Tissue Engineering of a meniscus - from a biomaterial to the implant

Der Meniskus, ein scheibenförmiger Faserknorpel, spielt im Kniegelenk eine bedeutende Rolle, weil er Kräfte und Druck im Kniegelenk gleichmäßig verteilt, Stöße dämpft sowie der Kraftübertragung und Stabilisierung dient. Durch die Entfernung des Gewebes, der sogenannten Totalmeniskektomie, nach einer Meniskusverletzung oder einem Riss, verändern sich die mechanischen Eigenschaften des Gelenks stark und verursachen durch die erhöhte Belastung der Gelenkflächen Arthrose. Arthrose ist weltweit die Häufigste aller Gelenkerkrankungen. Der Erhalt der körperlichen Leistungsfähigkeit und Mobilität bis ins hohe Alter sowie die Bewahrung der Gesundheit von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselorganen zählen aufgrund des demografischen Wandels zu den großen medizinischen Herausforderungen. Die Erkrankung des muskuloskelettalen Systems stellte 2010 im Bundesgebiet die am häufigsten vorkommende Krankheitsart dar. Während Risse in den äußeren Teilen des Meniskus aufgrund des Anschlusses an das Blutgefäßsystem spontan heilen können, können sie dies in tieferen Zonen nicht. Durch die begrenzte Heilungsfähigkeit des Knorpels bleibt langfristig der Einsatz eines Ersatzgewebes die einzige therapeutische Alternative. In der vorliegenden Arbeit wurde als therapeutische Alternative erfolgreich ein vaskularisiertes Meniskusersatzgewebe mit Methoden des Tissue Engineering entwickelt. Es soll in Zukunft als Implantat Verwendung finden. Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Forschungsfeld, in dem Gewebe außerhalb des Körpers generiert werden. Schlüsselkomponenten sind Zellen, die aus einem Organismus isoliert werden, und Trägerstrukturen, die mit Zellen besiedelt werden. Die Biomaterialien geben den Zellen eine geeignete Umgebung, die die Extrazelluläre Matrix (EZM) ersetzen soll, um die Funktion der Zellen beizubehalten, eigene Matrix zu bilden. Zum Erhalt eines funktionelles Gewebes werden oftmals dynamische Kultursysteme, sogenannte Bioreaktoren, verwendet, die natürliche Stimuli wie beispielsweise den Blutfluss oder mechanische Kompressionskräfte während der in vitro Reifungsphase des Gewebes, zur Verfügung stellen. Das Gewebekonstrukt wurde auf Basis natürlicher Biomaterialien aufgebaut, unter Verwendung ausschließlich primärer Zellen, die später direkt vom Patienten gewonnen werden können und damit Abstoßungsreaktionen auszuschließen sind. Da der Meniskus teilvaskularisiert ist und die in vivo Situation des Gewebes bestmöglich nachgebaut werden sollte, wurden Konstrukte mit mehreren Zelltypen, sogenannte Ko-Kulturen aufgebaut. Neben mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ) und Meniskuszellen (MZ) erfolgten Versuche mit mesenchymalen Stammzellen (MSZ). Zur Bereitstellung einer zelltypspezifischen Matrixumgebung, diente den mvEZ ein Stück Schweinedarm mit azellularisierten Gefäßstrukturen (BioVaSc®) und den MZ diente eine geeig- nete Kollagenmatrix (Kollagen Typ I Hydrogel). Die Validierung und Charakterisierung des aufgebauten 3D Meniskuskonstrukts, welches in einem dynamischen Perfusions-Bioreaktorsystem kultiviert wurde, erfolgte mit knorpeltypischen Matrixmarkern wie Aggrekan, Kollagen Typ I, II und X sowie mit den Transkriptionsfaktoren RunX2 und Sox9, die in der Knorpelentstehung von großer Bedeutung sind. Zusätzlich erfolgten Auswertungen mit endothelzellspezifischen Markern wie vWF, CD31 und VEGF, um die Vaskularisierung im Konstrukt nachzuweisen. Analysiert wurden auch die Zellvitalitäten in den Konstrukten. Aufgrund einer nur geringen Verfügbarkeit von MZ wurden Kulturansätze mit alternativen Zellquellen, den MSZ, durchgeführt. Dafür erfolgte zunächst deren Isolation und Charakterisierung und die Auswahl einer geeigneten 3D Kollagenmatrix. Die beste Zellintegration der MSZ konnte auf einer eigens hergestellten elektrogesponnenen Matrix beobachtet werden. Die Matrix besteht aus zwei unterschiedlichen Kollagentypen, die auf insgesamt fünf Schichten verteilt sind. Die Fasern besitzen weiter unterschiedliche Ausrichtungen. Während die Kollagen Typ I Fasern in den äußeren Schichten keiner Ausrichtung zugehören, liegen die Kollagen Typ II Fasern in der mittleren Schicht parallel zueinander. Der native Meniskus war für den Aufbau einer solchen Kollagen-Trägerstruktur das natürliche Vorbild, das imitiert werden sollte. Nach der Besiedelung der Matrix mit MSZ, konnte eine Integration der Zellen bereits nach vier Tagen bis in die Mittelschicht sowie eine spontane chondrogene Differenzierung nach einer insgesamt dreiwöchigen Kultivierung gezeigt werden. Das Biomaterial stellt in Hinblick auf die Differenzierung der Zellen ohne die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine relevante Bedeutung für klinische Studien dar. Zur Kultivierung des 3D Meniskuskonstrukts wurde ein Bioreaktor entwickelt. Mit diesem können neben Perfusion der Gefäßsysteme zusätzlich Kompressionskräfte sowie Scherspannungen auf das Ersatzgewebe appliziert und die Differenzierung von MZ bzw. MSZ während der in vitro Kultur über mechanische Reize stimuliert werden. Ein anderes Anwendungsfeld für den neuartigen Bioreaktor ist seine Verwendung als Prüftestsystem für die Optimierung und Qualitätssicherung von Gewebekonstrukten.The meniscus, a disk-shaped fibrous cartilage, plays an important role in the equal distribution of pressure, shock absorption, power transmission and stability within the knee joint. After a meniscus injury or a meniscus tear, a total meniscectomy is done where the complete tissue is removed. This leads to a change of mechanical properties in the joint and causes arthrosis by an increased strain on the joint surfaces. Wordwide arthrosis is the most frequent of all joint diseases. Due to the demographic change, maintaining physical fitness and mobility up to an old age are the main challenges besides ensuring health of the heart and circulatory system and of the metabolic organs. Musculoskeletal disorders represented the most frequent type of disease in Germany in 2010. While tears in the outer zone of the meniscus heal spontaneously because of its connection to the blood vessel system, tears in the deeper zones do not heal. Due to the limited healing capacity of cartilage the use of a replacement tissue is the only therapeutic alternative in the long run. In the present work a vascularized meniscus construct as therapeutic alternatives has been developed with the Tissue Engineering method for the further use as an implant. Tissue En- gineering is an interdisciplinary research field to generate tissues outside the body. The key components are isolated cells from an organism, and scaffolds, which are seeded with cells. Biomaterials provide a suitable environment that replaces the extracellular matrix (ECM) to maintain cell functionality to let cells build up their own matrix. To maintain a functional tissue during in vitro dynamic culture, bioreactor systems are used to provide natural stimuli such as blood flow or mechanical compression forces. The tissue construct is based on natural biomaterials and solely on primary cells, which later can be isolated directly from the patient and thereby exclude repulsion reactions. Due to its limited vascularity of the meniscus and the aim to build up at its best the in vivo situation more than one cell type is used to generate constructs, so called co-culture systems. Mesen- chymal stem cells (MSZ) besides microvascular endothelial cells (mvEZ) and meniscus cells (MZ) were used in the experiments. To supply a cell type specific matrix environment, a segment of a porcine jejunum with decellularized vascular structures (BioVaSc®) for the mvEZ and a collagen based matrix (collagen type I hydrogel) for the MZ were employed. The validation and characterization of the de- veloped 3D meniscus construct, that was cultured in a dynamic perfusion bioreactor system, was performed by using cartilage matrix specific markers, such as aggrecan, collagen type I, II and X, as well as the transcription factors RunX2 and Sox9 that are of major importance for cartilage development. Further analysis with endothelial cell specific markers, such as vWF, CD31 and VEGF were performed to evaluate the vascularization of the construct. Furthermore, cell vitality tests of the construct were made. Because of the limited availability of primary MZ, culture approaches with MSZ as an alter- native cell source were investigated. Cell isolation and characterization were performed and a suitable 3D collagen matrix was selected. The best cell integration of the MSZ could be observed on a specifically engineered electrospun matrix. The matrix consists of two different collagen types that are arranged in a total of five layers. The fibers are further orientated in different directions. While outer layers consist of randomly-aligned collagen type I fibers, the collagen type II fibers in the middle layer are aligned parallel to each other. The native meniscus tissue serves as natural example and its structure is replicated in such a collagen scaffold. After seeding the scaffold with MSZ, cell integration into the middle layer could be observed after four days, as well as a spontanous chondrogenic differentation after three weeks of culture. The biomaterial developed in this work has to be considered as relevant for clinical studies with regard to cell differentiation without adding growth factors to the culture. For the culture of 3D meniscus construct a bioreactor was successfully developed, that can apply compressive strength and shear stress to the tissue model in addition to perfusing the vascular system. With these measures the differentiation of MZ or MSZ could be induced with mechanical strains during the in vitro culture. Another field of application for the new bioreactor is its use as a test system for the optimization and quality control of the tissue models

SchussenAktivplus: reduction of micropollutants and of potentially pathogenic bacteria for further water quality improvement of the river Schussen, a tributary of Lake Constance, Germany

The project focuses on the efficiency of combined technologies to reduce the release of micropollutants and bacteria into surface waters via sewage treatment plants of different size and via stormwater overflow basins of different types. As a model river in a highly populated catchment area, the river Schussen and, as a control, the river Argen, two tributaries of Lake Constance, Southern Germany, are under investigation in this project. The efficiency of the different cleaning technologies is monitored by a wide range of exposure and effect analyses including chemical and microbiological techniques as well as effect studies ranging from molecules to communities

Fertigungstechnische und tribologische Wirkmechanismen beim Polymerläppen am Beispiel der Werkstoffpaarung einer Nockenwellenlagerung

Beim Läppen mit einem Polymerwerkzeug wurde in dieser Arbeit untersucht, welcher Einfluss der Energieeintrag bei diesem Bearbeitungsverfahren auf das Reib- und Verschleißverhalten der Werkstücke im späteren Tribokontakt hat. Dabei wurde gezeigt, wie das Polymerläppen in Abhängigkeit des eingestellten Drucks die Tiefe des oberflächennahen, verfestigten Werkstoffgefüges verändert sowie die Anhaftung einer Adsorptionsschicht bewirkt und somit das Triboverhalten beeinflusst

SchussenAktiv-Eine Modellstudie zur Effizienz der Reduktion der Gehalte an anthropogenen Spurenstoffen durch Aktivkohle in Kläranlagen: Expositions-und Effektmonitoring vor Inbetriebnahme der Adsorptionsstufe auf der Kläranlage Langwiese des AZV Mariatal, Ravensburg

SchussenAktiv-a Model Study on the Efficacy in Reducing Anthropogenic Micropollutants by Activated Carbon Filtration in Wastewater Treatment Plants-Exposure and Effect Monitoring Prior to the Startup of the Charcoal Adsorption System at the Wastewater Treatment Plant Langwiese, Association for Wastewater Treatment Mariatal, City of Ravensburg, GermanyInternational audienceZusammenfassung Durch den kombinierten Einsatz verschiedener Methoden ist nachweisbar, dass sich Spurenstoffe auf den Gesundheitszustand wasserlebender Organismen und die Integrität aquatischer Le-bensgemeinschaft negativ auswirken. Im Projekt SchussenAktiv konnte die Präsenz von Spurenstoffen mit toxischen (z.B. gento-xischen) und hormonellen (z.B. östrogenartigen) Potentialen so-wie tatsächlichen Wirkungen in Verbindung gebracht werden. Die große Variabilität im Nachweis östrogenartig wirkender Chemi-kalien spiegelt sich auch in der Variabilität der nachgewiesenen östrogenen Wirkpotenziale und Wirkungen bei Fischen und Fisch-nährtieren wider. Die reduzierte Anzahl sensitiver Taxa unterhalb der untersuchten Kläranlage Langwiese (AZV Mariatal, Ravens-burg) an der Schussen spricht dafür, dass sich negative Effekte be-reits auf biozönotischer Ebene manifestiert haben. Ein Zusam-menspiel toxischer und hormoneller Einflüsse auf die Organismen in der Schussen ist hierbei aufgrund der erzielten Resultate wahr-scheinlich. Für die als Referenzgewässer ausgewählte Argen konn-te gezeigt werden, dass die untersuchte Probenahmestelle zwar insgesamt als deutlich weniger belastet gelten kann als die Probe-nahmestellen an der Schussen, dass a ber auch hier Bedarf be-steht, bestimmte Expositionen (z. B.-Sitosterol, Cadmium, Ar-sen, Quecksilber, Zink) und Effekte (z. B. Acetylcholinesterase-hemmung bei Fischen, fehlende Abundanz von Gammariden) ge-nauer zu betrachten um gegebenenfalls ihre Ursachen zu eruieren. Using a combination of different chemical and biological methods the project SchussenAktiv provided evidence that micropollutants negatively influence the health status of aquatic organisms and the integrity of aquatic ecosystems. It was possible to establish plausible connections between the presence of distinct micropol-lutants in the environment, toxic (e.g. genotoxic) or hormonal (e.g. estrogen-like) potentials in effluent or surface water samples , and the respective effects in feral fish. Large variability in the abundance of estrogen-like substances was reflected in the variation of both estrogenic potentials and estrogenic effects in fish and invertebrates. The decreased number of sensitive taxa in the river Schussen downstream the wastewater treatment plant Langwiese revealed evidence for detrimental effects also on the community structure. In general, the results of SchussenAktiv led to the suggestion that both toxic and endocrine-active chemicals interact in influencing organisms abundant in the Schussen river downstream sewage treatment plant. In contrast, the sampling site at the Argen river, chosen as a reference, was found to be clearly less polluted than the investigated sites along the Schussen. Nevertheless , detected pollutants (-sitosterol, cadmium, arsenic, mercury , zinc) and effects (AChE inhibition in fish, absence of gam-marids) call for a causal analysis also in the river Argen