Approche de thérapie cellulaire de la Myasthénie utilisant les cellules souches mésenchymateuses conditionnées

Abstract

Myasthenia gravis (MG) is a rare autoimmune disease mediated by pathogenic antibodies targeting neuromuscular endplate molecules, mainly the acetylcholine receptor, and characterized by immune deregulation and chronic cell activation. The impaired neuromuscular transmission leads to muscular weakness and invalidating fatigability, and MG crisis can be life-threatening. The treatments are associated with serious side effects, mandating the research of innovative therapeutic solutions. Mesenchymal Stem Cells (MSC) are multipotent progenitor cells possessing broad immunoregulatory capacities, and acting via cell-cell contacts, exosomes production and secretion of soluble mediators. To boost their immunosuppressive capacities, MSCs can be licensed by high doses of pro-inflammatory cytokines such as interferon-γ (IFN-γ), which however may impact MSC fitness and immunogenicity. Our team developed an alternative approach, in which MSC are cocultured with peripheral blood mononuclear cells (PBMC), thus becoming conditioned MSC. The transfer of research grade (RG) cMSC improved the clinical outcomes in a humanized MG mouse model. In a clinical perspective, RG MSC were first replaced by clinical grade MSC, and ideally, the use of PBMC should be replaced by a molecular cocktail. Here, we characterized thoroughly gene expression, phenotypic profile, and secretome changes induced by PBMC conditioning (cMSC), when compared to non-stimulated (rMSC) and IFN-γ stimulated (γMSC) cells. We studied the functional capacities of these cells in vitro and in vivo. Additionally, we identified molecules produced during cell coculture that may be responsible of MSC conditioning. RNAseq study showed that compared to rMSC gene expression profile, conditioning by PBMC deregulated the expression of 244 genes. Compared to rMSC and γMSC, the signature of cMSC included upregulation of CD26, CD273, CCL11, TNIP1 and TNIP3, and downregulation of CILP and LGALS1. γMSC deregulated 2089 genes, harboring a classical signature consisting in up-regulation of IDO-1, TGF-b1, CXCL9, CXCL10, HLA and HLA-associated molecules. Main pathways related to cMSC were extracellular matrix remodeling, signaling by interleukins and immunosuppression, while IFN-γ response, JAK-STAT signaling and inflammatory response were associated with MSC. Gene signatures for each treatment where confirmed by qPCR. cMSC and γMSC also presented phenotypic differences when compared to rMSC. Signatures of cMSC included increased CD54, CD273 and CD49a expression, without HLA modulation. At variance, IFN-γ activation increased expression of CD317, CD54 and HLA molecules. General phenotypic profile studied by mass cytometry revealed 10 different metaclusters; rMSC and cMSC had close profiles, sharing most of the metaclusters except for one that was characterized by a strong immunomodulatory imprint. γMSC showed a completely different phenotypic profile. Regarding functional capacities, in vitro, conditioned medium (CM) produced by cMSC had higher immunosuppressive capacities on T cell proliferation and induced higher percentage of Tregs when compared to rMSC and γMSC CM. The analysis of cMSC secretome revealed 44 molecules that were significantly upregulated by cellular conditioning. In our NSG-MG mouse model, cMSC reduced significantly the clinical score of mice when compared to untreated ones, 2 weeks after injection till end-point of the experiment. Finally, proteomic analysis of soluble factors secreted by PBMC alone, MSC alone and both cells in coculture allowed the identification of 22 molecules that are potentially implicated in cellular conditioning. These results provide clues for defining the mechanisms of action of conditioning by PBMC, and suggest the use of cMSC or their CM to operate immunomodulation in the context of MG, or other auto-immune diseases.Inflammatoires telles que l'interféron-γ (IFN-γ), qui peuvent altérer la physiologie et l'immunogénicité cellulaires. Notre équipe a développé une approche alternative consistant à co-cultiver les CSM avec des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), et a montré que l’injection de cellules conditionnées de qualité recherche induit des améliorations cliniques dans un modèle murin humanisé (NSG-MG).Ici, dans une perspective clinique, nous avons d’abord validé l’utilisation de CSM de qualité clinique. Puis nous avons caractérisé l'expression génique et le profil phénotypique en comparant cellules non stimulées (CSMr), conditionnées (CSMc) ou stimulées par l’IFN-γ (CSMγ), et déduit leurs signatures spécifiques. Nous avons étudié leurs capacités fonctionnelles in vitro et in vivo, et identifié, dans leurs sécrétomes, des molécules potentiellement responsables du conditionnement et de l’immunomodulation. L'étude RNAseq a montré que les conditionnements par PBMC et IFN-γ dérégulaient l'expression de 244 gènes et 2089 gènes, respectivement, par rapport au profil des CSMr. Les CSMc surexprimaient CD26, CD273, CCL11, TNIP1 et TNIP3, et sous-exprimaient CILP et LGALS1. Les CSMγ surexprimaient IDO-1, TGF-β1, CXCL9, CXCL10, et des molécules d’HLA ou associées, comme attendu. Les principales voies de signalisation liées au CSMc comprenaient le remodelage de la matrice extracellulaire, la signalisation par des interleukines et l'immunosuppression, tandis que les voies de la réponse IFN-γ, la signalisation JAK-STAT et la réponse inflammatoire étaient associées aux CSMγ. Les signatures génétiques pour chaque traitement ont été validées par qPCR. Des différences phénotypiques ont été observées entre CSMc, CSMγ et CSMr. La signature de CSMc incluait une augmentation de CD54, CD273 et CD49a, sans modulation des HLA. Au contraire, l'expression de CD317, CD54 et HLA était augmentée en CSMγ. Les profils de regroupements étudiés par cytométrie de masse ont révélé 10 métaclusters. Les CSMr et les CSMc avaient des profils proches, à l'exception d'un cluster caractérisé par une forte empreinte immunomodulatrice, tandis que les CSMγ ont montré un profil complètement différent. Sur le plan fonctionnel le milieu conditionné (MC) des CSMc avait des capacités immunosuppressives in vitro plus puissantes sur la prolifération des cellules T que le MC des CSMr et CSMγ, et augmentait plus efficacement le pourcentage de Tregs. In vivo, les CSMc ont réduit de manière significative le score clinique des souris NSG-MG par rapport aux souris non traitées, dès la deuxième semaine post-injection. Enfin, l'analyse protéomique des MC produits par les PBMC seules, les CSMr seules et leurs cocultures a identifié 22 molécules potentiellement impliquées dans le conditionnement cellulaire, tandis que l’analyse du MC produit par les CSMc a identifié 44 molécules potentiellement impliquées dans l’immunomodulation. Ces résultats permettent de proposer des mécanismes d'action du conditionnement par les PBMC, et suggèrent l'utilisation des CSMc ou de leur MC pour réaliser une immunomodulation dans le cadre de la MG ou d'autres maladies auto-immunes