Differential contribution of the two major polygalacturonases from Penicillium digitatum to virulence towards citrus fruit

The fungus Penicillium digitatum is the causal agent of the citrus green mould, the major postharvest diseases of citrus fruit. Lesions on the surface of infected fruits first appear as soft areas around the inoculation site, due to maceration of fruit. The macerating activity has been associated with pectinases secreted by the fungus during infection. In order to evaluate the contribution to virulence and macerating activity of the two major polygalacturonases (PGs) secreted by P. digitatum, we have obtained and characterized mutants lacking either pg1 or pg2, the genes encoding PG1 and PG2, respectively. Disease incidence of deletants in either gene was not different from that of the parental strain or ectopic transformants. However, disease progressed more slowly in deletants, especially in those lacking the pg2 gene. The lesions originated by the Δpg2 deletants were not as soft and the pH was not as acid as those originated by either the wild type strain or the ectopic transformants. Total PG activity in the macerated tissue was also lower in fruits infected with the Δpg2 deletants. Interestingly, the macerated tissue of oranges infected with Δpg2 deletants showed around 50% reduction in galacturonic acid content with respect to lesions caused by any other strain.The technical assistance of Ana Izquierdo is gratefully acknowledged. LG-C's research is funded in part by the Spanish Ministry of Economy, Industry and Competitiveness (AGL2011-30519-C03-01 and AGL2014-55802-R) and the Generalitat Valenciana (PROMETEOII/2014/027). ML-P was supported by a “Formación de Personal Investigador” scholarship (BES-2006-12983). Authors want to thank the technical assistance of S. Dashevskaya and the financial support by AGL2011-30519-CO3-03 from the “Ministerio de Economía y Competitividad” (MINECO, Spain), and the CERCA Programme/Generalitat de Catalunya

Interacción fruta-patógeno: factores de virulencia de Penicillium spp. y mecanismos de defensa de naranjas y manzanas

Penicillium digitatum i Penicillium expansum son els patògens més devastadors de fruits cítrics i de llavor, respectivament, i són els responsables d’importants pèrdues econòmiques durant el maneig en postcollita. Una millor comprensió de les interaccions hoste-patogen, incloent els mecanismes de defensa de l'hoste i els factors de virulència del patogen, poden jugar un paper important en el disseny d’estratègies de control noves i més segures. Per assolir aquests objectius generals, es va utilitzar una aproximació multidisciplinar, incloent estudis patològics, bioquímics i moleculars. El primer objectiu d'aquesta tesi va ser estudiar les capacitats d'infecció d'ambdós patògens en taronges i en pomes a diferents estats de maduresa dels fruits, concentracions d'inòcul del patogen i temperatures d'emmagatzematge, per definir les interaccions compatibles i incompatibles. Com que tots dos patògens estudiats requereixen una ferida per iniciar el procés d'infecció, es va estudiar l'efecte de la resposta a la ferida en taronges i en pomes, com un mecanisme de defensa contra els patògens compatibles i els no-hostes. La lignina va ser identificada com un component important implicat en la resposta de defensa a la ferida de taronges i de pomes respecte a patògens compatibles i no-hostes, utilitzant aproximacions histoquímiques i bioquímiques. Es van dur a terme anàlisis transcriptòmiques en resposta als patògens compatibles i als no-hostes per identificar gens implicats en la ruta dels fenilpropanoids. Es va analitzar l'expressió de diversos gens implicats en aquesta ruta utilitzant diferents aproximacions. A més a més, es va avaluar la capacitat de P. digitatum i P. expansum per millorar la seva virulència acidificant de manera local el pH de les taronges i de les pomes. La barreja dels àcids màlic i cítric podria contribuir en l'acidificació de la podridura de les taronges per P. digitatum mentre que la disminució del pH en pomes podrides per P. expansum es va relacionar amb l'acumulació dels àcids glucònic i fumàric. Els resultats globals obtinguts en aquesta tesi ens poden ajudar a comprendre millor els mecanismes de defensa de les fruites i els factors de virulència dels patògens per controlar les malalties de manera més eficaç.Penicillium digitatum y Penicillium expansum son los patógenos más devastadores de frutos cítricos y de pepita, respectivamente, y son los responsables de importantes pérdidas económicas durante el manejo poscosecha. Una mejor compresión de las interacciones huésped-patógeno, incluyendo los mecanismos de defensa del huésped y los factores de virulencia del patógeno, puede jugar un papel importante en el diseño de estrategias de control nuevas y más seguras. Para alcanzar estos objetivos generales, se utilizó una aproximación multidisciplinar, incluyendo estudios patológicos, bioquímicos y moleculares. El primer objetivo de esta tesis fue estudiar las capacidades de infección de ambos patógenos en naranjas y en manzanas a diferentes estados de madurez de los frutos, concentraciones de inóculo del patógeno y temperaturas de almacenaje para definir las interacciones compatibles e incompatibles. Debido a que ambos patógenos estudiados requieren una herida para iniciar el proceso de infección, se estudió el efecto de la respuesta a la herida en naranjas y manzanas, como un mecanismo de defensa contra los patógenos compatibles y los no-huéspedes. La lignina fue identificada como un componente importante implicado en la respuesta de defensa a la herida de naranjas y manzanas respecto a patógenos compatibles y no-huéspedes, utilizando aproximaciones histoquímicas y bioquímicas. Se llevaron a cabo análisis transcriptómicos en respuesta a los patógenos compatibles y los no-huéspedes para identificar los genes implicados en la ruta de los fenilpropanoides. Se analizó la expresión de varios genes implicados en esta ruta utilizando diferentes aproximaciones. Además, se evaluó la capacidad de P. digitatum y P. expansum para mejorar su virulencia acidificando de manera local el pH de las naranjas y las manzanas. La mezcla de los ácidos málico y cítrico podría contribuir en la acidificación de la podredumbre de las naranjas por P. digitatum mientras que la disminución del pH en manzanas podridas por P. expansum se relacionó con la acumulación de los ácidos glucónico y fumárico. Los resultados globales obtenidos en esta tesis nos pueden ayudar a comprender mejor los mecanismos de defensa de las frutas y los factores de virulencia de los patógenos para controlar las enfermedades de manera más eficaz.Penicillium digitatum and Penicillium expansum are the most devastating pathogens of citrus and pome fruits, respectively, and are responsible for important economical losses during postharvest handling. A better understanding of host-pathogen interactions, including host defence mechanisms and pathogen virulence factors, can play an important role to design new and safer control strategies. To achieve these general objectives, a multidisciplinary approach including pathological, biochemical and molecular studies was used. The first objective of this thesis was to study the infection capacities of both pathogens in oranges and apples at different maturity stages of fruit, pathogen inoculum concentrations and storage temperatures to define compatible and incompatible interactions. Due to both studied pathogens require a wound to initiate the infection process, the effect of wound response in oranges and apples was studied as a defence mechanism against compatible and non-host pathogens. Lignin was identified as an important compound involved in the orange and apple wound response to compatible and non-host pathogens using histochemical and biochemical approaches. Transcriptomic analysis in response to the compatible and non-host pathogens were conducted to identify apple genes involved in phenylpropanoid pathway. The expression of several genes involved in this pathway was analysed in oranges and in apples using different approaches. In addition, the ability of P. digitatum and P. expansum to enhance their virulence by locally acidifying the pH of oranges and apples was evaluated. The mixture of malic and citric acids could at least contribute to the acidification of P. digitatum-decayed oranges while the pH decrease in P. expansum-decayed apples was related to the accumulation of gluconic and fumaric acids. Overall results obtained in this thesis can help us to better understand fruit defence mechanisms and pathogen virulence factors to control diseases more effectively

Differential contribution of the two major polygalacturonases from Penicillium digitatum to virulence towards citrus fruit

The fungus Penicillium digitatum is the causal agent of the citrus green mould, the major postharvest diseases of citrus fruit. Lesions on the surface of infected fruits first appear as soft areas around the inoculation site, due to maceration of fruit. The macerating activity has been associated with pectinases secreted by the fungus during infection. In order to evaluate the contribution to virulence and macerating activity of the two major polygalacturonases (PGs) secreted by P. digitatum, we have obtained and characterized mutants lacking either pg1 or pg2, the genes encoding PG1 and PG2, respectively. Disease incidence of deletants in either gene was not different from that of the parental strain or ectopic transformants. However, disease progressed more slowly in deletants, especially in those lacking the pg2 gene. The lesions originated by the Δpg2 deletants were not as soft and the pH was not as acid as those originated by either the wild type strain or the ectopic transformants. Total PG activity in the macerated tissue was also lower in fruits infected with the Δpg2 deletants. Interestingly, the macerated tissue of oranges infected with Δpg2 deletants showed around 50% reduction in galacturonic acid content with respect to lesions caused by any other strain