Stability of the H-cluster under whole-cell conditions-formation of an Htrans-like state and its reactivity towards oxygen.

Hydrogenases are metalloenzymes that catalyze the reversible oxidation of molecular hydrogen into protons and electrons. For this purpose, [FeFe]-hydrogenases utilize a hexanuclear iron cofactor, the H-cluster. This biologically unique cofactor provides the enzyme with outstanding catalytic activities, but it is also highly oxygen sensitive. Under in vitro conditions, oxygen stable forms of the H-cluster denoted Htrans and Hinact can be generated via treatment with sulfide under oxidizing conditions. Herein, we show that an Htrans-like species forms spontaneously under intracellular conditions on a time scale of hours, concurrent with the cells ceasing H2 production. Addition of cysteine or sulfide during the maturation promotes the formation of this H-cluster state. Moreover, it is found that formation of the observed Htrans-like species is influenced by both steric factors and proton transfer, underscoring the importance of outer coordination sphere effects on H-cluster reactivity

Nouveaux matériaux d'électrode bioinspirés et biohybrides pour la production de l'hydrogène

Hydrogenase enzymes were first discovered in the 1930s. The first report of {Fe2(μ-S2)(CO)6} based catalyst was reported in 1928 without any information of [FeFe] hydrogenases. The first crystal structure of [FeFe] hydrogenases was reported in 1990s, which triggered the development of bioinspired catalysis based on the {Fe2(μ-S2)(CO)6} core due to its structural similarities with the [2Fe]H cofactor.19,91 Yet, it remains a highly active research field with continued efforts to find the optimum balance between activity, durability, sustainability and cost of the catalysts. This always motivates me to look for a better catalytic system, and also resulted in this thesis. In the eSCALED project, our objective was to develop a noble metal free bioinspired device for H2 production or CO2 reduction using solar electrolysis. I was responsible for developing cathode materials for H2 production. Considering that objective and my personal motivation, my overall doctoral journey is summarised in the following manner.In Paper I, we aimed straight towards an immobilisation strategy for a bioinspired {Fe2(μ-S2)(CO)6} based active sites, as this constitutes a key step for molecular based electrode materials for device applications. The anchoring method we settled for was π-π interactions, utilizing pyrene. We showed an improvement in loading capacity on the electrode as compared to previous reports, and an appreciable electronic communication between electrodes and catalysts. Finally, and importantly, the anchoring group appeared highly stable during catalysis. Still, the activity remained substandard under aqueous condition due to poor interaction with substrate (H+ from buffer) and degradation of the catalyst/active site under catalytic conditions.In Paper II, we aimed at encapsulating the [FeFe] site inside a water-soluble polymeric scaffold, to provide a basic outer coordination sphere along with an anchoring group in a single platform. The strategy met our expectations with regards to improved activity, but decreased the loading of active sites 4-5-fold, compared to the diiron complex deprived of polymer scaffold described in Paper I. Unfortunately, the polymeric scaffold could not protect the active site from degradation. In addition, we performed a life cycle assessment study to further highlight the importance of the metallopolymer strategy from a sustainability perspective.In Paper III, we redesigned our metallopolymer by replacing the active site with what was expected to be a more robust diiron active site. In parallel, the new design could allow to tune and increase the fraction of active sites in the polymer chain. However, we found that the active site still remains the weak link in this assembly. Hence further improvement is still required.On a more positive note, it is noteworthy to mention that we demonstrated through Papers II and III, that the metallopolymer approach is a highly promising for their employment in an energy conversion context. Clearly this could be extended to various energy conversion applications in future.Finally, in Paper IV, we explored a biohybrid system by preparing and characterising semisynthetic hydrogenases. The detailed analysis provides some valuable insight towards the design of bioinspired catalysts for H+/H2 conversion. For example, replacing one CN ligand with a CO ligand in [2Fe]H resulted in a semisynthetic hydrogenase with very different properties i.e. activity, sensitivity towards inhibitors etc., depending on the host protein scaffold.In closing, I think the insights that we learned throughout this thesis work motivates taking inspiration from Nature in the continued search for an ideal catalyst. The metallopolymer approach is promising. Here, the design of active and robust catalytic sites is crucial. Finally, evaluating environmental footprint of the product is essential from a sustainability perspective.Le changement climatique et la crise énergétique qui résulte de l’abandon progressif des ressources fossiles constituent de vrais défis pour l’humanité.Dans ce contexte, l’utilisation de l’hydrogène moléculaire (H2) pourrait être une alternative potentielle aux combustibles fossiles pour déployer un système énergétique sans émission nette. L’hydrogène permet en effet de stocker lors de sa production par électrolyse à partir d’eau une grande quantité d'énergie dans sa liaison chimique. Plus important encore, l'utilisation de l’hydrogène dans une pile à combustible pour produire de l'électricité co-génère de la chaleur et ne produit que de l'eau comme sous-produit. Par conséquent, la production d’hydrogène en utilisant une source d’énergie renouvelable est une technologie très prometteuse et les rapports prospectifs récent prédisent un déploiement massif de ces technologies de production d’«hydrogène vert ».L’électrolyse de l’eau consiste à utiliser de l'électricité pour décomposer l’eau en oxygène (O2) et hydrogène(H2). La nature multi-électronique de cette réaction entraîne une cinétique lente et des catalyseurs sont nécessaires pour pouvoir la réaliser avec un bon rendement énergétique et une forte puissance. Ces catalyseurs doivent être bon marché, actifs, stables et présenter un faible impact environemental.Les enzymes hydrogénases sont des catalyseurs naturels qui réalisent la production d’hydrogène à partir d'eau avec un excellent rendement à des potentiels proches des valeurs thermodynamiques en utilisant des métaux de transition 3d abondants. Ces enzymes sont donc de bons cndidats pour des applications de production biotechnologiques de production d’hydrogène vert. En parallèle, les sites actifs de ces enzymes sont une source d’inspiration pour le développement de catalyseurs synthétiques pour les mêmes applications. Aujourd’hui, ces recherches se structurent autour de trois approches complémentaires :(i) mieux comprendre le fonctionnement des hydrogénases et développer leurs applications.(ii) utiliser cette connaissance pour développer des catalyseurs bio-inspirés plus performants et les faire fonctionner dans des dispositifs expérimentaux de production de H2 par électrolyse de l'eau.(iii) Évaluer l'empreinte environnementale des catalyseurs développés.Ma thèse visait à contribuer aux trois points susmentionnés comme suit :Dans les articles I, II et III, nous nous sommes concentrés sur le développement de catalyseurs bio-inspirés à base de matrices polymères et en les optimisant pour fabriquer des matériaux d'électrode pouvant être intégrés en dispositifs et en évaluant leur empreinte environnementale. Ces 3 articles concernent donc les points (ii) et (iii) décrits précédemment.Dans le chapitre IV, nous avons exploré un système biohybride en préparant et en caractérisant des hydrogénases à fer semi-synthétiques. L'analyse détaillée fournit des informations précieuses pour la conception de catalyseurs bioinspirés pour la conversion H+/H2. Par exemple, le remplacement d'un ligand cyanure par un ligand CO dans le site actif difer a donné lieu à une hydrogénase semi-synthétique présentant des propriétés très différentes (activité, sensibilité aux inhibiteurs, etc.) selon la matrice protéique hôte.Les connaissances acquises tout au long de ce travail de thèse nous incitent à poursuivre cette démarche de bio-inspiration dans la recherche d'un catalyseur idéal. L'approche basée sur l’élaboration de métallo-polymères est prometteuse mais la conception de sites catalytiques actifs et robustes est cruciale. Enfin, l'évaluation de l'empreinte environnementale du produit est essentielle dans une perspective de durabilité

Nouveaux matériaux d'électrode bioinspirés et biohybrides pour la production de l'hydrogène

Hydrogenase enzymes were first discovered in the 1930s. The first report of {Fe2(μ-S2)(CO)6} based catalyst was reported in 1928 without any information of [FeFe] hydrogenases. The first crystal structure of [FeFe] hydrogenases was reported in 1990s, which triggered the development of bioinspired catalysis based on the {Fe2(μ-S2)(CO)6} core due to its structural similarities with the [2Fe]H cofactor.19,91 Yet, it remains a highly active research field with continued efforts to find the optimum balance between activity, durability, sustainability and cost of the catalysts. This always motivates me to look for a better catalytic system, and also resulted in this thesis. In the eSCALED project, our objective was to develop a noble metal free bioinspired device for H2 production or CO2 reduction using solar electrolysis. I was responsible for developing cathode materials for H2 production. Considering that objective and my personal motivation, my overall doctoral journey is summarised in the following manner.In Paper I, we aimed straight towards an immobilisation strategy for a bioinspired {Fe2(μ-S2)(CO)6} based active sites, as this constitutes a key step for molecular based electrode materials for device applications. The anchoring method we settled for was π-π interactions, utilizing pyrene. We showed an improvement in loading capacity on the electrode as compared to previous reports, and an appreciable electronic communication between electrodes and catalysts. Finally, and importantly, the anchoring group appeared highly stable during catalysis. Still, the activity remained substandard under aqueous condition due to poor interaction with substrate (H+ from buffer) and degradation of the catalyst/active site under catalytic conditions.In Paper II, we aimed at encapsulating the [FeFe] site inside a water-soluble polymeric scaffold, to provide a basic outer coordination sphere along with an anchoring group in a single platform. The strategy met our expectations with regards to improved activity, but decreased the loading of active sites 4-5-fold, compared to the diiron complex deprived of polymer scaffold described in Paper I. Unfortunately, the polymeric scaffold could not protect the active site from degradation. In addition, we performed a life cycle assessment study to further highlight the importance of the metallopolymer strategy from a sustainability perspective.In Paper III, we redesigned our metallopolymer by replacing the active site with what was expected to be a more robust diiron active site. In parallel, the new design could allow to tune and increase the fraction of active sites in the polymer chain. However, we found that the active site still remains the weak link in this assembly. Hence further improvement is still required.On a more positive note, it is noteworthy to mention that we demonstrated through Papers II and III, that the metallopolymer approach is a highly promising for their employment in an energy conversion context. Clearly this could be extended to various energy conversion applications in future.Finally, in Paper IV, we explored a biohybrid system by preparing and characterising semisynthetic hydrogenases. The detailed analysis provides some valuable insight towards the design of bioinspired catalysts for H+/H2 conversion. For example, replacing one CN ligand with a CO ligand in [2Fe]H resulted in a semisynthetic hydrogenase with very different properties i.e. activity, sensitivity towards inhibitors etc., depending on the host protein scaffold.In closing, I think the insights that we learned throughout this thesis work motivates taking inspiration from Nature in the continued search for an ideal catalyst. The metallopolymer approach is promising. Here, the design of active and robust catalytic sites is crucial. Finally, evaluating environmental footprint of the product is essential from a sustainability perspective.Le changement climatique et la crise énergétique qui résulte de l’abandon progressif des ressources fossiles constituent de vrais défis pour l’humanité.Dans ce contexte, l’utilisation de l’hydrogène moléculaire (H2) pourrait être une alternative potentielle aux combustibles fossiles pour déployer un système énergétique sans émission nette. L’hydrogène permet en effet de stocker lors de sa production par électrolyse à partir d’eau une grande quantité d'énergie dans sa liaison chimique. Plus important encore, l'utilisation de l’hydrogène dans une pile à combustible pour produire de l'électricité co-génère de la chaleur et ne produit que de l'eau comme sous-produit. Par conséquent, la production d’hydrogène en utilisant une source d’énergie renouvelable est une technologie très prometteuse et les rapports prospectifs récent prédisent un déploiement massif de ces technologies de production d’«hydrogène vert ».L’électrolyse de l’eau consiste à utiliser de l'électricité pour décomposer l’eau en oxygène (O2) et hydrogène(H2). La nature multi-électronique de cette réaction entraîne une cinétique lente et des catalyseurs sont nécessaires pour pouvoir la réaliser avec un bon rendement énergétique et une forte puissance. Ces catalyseurs doivent être bon marché, actifs, stables et présenter un faible impact environemental.Les enzymes hydrogénases sont des catalyseurs naturels qui réalisent la production d’hydrogène à partir d'eau avec un excellent rendement à des potentiels proches des valeurs thermodynamiques en utilisant des métaux de transition 3d abondants. Ces enzymes sont donc de bons cndidats pour des applications de production biotechnologiques de production d’hydrogène vert. En parallèle, les sites actifs de ces enzymes sont une source d’inspiration pour le développement de catalyseurs synthétiques pour les mêmes applications. Aujourd’hui, ces recherches se structurent autour de trois approches complémentaires :(i) mieux comprendre le fonctionnement des hydrogénases et développer leurs applications.(ii) utiliser cette connaissance pour développer des catalyseurs bio-inspirés plus performants et les faire fonctionner dans des dispositifs expérimentaux de production de H2 par électrolyse de l'eau.(iii) Évaluer l'empreinte environnementale des catalyseurs développés.Ma thèse visait à contribuer aux trois points susmentionnés comme suit :Dans les articles I, II et III, nous nous sommes concentrés sur le développement de catalyseurs bio-inspirés à base de matrices polymères et en les optimisant pour fabriquer des matériaux d'électrode pouvant être intégrés en dispositifs et en évaluant leur empreinte environnementale. Ces 3 articles concernent donc les points (ii) et (iii) décrits précédemment.Dans le chapitre IV, nous avons exploré un système biohybride en préparant et en caractérisant des hydrogénases à fer semi-synthétiques. L'analyse détaillée fournit des informations précieuses pour la conception de catalyseurs bioinspirés pour la conversion H+/H2. Par exemple, le remplacement d'un ligand cyanure par un ligand CO dans le site actif difer a donné lieu à une hydrogénase semi-synthétique présentant des propriétés très différentes (activité, sensibilité aux inhibiteurs, etc.) selon la matrice protéique hôte.Les connaissances acquises tout au long de ce travail de thèse nous incitent à poursuivre cette démarche de bio-inspiration dans la recherche d'un catalyseur idéal. L'approche basée sur l’élaboration de métallo-polymères est prometteuse mais la conception de sites catalytiques actifs et robustes est cruciale. Enfin, l'évaluation de l'empreinte environnementale du produit est essentielle dans une perspective de durabilité

Nouveaux matériaux d'électrode bioinspirés et biohybrides pour la production de l'hydrogène

Hydrogenase enzymes were first discovered in the 1930s. The first report of {Fe2(μ-S2)(CO)6} based catalyst was reported in 1928 without any information of [FeFe] hydrogenases. The first crystal structure of [FeFe] hydrogenases was reported in 1990s, which triggered the development of bioinspired catalysis based on the {Fe2(μ-S2)(CO)6} core due to its structural similarities with the [2Fe]H cofactor.19,91 Yet, it remains a highly active research field with continued efforts to find the optimum balance between activity, durability, sustainability and cost of the catalysts. This always motivates me to look for a better catalytic system, and also resulted in this thesis. In the eSCALED project, our objective was to develop a noble metal free bioinspired device for H2 production or CO2 reduction using solar electrolysis. I was responsible for developing cathode materials for H2 production. Considering that objective and my personal motivation, my overall doctoral journey is summarised in the following manner.In Paper I, we aimed straight towards an immobilisation strategy for a bioinspired {Fe2(μ-S2)(CO)6} based active sites, as this constitutes a key step for molecular based electrode materials for device applications. The anchoring method we settled for was π-π interactions, utilizing pyrene. We showed an improvement in loading capacity on the electrode as compared to previous reports, and an appreciable electronic communication between electrodes and catalysts. Finally, and importantly, the anchoring group appeared highly stable during catalysis. Still, the activity remained substandard under aqueous condition due to poor interaction with substrate (H+ from buffer) and degradation of the catalyst/active site under catalytic conditions.In Paper II, we aimed at encapsulating the [FeFe] site inside a water-soluble polymeric scaffold, to provide a basic outer coordination sphere along with an anchoring group in a single platform. The strategy met our expectations with regards to improved activity, but decreased the loading of active sites 4-5-fold, compared to the diiron complex deprived of polymer scaffold described in Paper I. Unfortunately, the polymeric scaffold could not protect the active site from degradation. In addition, we performed a life cycle assessment study to further highlight the importance of the metallopolymer strategy from a sustainability perspective.In Paper III, we redesigned our metallopolymer by replacing the active site with what was expected to be a more robust diiron active site. In parallel, the new design could allow to tune and increase the fraction of active sites in the polymer chain. However, we found that the active site still remains the weak link in this assembly. Hence further improvement is still required.On a more positive note, it is noteworthy to mention that we demonstrated through Papers II and III, that the metallopolymer approach is a highly promising for their employment in an energy conversion context. Clearly this could be extended to various energy conversion applications in future.Finally, in Paper IV, we explored a biohybrid system by preparing and characterising semisynthetic hydrogenases. The detailed analysis provides some valuable insight towards the design of bioinspired catalysts for H+/H2 conversion. For example, replacing one CN ligand with a CO ligand in [2Fe]H resulted in a semisynthetic hydrogenase with very different properties i.e. activity, sensitivity towards inhibitors etc., depending on the host protein scaffold.In closing, I think the insights that we learned throughout this thesis work motivates taking inspiration from Nature in the continued search for an ideal catalyst. The metallopolymer approach is promising. Here, the design of active and robust catalytic sites is crucial. Finally, evaluating environmental footprint of the product is essential from a sustainability perspective.Le changement climatique et la crise énergétique qui résulte de l’abandon progressif des ressources fossiles constituent de vrais défis pour l’humanité.Dans ce contexte, l’utilisation de l’hydrogène moléculaire (H2) pourrait être une alternative potentielle aux combustibles fossiles pour déployer un système énergétique sans émission nette. L’hydrogène permet en effet de stocker lors de sa production par électrolyse à partir d’eau une grande quantité d'énergie dans sa liaison chimique. Plus important encore, l'utilisation de l’hydrogène dans une pile à combustible pour produire de l'électricité co-génère de la chaleur et ne produit que de l'eau comme sous-produit. Par conséquent, la production d’hydrogène en utilisant une source d’énergie renouvelable est une technologie très prometteuse et les rapports prospectifs récent prédisent un déploiement massif de ces technologies de production d’«hydrogène vert ».L’électrolyse de l’eau consiste à utiliser de l'électricité pour décomposer l’eau en oxygène (O2) et hydrogène(H2). La nature multi-électronique de cette réaction entraîne une cinétique lente et des catalyseurs sont nécessaires pour pouvoir la réaliser avec un bon rendement énergétique et une forte puissance. Ces catalyseurs doivent être bon marché, actifs, stables et présenter un faible impact environemental.Les enzymes hydrogénases sont des catalyseurs naturels qui réalisent la production d’hydrogène à partir d'eau avec un excellent rendement à des potentiels proches des valeurs thermodynamiques en utilisant des métaux de transition 3d abondants. Ces enzymes sont donc de bons cndidats pour des applications de production biotechnologiques de production d’hydrogène vert. En parallèle, les sites actifs de ces enzymes sont une source d’inspiration pour le développement de catalyseurs synthétiques pour les mêmes applications. Aujourd’hui, ces recherches se structurent autour de trois approches complémentaires :(i) mieux comprendre le fonctionnement des hydrogénases et développer leurs applications.(ii) utiliser cette connaissance pour développer des catalyseurs bio-inspirés plus performants et les faire fonctionner dans des dispositifs expérimentaux de production de H2 par électrolyse de l'eau.(iii) Évaluer l'empreinte environnementale des catalyseurs développés.Ma thèse visait à contribuer aux trois points susmentionnés comme suit :Dans les articles I, II et III, nous nous sommes concentrés sur le développement de catalyseurs bio-inspirés à base de matrices polymères et en les optimisant pour fabriquer des matériaux d'électrode pouvant être intégrés en dispositifs et en évaluant leur empreinte environnementale. Ces 3 articles concernent donc les points (ii) et (iii) décrits précédemment.Dans le chapitre IV, nous avons exploré un système biohybride en préparant et en caractérisant des hydrogénases à fer semi-synthétiques. L'analyse détaillée fournit des informations précieuses pour la conception de catalyseurs bioinspirés pour la conversion H+/H2. Par exemple, le remplacement d'un ligand cyanure par un ligand CO dans le site actif difer a donné lieu à une hydrogénase semi-synthétique présentant des propriétés très différentes (activité, sensibilité aux inhibiteurs, etc.) selon la matrice protéique hôte.Les connaissances acquises tout au long de ce travail de thèse nous incitent à poursuivre cette démarche de bio-inspiration dans la recherche d'un catalyseur idéal. L'approche basée sur l’élaboration de métallo-polymères est prometteuse mais la conception de sites catalytiques actifs et robustes est cruciale. Enfin, l'évaluation de l'empreinte environnementale du produit est essentielle dans une perspective de durabilité

Novel bioinspired and biohybrid electrode materials for hydrogen production

This thesis was accomplished under the scope of eSCALED project administrated by EU MSCA horizon 2020 program, which aimed to develop a device called “artificial leaf” responsible for generating fuels or liquid chemicals (H2 production or CO2 reduction) using solar electrolysis. My objective was to develop a noble metal free, efficient cathode materials for H2 production for the device which yield this thesis. For developing catalysts, we took inspiration from [FeFe] hydrogenase enzymes on merit of their impressive H+/H2 conversion activity (TOF ~10,000 s-1) with negligible overpotential requirements at neutral pH using earth abundant metals. Subsequently, we choose {Fe2(μ-S2)(CO)6} based active site core and designed it as per requirements.  Firstly, our aim was to develop a robust anchoring strategy to immobilize the {Fe2(μ-S2)(CO)6}based catalyst on electrode. We designed the diiron site with an anchoring group i.e. pyrene to graft it on multiwalled carbon nanotubes (MWNT) using π-π interaction. The resulting catalyst showed moderate electrochemical H2 production activity at neutral pH while immobilized on electrode. Post operando assessment revealed the degradation of active sites while anchoring group remained intact throughout the catalysis. Secondly, to improve the catalysis further, the active site was encapsulated inside a designed water-soluble polymeric scaffold comprising pyrene as an anchoring group. The resulting metallopolymers functionalized MWNT showed about two-fold increase in electrochemical H2 production activity with relatively low overpotential requirements than isolated complex discussed earlier. However, the catalysis was limited by degradation of the active site. In addition, life cycle assessments (LCA) were performed to evaluate the environmental footprint for H2 production by metallopolymers. Thirdly, we aimed to replace the active site inside metallopolymers with a relatively robust diiron site which resulted in a marginal improvement of durability with an expense of about three times lower activity than previous metallopolymers.  Finally, we aimed to study semi-artificial hydrogenases by replacing the native cofactor of the [FeFe] hydrogenase with a synthetic cofactor. Combination of spectroscopy, electrochemistry and site-directed mutagenesis revealed some key insights on structural orientation of active site, activity, sensitivity towards inhibitors like CO, O2 etc., due to changes in structural and electronic properties of the active site

Designing hydrogen production catalyst containing enzyme inspired outer coordination sphere features

by Shikha Khandelwal, Afridi Zamader and Arnab Dutt

Synthesis of bioinspired electrode materials for hydrogen evolution

National audienc

Synthesis of bioinspired electrode materials for hydrogen evolution

International audienc