Co-infecção entre vírus influenza e bactéria flagelada

Trypsin is required in the hemagglutinin (HA) cleavage to in vitro influenza viruses activation. This HA cleavage is necessary for virus cell entry by receptor-mediated endocytosis. Bacteria in the respiratory tract are potential sources of proteases that could contribute to the cleavage of influenza virus in vivo. From 47 samples collected from horses, pigs, and from humans, influenza presence was confirmed in 13 and these samples demonstrated co-infection of influenza with flagellated bacteria, Stenotrophomonas maltophilia from the beginning of the experiments. Despite treatment with antibiotics, the bacteria remained resistant in several of the co-infected samples (48.39%). These bacteria, considered opportunistic invaders from environmental sources, are associated with viral infections in upper respiratory tract of hosts. The protease (elastase), secreted by Stenotrophomonas maltophilia plays a role in the potentiation of influenza virus infection. Proteolytic activity was detected by casein agar test. Positive samples from animals and humans had either a potentiated influenza infectivity or cytopathic effect (CPE) in MDCK and NCI H292 cells, Stenotrophomonas maltophilia were always present. Virus and bacteria were observed ultrastructurally. These in vitro findings show that microbial proteases could contribute to respiratory complications by host protease activity increasing inflammation or destroying endogenous cell protease inhibitors.Tripsina é necessária na ativação da clivagem do vírus influenza A in vitro. Esta clivagem é importante para entrada do vírus na célula por endocitose mediada pelo receptor celular. Bactérias presentes no trato respiratório são fontes de proteases que podem contribuir na replicação do vírus influenza in vivo. Entre 47 amostras coletadas de cavalos, suínos e humanos, a influenza foi isolada e confirmada em 13 que estavam co-infectadas com bactéria flagelada: Stenotrophomonas maltophilia desde o início destes experimentos. Apesar do tratamento das amostras com antibióticos, as bactérias resistiram em diversas delas (48.39%). A protease (elastase), secretada pela Stenotrophomonas maltophilia, desenvolveu papel decisivo na potencialização da infecção pelo vírus influenza. Essa atividade proteolítica foi detectada pelo teste de ágar-caseína. Amostras positivas para o vírus influenza isolado em animais, bem como em humanos tiveram potencialização da infectividade (ECP) em células MDCK e NCI-H292, sempre que a Stenotrophomonas maltophilia esteve presente. Os referidos microorganismos, bactéria e vírus foram observados ultra-estruturalmente. Esses achados in vitro demonstram como complicações respiratórias podem ocorrer in vivo, através da contribuição de protease microbiana, provocando aumento da inflamação ou destruição dos inibidores celulares de proteases endógenas, nos hospedeiros susceptíveis à influenza

La membrana vitelina de embriones bovinos, un modelo experimental de interés para estudios proteómicos.Análisis del perfil proteico mediante electroforesis bidimensional

Comunicaciones a congreso

EUPHORBIA TIRUCALLI L.: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE EXTRATOS OBTIDOS POR AGITAÇÃO CONTÍNUA OU ULTRASSOM

Extratos de plantas possuem compostos bioativos com múltiplas possibilidades de aplicação na indústria biotecnológica, farmacêutica e alimentícia. Este trabalho avaliou extratos obtidos da espécie Euphorbia tirucalli L. cultivada no litoral do estado do Piauí. Foram quantificados compostos fenólicos totais e avaliadas pelas metodologias do DPPH● e ABTS●+ as atividades antioxidantes presente nos extratos acetônicos ou hidrometanólicos obtidos por agitação contínua ou ultrassom. A viabilidade celular foi morfológica e metabolicamente avaliada em células LLC-MK2 pelo ensaio MTT e a atividade antiparasitária pelo ensaio de infectividade celular por tripomastigotas de Trypanosoma cruzi. Os compostos fenólicos totais variaram de 0,65 a 13,78 mgGAE/g, e diferiram estatisticamente (pacetônico) e diferentes métodos de extração (ultrassom>agitação contínua). As extrações mostraram-se mais eficientes para amostras secas tanto sob agitação contínua (12,48±0,34) como por ultrassom (13,78±0,14). A atividade antioxidante, avaliada por DPPH● e ABTS●+, variou de acordo com os teores dos compostos fenólicos. A concentração inibidora da viabilidade celular variou de 0,2 a 2 mg/mL nos extratos, entretanto, o ácido ferúlico isolado mostrou-se inerte até 2 mg/mL. Não foi observada inibição da infectividade celular pelos extratos e ou pelo ácido ferúlico isolado. Portanto, extratos hidrometanólicos de Euphorbia tirucalli L. preparados com amostras secas, submetidos à ultrassonicação, apresentaram maiores quantidades de compostos fenólicos e uma considerável atividade antioxidante

Effect of cell culture system on the production of human viral antigens Efeito do sistema de cultura celular na produção de antígenos virais humanos

A comparative study was performed in the production of different viral antigens by using microcarrier systems and traditional systems. Vero, BHK and MA 104 cells were cultivated in microcarriers (2mg/ml) using a bioreactor with a working capacity of 3.7 liters, in parallel with conventional Roux bottles. After four days (BHK cells), and seven days of culture (Vero and MA-104 cells), the cells were infected with 0.1 MOI (multiplicity of infection) of rabies virus, measles virus, poliovirus and rotavirus. The yields of the cells and virus in microcarriers and in the conventional system were determined. It was observed that in the microcarrier system, an average increase of twenty-fold more cells/ml was obtained in relation to the conventional monolayer culture, using Roux bottle. On the other hand, cells grown in Roux bottles presented 1.3 to 6.7 more viruses/ml culture than those in the microcarrier systems. However, the overall data showed that yieldings, in terms of viruses per batch, were statistically similar for both systems (p > 0.05). The amount of viral antigen production seems to depend not only on cell concentration, but also on other culture factors such as the characteristic of the cell-growth surface. Thus, the present findings provide a baseline for further improvements and strategies to be established for a scaling-up virus production since depending on the type of virus the optimal conditions found for a small-scale virus production seem unsuitable for large-scale production, requiring new standardization and evaluation.<br>Foi realizado estudo comparativo na produção de diferentes antígenos virais usando sistema de microcarregador e sistema tradicional. Células Vero, BHK e MA-104 foram cultivadas em microcarregadores (2mg/ml) utilizando-se biorreatores com capacidade de 3,7 litros e, em paralelo, no sistema convencional com garrafas Roux. Após quatro dias de cultura para as células BHK e sete dias para as células Vero e MA-104, as células foram infectadas com 0,1 MOI (multiplicidade de infecção) de vírus da raiva, vírus do sarampo, poliovírus e rotavírus. Foi determinado o rendimento das células e dos vírus em microcarregadores e sistema convencional. Foi observado no sistema de microcarregador um aumento médio obtido de vinte vezes mais células/ml em relação à cultura convencional em monocamadas, usando garrafas Roux. Por outro lado, as células que cresceram em garrafas Roux apresentaram 1,6 a 6,7 mais vírus/ml em culturas do que no sistema de microcarregador. Contudo o total das amostras em termos de vírus por grupo foi estatisticamente similar para ambos os sistemas (p > 0,05). O rendimento na produção de antígeno viral pode depender não somente da concentração das células, mas também de outros fatores da cultura, como características do suporte no crescimento. Assim, o estudo deste parâmetro pode proporcionar uma linha de base para um futuro melhoramento e estratégias para se estabelecer um aumento em escala na produção de vírus, já que, dependendo do tipo de vírus, a ótima condição encontrada para uma produção de vírus em pequena escala pode não ser adequada para a produção em grande escala, requerendo novas padronização e avaliação

Parameters for MDBK cell growth on microcarriers and BoHV-1 virus production

Bovine herpes virus 1 (BoHV-1) is an important veterinary agent , which causes infectious bovine rhinotra-cheitis. This disease affects the respiratory tract or genitals, causing weight loss, reduced milk production and abor-tion. Several vaccines against BoHV-1 have been developed. In this paper, we study the parameters for MDBK growth on microcarriers (Cytodex 1) and for BoHV-1 virus production. The cell culture attached to microcarriers is an effi-cient method to enlarge the surface of cell growth and for large-scale cell production. Our studies reveal that MDBK adhered to MCs in 30 minutes and that initial agitation of culture did not influence on the efficiency of adhesion or cell growth. In our experiments, we detected no relevant influence of agitation on initial cell adhesion of MDBK to MCs. The maximum cell yield was similar to all initial conditions of agitation studied. The maximum yield obtained in culture started with 15, 20 and 30 cells / MC, was respectively.8.7 x105, 9.3 x105 and 9.8 x105 cells / ml . The cellular distribution on the MCs at the beginning of the culture was more heterogeneous in higher initial densities. After three medium exchanges during MDBK cell culture, the increase in the final yield was 100% higher than that from culture performed without medium change (0.93 x 106 cells / mL). Replacing 50% of the culture medium with fresh medium after 24 hours of growth, the concentration of glucose (5 mM) and glutamine (1.8 mM) were almost completely res-tored. In these studies, BoHV-1 infections of MDBK were performed after 48, 72 and 86 hours with daily exchanges of 50% of the medium. The increase in viral titer was proportional to the number of viable cells present at the time of infection. The best result of BoHV-1 production was achieved when the infection was performed from 86 hours of cell culture, reaching about 3.7 x108 (TCID50/ml) after 24-48 hours of infection, being on average four times higher when compared to the culture in which the infection was performed with 48 hours of culture and approximately 2 times greater than the crop whose infection occurred after 72 hours of culture. The best yields are obtained when viral infections were performed on cultures with higher cell densities. The best result for the production of BoHV-1 occur-red with 10 MOI, 48 hours after infection, which yield was 24 and 41% superior to the MOI 0.1 and 1, respectively

Performance evaluation of CHO-K1 cell in culture medium supplemented with hemolymph

The aim of this work was to evaluate the potential of hemolymph utilization as a culture medium supplement to cultivate the animal cell CHO-K1. For this purpose 1% v/v of hemolymph was added to DMEM medium containing 10% v/v of FBS and 1 or 4.5 g/L of glucose. The culture was grown in spinner flasks incubated in a 10% v/v CO2 environment, at 37ºC, with the Cytodex 1 microcarrier. Comparing the results obtained from the culture with hemolymph against those without hemolymph, a positive influence of the hemolymph was observed, as the experiment with hemolymph presented a 52% higher cell concentration and a higher productivity of up to 40%.<br>Desenvolvimento de meios de cultura isentos de soro fetal bovino (SFB) é uma das grandes prioridades de pesquisa em desenvolvimento de processos com célula animal. O objetivo do presente trabalho foi realizar uma análise do potencial de uso da hemolinfa como suplemento do meio utilizado no cultivo da célula animal ancorante CHO-K1. Para isso, foi adicionado 1% v/v de extrato de hemolinfa ao meio DMEM contendo 10% v/v de SFB e 1,0 ou 4,5 g/L de glicose. O cultivo foi realizado em frascos tipo spinner em um ambiente de 10% v/v de CO2, a 37ºC, utilizando o microcarregador Cytodex 1. Comparando os resultados obtidos no ensaio com hemolinfa com um sem hemolinfa pode-se notar uma influência positiva da hemolinfa no cultivo, já que o ensaio com hemolinfa apresentou uma concentração máxima de células 52% maior e uma produtividade máxima de até 40% maior