Approche de thérapie cellulaire de la Myasthénie utilisant les cellules souches mésenchymateuses conditionnées

Myasthenia gravis (MG) is a rare autoimmune disease mediated by pathogenic antibodies targeting neuromuscular endplate molecules, mainly the acetylcholine receptor, and characterized by immune deregulation and chronic cell activation. The impaired neuromuscular transmission leads to muscular weakness and invalidating fatigability, and MG crisis can be life-threatening. The treatments are associated with serious side effects, mandating the research of innovative therapeutic solutions. Mesenchymal Stem Cells (MSC) are multipotent progenitor cells possessing broad immunoregulatory capacities, and acting via cell-cell contacts, exosomes production and secretion of soluble mediators. To boost their immunosuppressive capacities, MSCs can be licensed by high doses of pro-inflammatory cytokines such as interferon-γ (IFN-γ), which however may impact MSC fitness and immunogenicity. Our team developed an alternative approach, in which MSC are cocultured with peripheral blood mononuclear cells (PBMC), thus becoming conditioned MSC. The transfer of research grade (RG) cMSC improved the clinical outcomes in a humanized MG mouse model. In a clinical perspective, RG MSC were first replaced by clinical grade MSC, and ideally, the use of PBMC should be replaced by a molecular cocktail. Here, we characterized thoroughly gene expression, phenotypic profile, and secretome changes induced by PBMC conditioning (cMSC), when compared to non-stimulated (rMSC) and IFN-γ stimulated (γMSC) cells. We studied the functional capacities of these cells in vitro and in vivo. Additionally, we identified molecules produced during cell coculture that may be responsible of MSC conditioning. RNAseq study showed that compared to rMSC gene expression profile, conditioning by PBMC deregulated the expression of 244 genes. Compared to rMSC and γMSC, the signature of cMSC included upregulation of CD26, CD273, CCL11, TNIP1 and TNIP3, and downregulation of CILP and LGALS1. γMSC deregulated 2089 genes, harboring a classical signature consisting in up-regulation of IDO-1, TGF-b1, CXCL9, CXCL10, HLA and HLA-associated molecules. Main pathways related to cMSC were extracellular matrix remodeling, signaling by interleukins and immunosuppression, while IFN-γ response, JAK-STAT signaling and inflammatory response were associated with MSC. Gene signatures for each treatment where confirmed by qPCR. cMSC and γMSC also presented phenotypic differences when compared to rMSC. Signatures of cMSC included increased CD54, CD273 and CD49a expression, without HLA modulation. At variance, IFN-γ activation increased expression of CD317, CD54 and HLA molecules. General phenotypic profile studied by mass cytometry revealed 10 different metaclusters; rMSC and cMSC had close profiles, sharing most of the metaclusters except for one that was characterized by a strong immunomodulatory imprint. γMSC showed a completely different phenotypic profile. Regarding functional capacities, in vitro, conditioned medium (CM) produced by cMSC had higher immunosuppressive capacities on T cell proliferation and induced higher percentage of Tregs when compared to rMSC and γMSC CM. The analysis of cMSC secretome revealed 44 molecules that were significantly upregulated by cellular conditioning. In our NSG-MG mouse model, cMSC reduced significantly the clinical score of mice when compared to untreated ones, 2 weeks after injection till end-point of the experiment. Finally, proteomic analysis of soluble factors secreted by PBMC alone, MSC alone and both cells in coculture allowed the identification of 22 molecules that are potentially implicated in cellular conditioning. These results provide clues for defining the mechanisms of action of conditioning by PBMC, and suggest the use of cMSC or their CM to operate immunomodulation in the context of MG, or other auto-immune diseases.Inflammatoires telles que l'interféron-γ (IFN-γ), qui peuvent altérer la physiologie et l'immunogénicité cellulaires. Notre équipe a développé une approche alternative consistant à co-cultiver les CSM avec des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), et a montré que l’injection de cellules conditionnées de qualité recherche induit des améliorations cliniques dans un modèle murin humanisé (NSG-MG).Ici, dans une perspective clinique, nous avons d’abord validé l’utilisation de CSM de qualité clinique. Puis nous avons caractérisé l'expression génique et le profil phénotypique en comparant cellules non stimulées (CSMr), conditionnées (CSMc) ou stimulées par l’IFN-γ (CSMγ), et déduit leurs signatures spécifiques. Nous avons étudié leurs capacités fonctionnelles in vitro et in vivo, et identifié, dans leurs sécrétomes, des molécules potentiellement responsables du conditionnement et de l’immunomodulation. L'étude RNAseq a montré que les conditionnements par PBMC et IFN-γ dérégulaient l'expression de 244 gènes et 2089 gènes, respectivement, par rapport au profil des CSMr. Les CSMc surexprimaient CD26, CD273, CCL11, TNIP1 et TNIP3, et sous-exprimaient CILP et LGALS1. Les CSMγ surexprimaient IDO-1, TGF-β1, CXCL9, CXCL10, et des molécules d’HLA ou associées, comme attendu. Les principales voies de signalisation liées au CSMc comprenaient le remodelage de la matrice extracellulaire, la signalisation par des interleukines et l'immunosuppression, tandis que les voies de la réponse IFN-γ, la signalisation JAK-STAT et la réponse inflammatoire étaient associées aux CSMγ. Les signatures génétiques pour chaque traitement ont été validées par qPCR. Des différences phénotypiques ont été observées entre CSMc, CSMγ et CSMr. La signature de CSMc incluait une augmentation de CD54, CD273 et CD49a, sans modulation des HLA. Au contraire, l'expression de CD317, CD54 et HLA était augmentée en CSMγ. Les profils de regroupements étudiés par cytométrie de masse ont révélé 10 métaclusters. Les CSMr et les CSMc avaient des profils proches, à l'exception d'un cluster caractérisé par une forte empreinte immunomodulatrice, tandis que les CSMγ ont montré un profil complètement différent. Sur le plan fonctionnel le milieu conditionné (MC) des CSMc avait des capacités immunosuppressives in vitro plus puissantes sur la prolifération des cellules T que le MC des CSMr et CSMγ, et augmentait plus efficacement le pourcentage de Tregs. In vivo, les CSMc ont réduit de manière significative le score clinique des souris NSG-MG par rapport aux souris non traitées, dès la deuxième semaine post-injection. Enfin, l'analyse protéomique des MC produits par les PBMC seules, les CSMr seules et leurs cocultures a identifié 22 molécules potentiellement impliquées dans le conditionnement cellulaire, tandis que l’analyse du MC produit par les CSMc a identifié 44 molécules potentiellement impliquées dans l’immunomodulation. Ces résultats permettent de proposer des mécanismes d'action du conditionnement par les PBMC, et suggèrent l'utilisation des CSMc ou de leur MC pour réaliser une immunomodulation dans le cadre de la MG ou d'autres maladies auto-immunes

Aplicación y manejo de nuevas tecnologías aplicadas al campo de la investigación en áreas relacionadas a la Bioquímica

Producción de cepas genéticamente modificadas de Saccharomyces cerevisiae.CONACYT – Consejo Nacional de Ciencia y TecnologíaPROCIENCI

Approche de thérapie cellulaire de la Myasthénie utilisant les cellules souches mésenchymateuses conditionnées

Inflammatoires telles que l'interféron-γ (IFN-γ), qui peuvent altérer la physiologie et l'immunogénicité cellulaires. Notre équipe a développé une approche alternative consistant à co-cultiver les CSM avec des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), et a montré que l’injection de cellules conditionnées de qualité recherche induit des améliorations cliniques dans un modèle murin humanisé (NSG-MG).Ici, dans une perspective clinique, nous avons d’abord validé l’utilisation de CSM de qualité clinique. Puis nous avons caractérisé l'expression génique et le profil phénotypique en comparant cellules non stimulées (CSMr), conditionnées (CSMc) ou stimulées par l’IFN-γ (CSMγ), et déduit leurs signatures spécifiques. Nous avons étudié leurs capacités fonctionnelles in vitro et in vivo, et identifié, dans leurs sécrétomes, des molécules potentiellement responsables du conditionnement et de l’immunomodulation. L'étude RNAseq a montré que les conditionnements par PBMC et IFN-γ dérégulaient l'expression de 244 gènes et 2089 gènes, respectivement, par rapport au profil des CSMr. Les CSMc surexprimaient CD26, CD273, CCL11, TNIP1 et TNIP3, et sous-exprimaient CILP et LGALS1. Les CSMγ surexprimaient IDO-1, TGF-β1, CXCL9, CXCL10, et des molécules d’HLA ou associées, comme attendu. Les principales voies de signalisation liées au CSMc comprenaient le remodelage de la matrice extracellulaire, la signalisation par des interleukines et l'immunosuppression, tandis que les voies de la réponse IFN-γ, la signalisation JAK-STAT et la réponse inflammatoire étaient associées aux CSMγ. Les signatures génétiques pour chaque traitement ont été validées par qPCR. Des différences phénotypiques ont été observées entre CSMc, CSMγ et CSMr. La signature de CSMc incluait une augmentation de CD54, CD273 et CD49a, sans modulation des HLA. Au contraire, l'expression de CD317, CD54 et HLA était augmentée en CSMγ. Les profils de regroupements étudiés par cytométrie de masse ont révélé 10 métaclusters. Les CSMr et les CSMc avaient des profils proches, à l'exception d'un cluster caractérisé par une forte empreinte immunomodulatrice, tandis que les CSMγ ont montré un profil complètement différent. Sur le plan fonctionnel le milieu conditionné (MC) des CSMc avait des capacités immunosuppressives in vitro plus puissantes sur la prolifération des cellules T que le MC des CSMr et CSMγ, et augmentait plus efficacement le pourcentage de Tregs. In vivo, les CSMc ont réduit de manière significative le score clinique des souris NSG-MG par rapport aux souris non traitées, dès la deuxième semaine post-injection. Enfin, l'analyse protéomique des MC produits par les PBMC seules, les CSMr seules et leurs cocultures a identifié 22 molécules potentiellement impliquées dans le conditionnement cellulaire, tandis que l’analyse du MC produit par les CSMc a identifié 44 molécules potentiellement impliquées dans l’immunomodulation. Ces résultats permettent de proposer des mécanismes d'action du conditionnement par les PBMC, et suggèrent l'utilisation des CSMc ou de leur MC pour réaliser une immunomodulation dans le cadre de la MG ou d'autres maladies auto-immunes.Myasthenia gravis (MG) is a rare autoimmune disease mediated by pathogenic antibodies targeting neuromuscular endplate molecules, mainly the acetylcholine receptor, and characterized by immune deregulation and chronic cell activation. The impaired neuromuscular transmission leads to muscular weakness and invalidating fatigability, and MG crisis can be life-threatening. The treatments are associated with serious side effects, mandating the research of innovative therapeutic solutions. Mesenchymal Stem Cells (MSC) are multipotent progenitor cells possessing broad immunoregulatory capacities, and acting via cell-cell contacts, exosomes production and secretion of soluble mediators. To boost their immunosuppressive capacities, MSCs can be licensed by high doses of pro-inflammatory cytokines such as interferon-γ (IFN-γ), which however may impact MSC fitness and immunogenicity. Our team developed an alternative approach, in which MSC are cocultured with peripheral blood mononuclear cells (PBMC), thus becoming conditioned MSC. The transfer of research grade (RG) cMSC improved the clinical outcomes in a humanized MG mouse model. In a clinical perspective, RG MSC were first replaced by clinical grade MSC, and ideally, the use of PBMC should be replaced by a molecular cocktail. Here, we characterized thoroughly gene expression, phenotypic profile, and secretome changes induced by PBMC conditioning (cMSC), when compared to non-stimulated (rMSC) and IFN-γ stimulated (γMSC) cells. We studied the functional capacities of these cells in vitro and in vivo. Additionally, we identified molecules produced during cell coculture that may be responsible of MSC conditioning. RNAseq study showed that compared to rMSC gene expression profile, conditioning by PBMC deregulated the expression of 244 genes. Compared to rMSC and γMSC, the signature of cMSC included upregulation of CD26, CD273, CCL11, TNIP1 and TNIP3, and downregulation of CILP and LGALS1. γMSC deregulated 2089 genes, harboring a classical signature consisting in up-regulation of IDO-1, TGF-b1, CXCL9, CXCL10, HLA and HLA-associated molecules. Main pathways related to cMSC were extracellular matrix remodeling, signaling by interleukins and immunosuppression, while IFN-γ response, JAK-STAT signaling and inflammatory response were associated with MSC. Gene signatures for each treatment where confirmed by qPCR. cMSC and γMSC also presented phenotypic differences when compared to rMSC. Signatures of cMSC included increased CD54, CD273 and CD49a expression, without HLA modulation. At variance, IFN-γ activation increased expression of CD317, CD54 and HLA molecules. General phenotypic profile studied by mass cytometry revealed 10 different metaclusters; rMSC and cMSC had close profiles, sharing most of the metaclusters except for one that was characterized by a strong immunomodulatory imprint. γMSC showed a completely different phenotypic profile. Regarding functional capacities, in vitro, conditioned medium (CM) produced by cMSC had higher immunosuppressive capacities on T cell proliferation and induced higher percentage of Tregs when compared to rMSC and γMSC CM. The analysis of cMSC secretome revealed 44 molecules that were significantly upregulated by cellular conditioning. In our NSG-MG mouse model, cMSC reduced significantly the clinical score of mice when compared to untreated ones, 2 weeks after injection till end-point of the experiment. Finally, proteomic analysis of soluble factors secreted by PBMC alone, MSC alone and both cells in coculture allowed the identification of 22 molecules that are potentially implicated in cellular conditioning. These results provide clues for defining the mechanisms of action of conditioning by PBMC, and suggest the use of cMSC or their CM to operate immunomodulation in the context of MG, or other auto-immune diseases

Les cellules CAR-T. Des nouvelles armes dans la lutte contre la fibrose musculaire ?

La reprogrammation de cellules T en CART cells peut être réalisée in vivo, et permet la destruction sélective de cellules responsables de la fibrose dans un modèle d'insuffisance cardiaque chez la souris

Les cellules CAR-T. Des nouvelles armes dans la lutte contre la fibrose musculaire ?

La reprogrammation de cellules T en CART cells peut être réalisée in vivo, et permet la destruction sélective de cellules responsables de la fibrose dans un modèle d'insuffisance cardiaque chez la souris

Évidence préclinique de l’effet thérapeutique de l’efgartigimod dans un modèle de myasthénie anti-MuSK

International audienceL’injection d’efgartigimod dans un modèle murin expérimental de myasthénie (anti-MuSK) permet une réduction importante du taux d’autoanticorps circulants avec comme corollaire une amélioration des signes cliniques et une augmentation des per formances physiques chez les souris traitées par rap port aux souris non-traitées [1].La Myasthenia Gravis (myasthénie, MG) est une maladie neuromusculaire auto-immune liée à une réaction immunitaire aberrante dirigée contre des constituants de la jonction neuromusculaire. Cette attaque est médiée par des auto-anticorps (Ac) ciblant des récepteurs post-synaptiques : le récepteur de l’acé- tylcholine (AchR) en premier lieu, le récepteur tyro- sine-kinase spécifique du muscle (MuSK), la lipopro tein-related protein 4 (LRP4), ou l’agrine. Ce processus diminue l’efficacité de la dépolarisation mus culaire, ce qui se traduit par une faiblesse musculaire fluctuante et une fatigabilité. Les patients atteints de MG avec Ac anti-MuSK (appelée aussi MuSK-MG, soit environ 5% des cas de MG) présentent souvent des signes respiratoires. La sévérité de la maladie est d’ail leurs liée au taux d’Ac circulants. Un modèle animal de MuSK-MG a pu être obtenu par transfert passif des Ac de patients à des souris immunodéficientes, une MG se développant chez elles en quelques jours.La diminution du titre des Ac circulants pathogènes est l’une des stratégies thérapeutiques mises au point dans la MG. Les séances de plasmaphérèse lors d’une poussée de la maladie (crise myasthé- nique) permettent de l’obtenir. Une autre approche innovante, cette fois-ci sous la forme d’une immu nothérapie vise à augmenter le catabolisme naturel de ces Ac. Ainsi, le récepteur néonatal Fc (FcRn) régule le catabolisme des immunoglobulines de type G (IgG) en diminuant leur dégradation lysosomale. L’utilisation d’antagonistes de ce FcRn empêche le recyclage des IgGs et favorise leur dégradation. Dans le contexte de la MG, ceci favoriserait la clai rance des IgG pathogènes et réduirait leur effet délé tère au niveau clinique. L’efgartigimod (ou ARGX- 113) est le fragment Fc d’un anticorps monoclonal de type IgG1 humain amputé du domaine variable (Fab). Ce fragment Fc a été modifié pour assurer une liaison de forte affinité aux FcRn, en particulier dans un environnement lysosomal acide.Dans cette étude, les souris ont reçu des Ac de patients Musk-MG d’abord quotidiennement, puis une combinaison d’Ac et d’efgartigimod versus pla cebo, pendant les onze jours suivants. Alors que les souris non traitées ou traitées par placebo ont vu leur état clinique se dégrader, les souris traitées par efgartigimod ont montré des signes d’amélioration. Sur le plan humoral, une réduction d’environ 80% du taux d’Ac humain anti-MuSK circulants a été observée. Sur le plan général, l’efgartigimod empêche la perte progressive de poids habituelle ment observée chez les souris malades. Au niveau fonctionnel, l’efgartigimod évite la perte de force détectée aux tests d’agrippement. Il réduit aussi la perte de force musculaire et la fatigabilité. En élec trophysiologie, on observe un décrément moindre lors de la stimulation nerveuse répétitive. En revanche, aucune différence n’a été notée entre les deux groupes concernant les aspects ultrastructu- raux de la jonction neuromusculaire. Ces résultats soulignent le potentiel thérapeutique intéressant de cette nouvelle molécule dans cette forme spécifique de M

Les exosomes, des messagers intercellulaires naturels aux mécanismes polyvalents pour le traitement des myopathies?

International audienceDans la souris mdx, l’injection d’exosomes permet d’améliorer les phénotypes pathologiques musculaires, cardiaques et squelettiques, et ce grâce à plusieurs mécanismes non exclusifs. Les exosomes, qui font partie des vésicules extracellulaires, mesurent une centaine de nanomètres et sont produits par de très nombreux types cellulaires. Leurs marqueurs de surface et leurs contenus sont variables en fonction des cellules productrices et des conditions environnementales. Libérés par exocytose, les exosomes sont ensuite internalisés par endocytose ou fusion membranaire. Ils présentent une action pléiotropique et jouent un rôle primordial de messagers intercellulaires en conditions normales et pathologiques. Dans la souris mdx, l’absence de dystrophine entraîne une perte de l’intégrité membranaire, un déséquilibre de l’homéostasie, une dégénérescence progressive et une inflammation musculaire, le tout se traduisant par une baisse de force, une fatigabilité, et le développement d’une insuffisance cardiaque.Dans une première étude [1], l’injection intrapéritonéale d’exosomes produits à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines et murines, de cellules dendritiques immortalisées murines, de myotubes murins, ou d’extraits de sérum murin, permet de limiter l’afflux de calcium intracellulaire, de diminuer l’activation de protéases, et de stabiliser les complexes existants de protéines associées à la dystrophine (sarcoglycans, dystroglycans). En restaurant partiellement la myo-architecture et l’intégrité membranaire des cellules musculaires squelettiques des souris mdx, les exosomes bloquent l’influx de marqueurs exogènes (tel le colorant bleu Evans) et la fuite de protéines endogènes (comme les CPK et la LDH). Leur activité immunomodulatrice diminue l’infiltration leucocytaire et l’inflammation, et réduit l’expansion ultérieure de la fibrose. Ces effets sur des cibles multiples se traduisent par une augmentation de la force et de l’endurance des souris.Dans une autre étude sur le même sujet [2], une injection intraveineuse unique d’exosomes produits par des cellules dérivées de progéniteurs cardiaques (cardiosphères) améliore les fonctions musculaires cardiaques et squelettiques des souris mdx. Les exosomes font régresser les lésions cardiaques, augmentent la fraction d’éjection myocardique, améliorant la capacité maximale d’exercice et diminuant la fibrose myocardique. Ils stimulent la régénération musculaire squelettique, augmentent la prolifération des cellules satellites, diminuent les réponses inflammatoires, et augmentent in fine la force isométrique des muscles squelettiques. Les bénéfices sont liés aux modifications transcriptomiques exercées par les micro-ARN (miR) contenus dans les exosomes, en particulier miR148a, ainsi qu’aux mécanismes d’immunomodulation. Les exosomes sont aussi efficaces que les cellules productrices elles-mêmes et constituent probablement leur principal mécanisme d’action

Mesenchymal Stromal Cells (MSC) : phenotypical and functional characterizations as tools for immunomodulation in Myasthenia Gravis

International audienceSeveral autoimmune diseases are mediated by antibodies produced after deregulations of the immune system and directed against self antigens. Myasthenia Gravis (MG) is a rare disease in which pathogenicity is due to autoantibodies directed against the neuromuscular endplate. MG is not really cured, corticosteroids and azathioprin are commonly used, however they trigger severe side-effects, mandating the setup of novel therapies. Mesenchymal Stromal/Stem Cells (MSC) are multipotent progenitor cells that can be isolated from various human tissues and can modulate the immune system via soluble mediators and cell-cell contacts. Our team has recently validated a new animal model of MG, in which we demonstrated that the transfer of MSC conditioned by peripheral blood mononucleated cells (PBMC) improved the clinical status of the animals (Sudres et al., JCI Insight 2017). To develop this immunomodulating approach in clinical perspective, we compared the phenotypes of research-grade (RG) and clinical-grade (CG) MSC testing a series of 60 antibodies (Ab) directed against surface antigens by flow cytometry. We evaluated the variations introduced by different conditioning treatments (activation by gamma-interferon, cross-stimulation by PBMC or monocytes). Markers involved in immunomodulation (recognition, activation, function of complement, co-stimulation, immune checkpoints) were increased or decreased depending on treatment. Adhesion molecules and receptors were also differentially modified (integrins, selectins, cell-cell adhesion molecules, growth factor receptors, tetraspanins). These results suggest that the conditioning regimens act through different pathways. From this panel, we derived a second one of 31 Ab allowing simultaneous labeling of MSC at single cell level by mass cytometry (CyTOF). We defined MSC clusters which were modulated upon activation. In parallel, we evaluated the functional activity of resting or conditioned CG MSC through a cell proliferation assay, and through the quantification by ELISA of secreted immunomodulating products. The conditioning regimens differentially modulated the secretion of Prostaglandin E2 and TGFbeta1, and inhibited PBMC proliferation. This work unveiled phenotypic and functional markers of MSC along with their modulations according to different treatments, and will contribute to validate a cell therapy product for immunomodulation purposes