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    Stoichiometric and Structural Investigations of ciliopathy-related protein complex IFT-A

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    Cilia are evolutionary conserved organelles which protrude from almost every polarized eukaryotic cell. These hair-like organelles are vital for human and animal development and physiology being associated with cell cycle and proliferation. Depending on its molecular structure cilia can be classified in motile and immotile cilia. Immotile cilia, also called primary cilia, are characterized by the lack of a central microtubule doublet and generally serve as sensory organelles. Based on the fact that cilia are present in cells and organs of the human body, malfunction of ciliary proteins and defects in cilia lead to a wide range of human diseases which are summarized under the term: ciliopathies. To understand the underlying mechanisms of ciliopathies, it is crucial to study processes within cilia. So far, no biosynthesis machinery is described within a cilium. To transport proteins from the cytoplasm to the tip of a cilium, which is essential for the ciliary assembly and its maintenance, the bidirectional intraflagellar transport (IFT) is necessary. This transport mechanism is driven by motor proteins and two multiprotein complexes IFT-A and IFT-B. IFT-A, consisting of six known complex components, is involved in retrograde transport of protein cargo from the ciliary tip back to the cell body. As described in previous studies, malfunction of IFT-A proteins leads to an accumulation of IFT-B particles in the ciliary tip which results in shortened and bulged cilia. Additionally, mutations within genes encoding IFT-A proteins are described to cause ciliopathies like Sensenbrenner syndrome which is characterized by ectodermal as well as skeletal anomalies. The presented study aims to investigate stoichiometric and structural properties of IFT-A, which is essential for the molecular function of IFT-A during intraflagellar transport and is assistant to unveil its role in IFT-A-related diseases. As basic prerequisite of this study, Flp-In monoclonal cell lines stably expressing N-terminally Strep-Flag (SF)-tagged baits were generated to circumvent the influence of artificial overexpression on stoichiometry of the protein complex. Three different baits were chosen: IFT122, an integral part of the IFT-A, TULP3 which is described to be associated with the IFT-A and LCA5 which represents an rather labile and transiently bound interaction partner of IFT-A. Using an integral part of the protein complex of interest (Flp-In (N)-SF-IFT122) led to a drastic change in complex composition. Due to the higher affinity of TULP3 to IFT-A compared to LCA5, higher amount of the IFT-A complex could be purified from Flp-In (N)-SF-TULP3 enabling a more robust determination of the stoichiometric and structural investigation. To determine complex stoichiometry performing absolute quantification, the establishment of a targeted mass spectrometry approach is crucial. Depending on the applied mass spectrometer, two different approaches were set up: Selected Reaction Monitoring (SRM) and Parallel Reaction Monitoring (PRM). Another important step for the absolute quantification is the generation of a standard mix containing known amounts of representative peptides for the proteins of interest. To create an economic equimolar standard mix, the already described “Equimolarity through Equalizer Peptide” (EtEP) method was used. At the end, absolute quantification performing PRM on a Q-Exactive mass spectrometer in combination with an equimolar standard mixture was used to study complex stoichiometry of IFT-A. Data analysis was performed using the software Skyline. This study unveiled naturally occurring compositions of IFT-A which change during different stages of ciliogenesis and cilia disassembly. To investigate the impact of disease causing variants on the composition of IFT-A, CRISPR/Cas9 system was used to generate targeted mutations within genes encoding two IFT-A proteins (IFT43 and WDR35) in Flp-In (N)-SF-TULP3 cells. One of the generated monoclonal cell lines, carrying a mutation in the gene encoding IFT43 (c.541_542insA/p.T181Nfs*2), showed significant changes within IFT-A complex composition that could explain the malfunction. The second part of this study aims to determine binding sites within IFT-A by chemical crosslinking in combination with mass spectrometry that serve as basis for structural models of IFT-A. For chemical crosslinking of purified IFT-A, the homobifunctional amine-reactive crosslinker dissuccinimidyl suberate (DSS) was used. This crosslinker contains two identical N-hydroxysuccinimidyl groups which enable the formation of stable amide bonds with primary amines of N-termini and lysine residues of proteins. Based on a defined spacer length of DSS (11Å), distance information of cross-linked peptides can be achieved. To enrich low abundant cross-linked peptides before LC-MS/MS analysis, size exclusion chromatography (SEC) is a common used prefractionation method. However, SEC is time-, labour- and cost-intense. A facilitated method to reduce sample complexity prior to the analysis of cross-linked peptides is portrayed in this study. This economic method is based on preseparation using 3kDa CutOff spin columns. For the identification of linked peptides the computational software pipeline xQuest/xProphet was used. To illustrate identified links, free available software Xinet was used afterwards. Identified crosslinks as well as cross-linked positions within a protein sequence using both preseparation methods were comparable. Applying chemical crosslinking to purified IFT-A, well-known interaction domains within the complex components were confirmed. Furthermore, new crosslinking hotspots which are not described so far were identified in this study. With the data obtained in this study, the foundation of a structural model of the IFT-A can be generated by combining the determined complex stoichiometry with obtained structural information of the protein complex IFT-A.Zilien sind evolutionĂ€r konservierte ZellfortsĂ€tze, die auf fast allen polarisierten, eukaryotischen Zellen vorhanden sind. Diese sogenannten „Antennen der Zelle“ sind unverzichtbar fĂŒr die Entwicklung von Mensch und Tier, da sie zum einen wichtig fĂŒr die Zellfortbewegung sind aber auch Signale aus der Umwelt aufnehmen können. Basierend auf ihrer molekularen Struktur können Zilien in zwei Subtypen eingeteilt werden: bewegliche und unbewegliche Zilien. WĂ€hrend bewegliche Zilien ein zentrales Mikrotubuli-Dublett besitzen, fehlt dieses in unbeweglichen Zilien, die auch primĂ€re Zilien genannt werden. Diese primĂ€ren Zilien dienen in der Regel als Mechano- und Chemosensoren. Aufgrund des Vorkommens von Zilien im gesamten menschlichen Körper fĂŒhren defekte Zilien und Fehlfunktionen in involvierten Proteinen zu unterschiedlichsten Krankheitsbildern wie z.B. zystische Nieren und Netzhautdegeneration. Diese Krankheiten sind unter dem Begriff Ziliopathien zusammengefasst. Um den Mechanismus, der Ziliopathien zu Grunde liegt zu verstehen, mĂŒssen die Prozesse innerhalb eines Ziliums untersucht werden. Bisher wurde keine Struktur innerhalb eines Ziliums beschrieben, welche Proteine und andere BiomolekĂŒle, die fĂŒr die Herstellung und Instandhaltung von Zilien notwendig sind, bereitstellt. Allerdings ist der Intraflagellare Transportmechanismus (IFT) bekannt, der mit Hilfe von Motorproteinen und den zwei Proteinkomplexen IFT-A und IFT-B essentielle Proteine von dem Zytoplasma in die Spitze des Ziliums und wieder zurĂŒck transportiert. IFT-A besteht aus sechs Komponenten und ist fĂŒr den retrograden Transport (vom Zilium zurĂŒck zur Zelle) wichtig. Vorangegangene Studien beschreiben eine Akkumulation von IFT-B Partikeln in der Spitze des Ziliums aufgrund eines Defektes in dem IFT-A Komplex. Dies fĂŒhrt zu verkĂŒrzten und gewölbten Zilien, welche zum Beispiel zu Deformationen im Skelett fĂŒhren können. Solche Anomalien sind in unterschiedlichen Ziliopathien beschrieben, wie z.B. Sensenbrenner Syndrom. Um den Einfluss von IFT-A auf Ziliopathien zu untersuchen, soll in dieser Studie die Stöchiometrie des Proteinkomplexes in der natĂŒrlich vorkommenden Zusammensetzung als auch die Struktur von IFT-A untersucht werden. Grundlegend fĂŒr diese Arbeit war die Generierung von stabilen Flp-In Zelllinien, um keinen Einfluss auf die natĂŒrlich vorkommende Zusammensetzung von IFT-A durch artifizielle Überexpression zu nehmen. FĂŒr die Generierung wurden drei Ankerproteine, sogenannte Baits ausgewĂ€hlt, die in unterschiedlicher Weise mit IFT-A in Zusammenhang stehen: IFT122 ist ein Teil des IFT-A Komplexes, ein assoziiertes Protein TULP3 und LCA5, welches ein labiler und transienter Interaktionspartner von IFT-A ist. Der Einsatz eines internen Proteins als Bait (wie z.B. IFT122) fĂŒhrt zu einer deutlichen VerĂ€nderung der Komplexzusammensetzung. Im Vergleich zu LCA5 besitzt TULP3 eine höhere AffinitĂ€t zum IFT-A Komplex. Dies fĂŒhrt zu einer grĂ¶ĂŸeren Menge an aufgereinigtem IFT-A bei der Verwendung von Flp-In (N)-SF-TULP3, weswegen diese monoclonalen Zellen fĂŒr die folgenden Experimente verwendet wurden. Um die Stöchiometrie eines Proteinkomplexes zu bestimmen, ist eine absolute Quantifizierung der einzelnen Komponenten des Proteinkomplexes notwendig. FĂŒr die absolute Quantifizierung mittels Massenspektrometrie wurden zwei unterschiedliche Methoden verwendet: Selected Reaction Monitoring (SRM) und Parallel Reaction Monitoring (PRM). Ein weiterer wichtiger Punkt fĂŒr eine Absolute Quantifizierung ist die Auswahl von geeigneten und reprĂ€sentativen Standardpeptiden. Um einen kostengĂŒnstigen Standardmix mit equimolaren Mengen der ausgewĂ€hlten, proteotypischen Peptide zu generieren wurde die Equimolarity through Equalizer Peptide (EtEP) Methode genutzt. FĂŒr die Bestimmung der Zusammensetzung von IFT-A wurde PRM auf einem QExactive Plus Massenspektrometer in Kombination mit einem equimolaren Standardmix zur Methode der Wahl. Die Datenanalyse erfolgte mit der freiverfĂŒgbaren Software Skyline. Diese Studie ermittelte die Stöchiometrie von natĂŒrlich vorkommendem IFT-A, welche wĂ€hrend des Auf- und Abbau eines Ziliums variiert. ZusĂ€tzlich wurden durch CRISPR/Cas9 ausgewĂ€hlte IFT-A Proteine (IFT43 und WDR35) in Flp-In (N)-SF-TULP3 Zellen gezielt mutiert, um die Auswirkung von krankheitsassoziierten Mutationen auf die Stöchiometrie des IFT-A zu beschrieben. Der zweite Teil dieser Arbeit beschĂ€ftigt sich mit der Identifizierung von Bindestellen innerhalb des IFT-A mittels chemischen Crosslinking. Die Kombination von chemischem Crosslinking mit Massenspektrometrie legt den Grundstein zur StrukturaufklĂ€rung und Generierung eines Strukturmodels von IFT-A. Aufgereinigtes IFT-A wurde mit dem homobifunktionalem Crosslinker Disuccinimidylsuberat (DSS) inkubiert, um primĂ€re Amine in N-Termini als auch in Lysinen innerhalb der Proteinsequenzen zu vernetzen. DafĂŒr ist die Amin-ReaktivitĂ€t der verwendeten N-hydroxysuccinimidyl-Gruppen verantwortlich. Durch die definierte LĂ€nge des eingesetzten Crosslinkers (11Å) können NachbarschaftverhĂ€ltnisse ĂŒber vernetzte Peptide identifiziert werden. FĂŒr die Identifizierung der vernetzen Peptide mittels Massenspektrometrie ist eine vorangehende Anreicherung dieser Peptide notwendig. Size exclusion chromatography (SEC) ist in diesem Zusammenhang eine gern genutzte Methode, die allerdings sehr kostenintensiv, zeit- und arbeitsaufwendig ist. Deswegen ist in dieser Arbeit eine vereinfachte Methode zur Reduktion der ProbenkomplexitĂ€t mittels 3kDa CutOff spin columns parallel zur SEC verwendet worden und beschrieben. FĂŒr die Identifizierung der vernetzen Peptide wurde die Software-Pipeline xQuest/xProphet verwendet. Die anschließende Visualisierung der Daten wurde mittels Xinet durchgefĂŒhrt. Beide Anreicherungsmethoden erzielten vergleichbare Ergebnisse in der Art und der Positionen der identifizierten Crosslinks. ZusĂ€tzlich haben beide Methoden bisher beschriebene Interaktions-DomĂ€nen bestĂ€tigt als auch neue, bisher unbeschriebene Crosslink-Hotspots identifiziert. Mit Hilfe dieser Studie konnten sowohl bekannte InteraktionsdomĂ€nen innerhalb des IFT-A verifiziert, als auch neue unbekannte Bindestellen identifiziert werden. In Kombination mit der ermittelten Stöchiometrie des IFT-A legt diese Arbeit den Grundstein zur Generierung eines Strukturmodels dieses Proteinkomplexes, welches fĂŒr die AufklĂ€rung des Einflusses von IFT-A in Ziliopathien unabdingbar ist

    An organelle-specific protein landscape identifies novel diseases and molecular mechanisms

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    Contains fulltext : 158967.pdf (publisher's version ) (Open Access)Cellular organelles provide opportunities to relate biological mechanisms to disease. Here we use affinity proteomics, genetics and cell biology to interrogate cilia: poorly understood organelles, where defects cause genetic diseases. Two hundred and seventeen tagged human ciliary proteins create a final landscape of 1,319 proteins, 4,905 interactions and 52 complexes. Reverse tagging, repetition of purifications and statistical analyses, produce a high-resolution network that reveals organelle-specific interactions and complexes not apparent in larger studies, and links vesicle transport, the cytoskeleton, signalling and ubiquitination to ciliary signalling and proteostasis. We observe sub-complexes in exocyst and intraflagellar transport complexes, which we validate biochemically, and by probing structurally predicted, disruptive, genetic variants from ciliary disease patients. The landscape suggests other genetic diseases could be ciliary including 3M syndrome. We show that 3M genes are involved in ciliogenesis, and that patient fibroblasts lack cilia. Overall, this organelle-specific targeting strategy shows considerable promise for Systems Medicine

    CiliaCarta: An integrated and validated compendium of ciliary genes

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    The cilium is an essential organelle at the surface of most mammalian cells whose dysfunction causes a wide range of genetic diseases collectively called ciliopathies. The current rate at which new ciliopathy genes are identified suggests that many ciliary components remain undiscovered. We generated and rigorously analyzed genomic, proteomic, transcriptomic and evolutionary data and systematically integrated these using Bayesian statistics into a predictive score for ciliary function. This resulted in 285 candidate ciliary genes. We found experimental evidence of ciliary associations for 24 out of 36 analyzed candidate proteins. In addition, we show that OSCP1, which has previously been implicated in two distinct non-ciliary functions, causes a cilium dysfunction phenotype when depleted in zebrafish. The candidate list forms the basis of CiliaCarta, a comprehensive ciliary compendium covering 836 genes. The resource can be used to objectively prioritize candidate genes in whole exome or genome sequencing of ciliopathy patients and can be accessed at http://bioinformatics.bio.uu.nl/john/syscilia/ciliacarta/

    CiliaCarta: an integrated and validated compendium of ciliary genes

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    The cilium is an essential organelle at the surface of mammalian cells whose dysfunction causes a wide range of genetic diseases collectively called ciliopathies. The current rate at which new ciliopathy genes are identified suggests that many ciliary components remain undiscovered. We generated and rigorously analyzed genomic, proteomic, transcriptomic and evolutionary data and systematically integrated these using Bayesian statistics into a predictive score for ciliary function. This resulted in 285 candidate ciliary genes. We generated independent experimental evidence of ciliary associations for 24 out of 36 analyzed candidate proteins using multiple cell and animal model systems (mouse, zebrafish and nematode) and techniques. For example, we show that OSCP1, which has previously been implicated in two distinct non-ciliary processes, causes ciliogenic and ciliopathy-associated tissue phenotypes when depleted in zebrafish. The candidate list forms the basis of CiliaCarta, a comprehensive ciliary compendium covering 956 genes. The resource can be used to objectively prioritize candidate genes in whole exome or genome sequencing of ciliopathy patients and can be accessed at http://bioinformatics.bio.uu.nl/john/syscilia/ciliacarta/
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