação diária com dentifrício >1.500ppm/F. Dentifrícios com 5.000ppm/F ou vernizes (>20.000ppm/F) podem ser indicados para paralisar lesões radiculares ativas e para prevenção em pessoas idosas com alta suscetibilidade à cárie radicular, e o Diamino Fluoreto de Prata (>30%) para paralisar lesões ativas. Intervenções invasivas diretas são indicadas dependendo da situação clínica. Discussão: Nota-se uma falta de interesse em estudos primários sobre tratamentos para cárie radicular, criando assim uma lacuna em relação ao seu manejo, que reflete no nível de evidência detectado pelo consenso. Conclusão: Guias clínicos são importantes para reduzir a lacuna entre a pesquisa e a prática clínica. Essa tradução para o português facilitará o acesso dos dentistas brasileiros em relação a evidência consolidada até o momento para o manejo de cárie radicular

Phylogenetic analysis of rabies surveillance samples from north and northeast Brazil

Viruses of the Lyssavirus genus are classified into several genotypes (GT1 to GT7), of which only GT1 (classic rabies virus—RABV) has a cosmopolitan distribution and circulates in Brazil. GT1 is subdivided into several antigenic variants (AgV) maintained in independent cycles with a narrow host range and distinct geographic distributions, namely, AgV1 and AgV2 found in dogs, AgV3 in the vampire bats Desmodus rotundus, and AgV4 and AgV6 in bats non-hematophagous Tadarida brasiliensis and Lasiurus cinereus, a common variant of marmoset (Callithrix jacchus), and crab-eating fox (Cerdocyon thous). In this study, we performed phylogenetic analysis to identify at the antigenic variant level; six RABV genomes derived from the Rabies Surveillance in the north and northeast regions of Brazil. The analysis resulted in the formation of 11 monophyletic clusters, each corresponding to a particular variant, with high bootstrap support values. The samples were positioned inside the AgV3, AgV6, and Callithrix variant clades. This is the first report of the AgV6 variant found in northern Brazil, which provides valuable information for rabies surveillance in the country. The possibility of viral spillover has been much debated, as it deals with the risk of shifting transmission from a primary to a secondary host. However, more genomic surveillance studies should be performed, with a greater number and diversity of samples to better understand the transmission dynamics of each variant to detect changes in its geographic distribution and spillover events

Dental sensitivy and dental biofilm characterization and its relation with caries activity in children with Molar Incisor Hypomineralization

Trabalho de Conclusão de Curso (graduação)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Odontologia, 2017.Introdução: O acúmulo de biofilme maduro, responsável pelo processo de desmineralização dentária, constitui um agente importante para o estabelecimento da cárie. Em dentes com Hipomineralização Molar Incisivo a cárie ocorre, geralmente, de forma rampante em velocidade maior em relação a dentes não afetados. Ainda, dentes com HMI podem apresentar elevada sensibilidade, o que pode influenciar no padrão de higiene, contribuindo no aparecimento de cárie. Objetivos: Este trabalho teve como objetivos avaliar a prevalência de sensibilidade dentária e caracterizar a quantidade de biofilme supragengival de crianças de 7 e 8 anos portadoras de HMI. Material e métodos: Foram incluídas no estudo crianças que apresentavam os 4 primeiros molares permanentes irrompidos. Para a avaliação clínica um único examinador registrou a quantidade de biofilme por meio do critério de Ribeiro e colaboradores. HMI e cárie foram avaliados utilizando os critérios propostos por Cabral e Nyvad. A escala SCASS foi utilizada para o registro da sensibilidade dentária. Resultados: Foram avaliados 206 dentes de 46 crianças com idade média de 8,02 (± 0,69), 50% do sexo feminino e 50% do sexo masculino. Ao avaliar as variáveis idade da criança, cárie e HMI, somente a variável cárie dentária esteve relacionada significativamente com a presença de biofilme (p= 0,0001). Para sensibilidade foram examinados 184 dentes. Conclusão: A maioria das crianças (81, 52%) não demonstrou nenhum desconforto associado à HMI. Concluiu-se que o único fator preditor para a presença do biofilme foi a cárie e quanto mais grave a doença, maior acúmulo de biofilme foi observado. Ainda, que não houve associação entre sensibilidade dentária e HMI.Introduction: The mature biofilm accumulation, responsible for the process of dental demineralization, is an important agent for the establishment of carious lesions. On teeth with MIH, rampant caries is usually found and it occurs at a higher speed in relation to unaffected teeth. Affected teeth might present high sensitivity, what may influence the oral hygiene pattern contributing in the occurrence of dental caries. Objectives: The objective of this study was to characterize the amount of biofilm of 7 and 8 year old children with MIH. Material and methods: Children who had the first 4 permanent molars erupted were included in the study. For the clinical evaluation a calibrated examiner recorded the amount of biofilm by means of the criterion proposed by Ribeiro et al. MIH and dental caries were evaluated using the criteria proposed by Cabral and Nyvad. The SCASS scale was used to record tooth sensitivity. Results: 206 teeth of 46 children with a mean age of 8.02 (± 0.69) were evaluated, 50% were female and 50%, male. Conclusions: When assessing the variables age of the child, dental caries and MIH, only dental caries was significantly related to the presence of biofilm (p = 0.0001). With respect to sensitivity, 184 teeth were examined. The majority of children (81, 52%) did not show discomfort associated to MIH. It was concluded that the only predictive factor for the presence of biofilm was dental caries and also that the more severe the disease, the higher the biofilm accumulation. In addition, it was not observed an association between MIH and sensitivity

Streptococcus mutans e seu metabolismo a nível molecular no contexto ecológico da doença cárie

Aim: For decades, the Streptococcus mutans was considered the main agent of caries. This review will show its history and metabolism at the molecular level. By understanding its metabolic pathways involved in the development of carious lesions, it can be possible to develop new methods of modulating biofilms in the control of caries, as well as to elucidate the need to continue researching this bacterium. Literature review: Although S. mutans does not constitute a significant proportion in the colonization of the oral microbiota of the sound dentition, its proportion increases when there is continuous acidification of the biofilm, associated with excess carbohydrates in the host diet. This is due to a set of virulence factors, such as adhesion, biofilm formation, acidogenicity, aciduricity, proteases activity, mutacins production and signal transduction pathways. Each of these properties coordinately alters the ecology of the dental biofilm.  Discussion: It is still relevant to understand the metabolism of S. mutans as a model microorganism in carious lesions due to its numerous virulence factors. However, in the context of caries as a dysbiosis, antimicrobial therapeutic strategies, more specifically anti-S.mutans, aiming to eliminate the microorganism, may not be the key to caries control, and the microbiome modulation may become the future of dental clinics. Conclusion: Biofilms associated with caries disease comprise a diverse ecosystem, suggesting a polymicrobial etiology, however, future studies aimed at the prospection, development and interrelationship of S. mutans with other microorganisms and with the human host are still justified in order to unravel the 'homeostasis-dysbiosis' transition.Objetivo: Durante décadas, o Streptococcus mutans foi considerado o principal agente etiológico da doença cárie. Esta revisão apresentará seu histórico e metabolismo a nível molecular. Ao entender as vias metabólicas do S.mutans envolvidas no  desenvolvimento de lesões cariosas, será possível desenvolver novos métodos de modulação de biofilmes no controle da doença cárie e elucidar a necessidade de continuar pesquisando essa bactéria. Revisão de literatura: Embora o S. mutans não constitua uma proporção significativa na colonização da microbiota bucal da dentição hígida, essa proporção aumenta quando há acidificação contínua do biofilme, associada ao excesso de carboidratos na dieta do hospedeiro. Isso ocorre devido a um conjunto de fatores de virulência, tais como, adesão, formação de biofilme, acidogenicidade, aciduricidade, atividades de proteases, produção de mutacinas e vias de transdução de sinal. Cada uma dessas propriedades, coordenadamente, alteram a ecologia do biofilme dental. Discussão: Ainda é relevante entender o metabolismo do S. mutans como microrganismo modelo em lesões cariosas devido a seus inúmeros fatores de virulência. Porém, no contexto da doença cárie como uma disbiose, estratégias terapêuticas antimicrobianas, mais especificamente anti-S.mutans, voltadas para a eliminação do microrganismo, podem não ser a chave do controle da doença cárie, enquanto a modulação do microbioma poderá se tornar o futuro das clínicas odontológicas. Conclusão: Biofilmes associados a doença cárie compreendem um ecossistema diverso, sugerindo uma etiologia polimicrobiana, porém, estudos futuros que visem à prospecção, ao desenvolvimento e à inter-relação do S. mutans com outros microrganismos e com o hospedeiro humano ainda são justificados a fim de desvendar a transição ‘homeostase-disbiose’