Untersuchungen zur Proteinbiosynthese bei hippokampusabhängigen Lernprozessen der Maus

Innerhalb des letzten Jahrhunderts intensiver Gedächtnisforschung ist es noch nicht gelungen, ein vollständiges und allgemein gültiges Modell für die Bildung von Langzeitgedächtnis zu entwickeln. Einige neuronale Moleküle, insbesondere Proteinkinasen und Transkriptionsfaktoren, scheinen hierbei in bestimmten Hirnregionen, deren Einbeziehung vom Lerntest abhängig ist, eine essentielle Bedeutung zu haben. Welche Rolle die lerninduzierte Neu-Expression von Genen (Transkription bzw. Translation) einnimmt, die als Teilprozesse der Konsolidierung postuliert werden, ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt. Die Bedeutung dieser Teilprozesse wurde in dieser Arbeit bei Mäusen unter Verwendung von zwei hippokampusabhängigen Lerntests (auditorische trace-Konditionierung und kontextuelle Konditionierung) näher untersucht. Die drei hierbei im Vordergrund stehenden Aspekte waren die pharmakologische Validierung der Lerntests, der regionenspezifische Nachweis neuronaler Aktivierung und Untersuchungen zur Expression lernspezifischer Gene. Die pharmakologische Validierung der beiden Tests zeigte, dass durch lokale Gabe der translationshemmenden Substanz Anisomycin in den dorsalen Hippokampus zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach dem Lernereignis das Gedächtnis beeinträchtigt ist. Die proteinsyntheseabhängige Phase ist bei der kontextuellen Konditionierung spätestens nach einer Stunde abgeschlossen. Demgegenüber hatte die Hemmung der Transkription mit Amanitin auf keinen der beiden Tests Einfluss auf die Gedächtnisbildung. Die neuronale Aktivierung, die anhand der Induktion ausgewählter Immediate early genes (IEGs) im Hippokampus untersucht wurde, sollte indirekt Hinweise auf Genexpression liefern. Die IEGs waren im Gegensatz zur Literatur bei trace-Konditionierung schwach induziert (zif268 mRNA in CA1 und CA3) bzw. bei kontextueller Konditionierung nicht nachweisbar (c-Fos Protein in CA1). Um alternativ dazu die neuronale Aktivierung bezüglich einer erhöhten Proteinbiosyntheserate zu untersuchen, wurde eine Methode etabliert und validiert, die den Einbau der [35S]-markierten Aminosäuren Methionin und Cystein in neu synthetisierte Proteine regionenspezifisch darstellt (funktionelle Proteinbiosynthese). Hierbei zeigte sich in der Subregion CA1 des dorsalen Hippokampus eine erhöhte Proteinbiosyntheseaktivität nach kontextueller Konditionierung. Ein besonderer Vorteil der Methode besteht darin, dass mit Hilfe der Autoradiogramme funktionelle Netzwerke aufgezeigt werden können, indem Korrelationen in der Proteinbiosyntheseaktivität zwischen verschiedenen Hirnregionen auf deren funktionelle Einheit im Zusammenhang mit dem Lerntest verweisen. Unserer Erkenntnis nach ist das einer der ersten Befunde, womit bei Mäusen erfolgreich lernbedingte Veränderungen der Proteinbiosynthese unter Wahrung neuroanatomischer Auflösung dargestellt werden konnten. Die Untersuchungen zur lerninduzierten Expression spezifischer Gene erfolgten auf Ebene der Proteine, da bei der pharmakologischen Validierung der Lerntests nicht gezeigt werden konnte, dass Transkriptionsprozesse für die Gedächtnisbildung essentiell sind. Ausgehend von einem Standardprotokoll der zweidimensionalen Gelelektrophorese wurden unter Verwendung der radioaktiven Markierung von Proteinen mit [35S]-Methionin/Cystein Verbesserungen dieses Verfahrens hinsichtlich Sensitivität und signal-to-noise ratio erzielt. Mit dem verbesserten Verfahren konnte ein Protein gefunden werden, das nach kontextueller Konditionierung im Vergleich zu unbehandelten Tieren eine Veränderung der Nettoladung (Verschiebung des isoelektrischen Punktes) aufweist, was auf einen Unterschied in der posttranslationalen Modifikation schließen lässt. Quantitative Unterschiede wurden nicht gefunden. Dies ließe sich damit erklären, dass die Verfahren zu Proteinextraktion vor allem zytosolische Proteine berücksichtigen, membranständige Proteine jedoch weitgehend vernachlässigen. Zusammengefasst wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Algorithmus etabliert, der sich auf vielfältige Art und Weise für Fragestellungen zur Charakterisierung lern- bzw. stressinduzierter Proteine unter Berücksichtigung neuroanatomischer Aspekte anwenden lässt. Berücksichtigt man, dass Anisomycin neben der Proteinsynthesehemmung auch andere zelluläre Prozesse beeinflusst, so fällt die vorliegende Arbeit kein abschließendes Urteil über die Rolle der Proteinbiosynthese bei hippokampusabhängigen Lernprozessen. Dies kann zu einem erheblichen Teil an der nichttopographischen Anatomie des Hippokampus liegen, so dass zukünftige Studien sich auf eng umrissene Hirnareale konzentrieren sollten

Systems genetics identifies Sestrin 3 as a regulator of a proconvulsant gene network in human epileptic hippocampus

Peer reviewe

Transduction efficiency decreases with increased age of neuronal culture.

<p>Primary neuronal cultures were transduced at DIV 0 - DIV 4 with pGIPZ vector (MOI = 3), revealing decreased transduction efficiency with increasing age of the culture (N = 3 per group). *** P<0.001.</p

Hyaluronidase increases transduction efficiency of neuronal cultures with higher DIV.

<p>(<b>A</b>) Experimental timeline as for <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0053269#pone-0053269-g002" target="_blank">Figure 2</a>, except that treatment and transduction occurred at the same timepoint (<b>B</b>) The two non-toxic doses 10 and 30 U/ml showed robustly improved transduction efficiency on neuronal cultures. (<b>C</b>) For the two different MOIs studied, the improved transduction efficiency under Hyaluronidase treatment appeared more pronounced for younger cultures (N = 3 per group; statistics in text). Scale bar = 20 µm.</p

Toxicity of Hyaluronidase <i>in vivo.</i>

<p>Fluoro-Jade C staining (green, bottom panel) overlaid with Hoechst (blue) reveals differing levels of toxicity after injecting different amounts of hyaluronidase. Compared to PBS control, 4 and 20 U/site showed little or no increase in toxicity for cells around the injection site. In contrast, 40 U hyaluronidase is of a similar extent to kainic acid (4 µg/site), which served as positive control for the staining Pictures were taken from areas surrounding the cannula tract, which is outlined in red. Scale bar = 100 µm.</p

Hyaluronidase increases the percentage of NeuN-positive cells being transduced at high MOI, mimicking an <i>in vivo</i> situation with high MOI surrounding the injection site.

<p>(<b>A</b>) Hyaluronidase increases the percentage of transduced NeuN-positive cells. (<b>B</b>) Representative images and overlay. Closed circle represents transduced NeuN-positive cell, dashed circle indicates non-transduced NeuN-positive cell (N = 3 per group). Scale bar = 20 µm.</p