High-contrast three-dimensional imaging of the Arabidopsis leaf enables the analysis of cell dimensions in the epidermis and mesophyll

UMR DAP, équipe PHIV; UMR LEPSEInternational audienceABSTRACT: BACKGROUND: Despite the wide spread application of confocal and multiphoton laser scanning microscopy in plant biology, leaf phenotype assessment still relies on two-dimensional imaging with a limited appreciation of the cells' structural context and an inherent inaccuracy of cell measurements. Here, a successful procedure for the three-dimensional imaging and analysis of plant leaves is presented. RESULTS: The procedure was developed based on a range of developmental stages, from leaf initiation to senescence, of soil-grown Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Rigorous clearing of tissues, made possible by enhanced leaf permeability to clearing agents, allowed the optical sectioning of the entire leaf thickness by both confocal and multiphoton microscopy. The superior image quality, in resolution and contrast, obtained by the latter technique enabled the three-dimensional visualisation of leaf morphology at the individual cell level, cell segmentation and the construction of structural models. Image analysis macros were developed to measure leaf thickness and tissue proportions, as well as to determine for the epidermis and all layers of mesophyll tissue, cell density, volume, length and width. For mesophyll tissue, the proportion of intercellular spaces and the surface areas of cells were also estimated. The performance of the procedure was demonstrated for the expanding 6th leaf of the Arabidopsis rosette. Furthermore, it was proven to be effective for leaves of another dicotyledon, apple (Malus domestica Borkh.), which has a very different cellular organisation. CONCLUSIONS: The pipeline for the three-dimensional imaging and analysis of plant leaves provides the means to include variables on internal tissues in leaf growth studies and the assessment of leaf phenotypes. It also allows the visualisation and quantification of alterations in leaf structure alongside changes in leaf functioning observed under environmental constraints. Data obtained using this procedure can further be integrated in leaf development and functioning models

Study of sputtering and emission of matter under Cs+ bombardment

La technique Storing Matter a pour objectif d’améliorer la sensibilité et la quantification des analyses par SIMS. Elle consiste à découpler la phase de pulvérisation de l’échantillon de la phase d’analyse. Pour cela, la matière pulvérisée par bombardement ionique est déposée en sous-monocouche sur un collecteur optimisé. Le dépôt est ensuite analysé par SIMS. La probabilité d’ionisation de la matière ne dépend plus de son environnement initial (“effet de matrice”), mais de la surface du collecteur. Le choix du collecteur permet un gain de sensibilité et la quantification des concentrations de l’échantillon initial. L’efficacité de la technique dépend du choix du collecteur et d’un facteur de collection ? caractérisant la phase de pulvérisation-dépôt. Dans ce travail, nous avons étudié la pulvérisation et l’émission de la matière sous bombardement ionique pour optimiser ce facteur ?. Nous avons mis au point un dispositif expérimental ainsi qu’un protocole d’analyse par SIMS qui nous a permis d’étudier la distribution angulaire sous un bombardement d’ions Cs+ avec une incidence oblique pour différents paramètres d’impact. L’étude menée sur quatre cibles (Si, Ge, InP et GaAs) a montré que la distribution angulaire est de forme cosn (?-?Max) pour une énergie et un angle d’impact de respectivement 2 à 10 keV et 30° à 60°. L’exposant n est ~2 tandis que la direction d’émission préférentielle ?Max varie de la normale à la surface (0°) jusqu’à un angle d’émission de 35° dans la direction spéculaire au faisceau en fonction de l’énergie d’impact et de l’angle d’incidence. Ces résultats appliqués à Storing Matter ont permis de déterminer la configuration optimum pour une collection maîtrisée en fonction du bombardementThe Storing Matter technique aims at optimising the sensitivity and quantitativeness of SIMS analysis. It consists in decoupling the sputtering of the specimen from the subsequent analysis step. The specimen is sputtered by means of an ion beam. The emitted particles are deposited at a sub-monolayer level on an optimised collector. The deposit is subsequently analysed in a SIMS instrument. The ionisation probability in SIMS does not depend anymore on the initial sample composition (“Matrix effect”), but on the collector surface chemistry. The collector is chosen in order to increase the sensitivity and to quantify the specimen. The efficiency of this new technique depends on the collector choice and on the collection factor ? characterising the sputter-deposition step. In this work, the sputtering and emission processes under ionic bombardment have been studied in order to optimise this factor ?. We developed an experimental set-up and an analysis protocol based on SIMS that allows us to study the angular distribution under Cs+ bombardment with an oblique incidence for different impact parameters. Four targets (Si, Ge, InP and GaAs) were studied. The results show that the angular distribution is shaped as a cosine function cosn (?-?Max) for impact energies between 2 and 10 keV and for incidence angles from 30 to 60°. Under these conditions, the exponent n is ~2 and the preferential direction of emission ?Max varies from the normal to the surface to 35° in the specular direction in function of the impact energy and the incidence angle. The results allowed to find the best settings for the Storing Matter technique to control the sputtered matter collection in function of the bombardment parameter

Étude de la pulvérisation et de l'émission de la matière sous bombardement Cs+

The Storing Matter technique aims at optimising the sensitivity and quantitativeness of SIMS analysis. It consists in decoupling the sputtering of the specimen from the subsequent analysis step. The specimen is sputtered by means of an ion beam. The emitted particles are deposited at a sub-monolayer level on an optimised collector. The deposit is subsequently analysed in a SIMS instrument. The ionisation probability in SIMS does not depend anymore on the initial sample composition (Matrix effect), but on the collector surface chemistry. The collector is chosen in order to increase the sensitivity and to quantify the specimen. The efficiency of this new technique depends on the collector choice and on the collection factor [gamma] characterising the sputter-deposition step. In this work, the sputtering and emission processes under ionic bombardment have been studied in order to optimise this factor [gamma]. We developed an experimental set-up and an analysis protocol based on SIMS that allows us to study the angular distribution under Cs+ bombardment with an oblique incidence for different impact parameters. Four targets (Si, Ge, InP and GaAs) were studied. The results show that the angular distribution is shaped as a cosine function cosn ( [thêta]-[thêta] Max) for impact energies between 2 and 10 keV and for incidence angles from 30 to 60°. Under these conditions, the exponent n is ~2 and the preferential direction of emission [thêta] Max varies from the normal to the surface to 35° in the specular direction in function of the impact energy and the incidence angle. The results allowed to find the best settings for the Storing Matter technique to control the sputtered matter collection in function of the bombardment parametersLa technique Storing Matter a pour objectif d'améliorer la sensibilité et la quantification des analyses par SIMS. Elle consiste à découpler la phase de pulvérisation de l'échantillon de la phase d'analyse. Pour cela, la matière pulvérisée par bombardement ionique est déposée en sous-monocouche sur un collecteur optimisé. Le dépôt est ensuite analysé par SIMS. La probabilité d'ionisation de la matière ne dépend plus de son environnement initial (effet de matrice), mais de la surface du collecteur. Le choix du collecteur permet un gain de sensibilité et la quantification des concentrations de l'échantillon initial. L'efficacité de la technique dépend du choix du collecteur et d'un facteur de collection [gamma] caractérisant la phase de pulvérisation-dépôt. Dans ce travail, nous avons étudié la pulvérisation et l'émission de la matière sous bombardement ionique pour optimiser ce facteur [gamma]. Nous avons mis au point un dispositif expérimental ainsi qu'un protocole d'analyse par SIMS qui nous a permis d'étudier la distribution angulaire sous un bombardement d'ions Cs+ avec une incidence oblique pour différents paramètres d'impact. L'étude menée sur quatre cibles (Si, Ge, InP et GaAs) a montré que la distribution angulaire est de forme cosn ([thêta]-[thêta] Max) pour une énergie et un angle d'impact de respectivement 2 à 10 keV et 30° à 60°. L'exposant n'est ~2 tandis que la direction d'émission préférentielle [thêta] Max varie de la normale à la surface (0°) jusqu'à un angle d'émission de 35° dans la direction spéculaire au faisceau en fonction de l'énergie d'impact et de l'angle d'incidence. Ces résultats appliqués à Storing Matter ont permis de déterminer la configuration optimum pour une collection maîtrisée en fonction du bombardemen

Étude de la pulvérisation et de l'émission de la matière sous bombardement Cs+

La technique Storing Matter a pour objectif d améliorer la sensibilité et la quantification des analyses par SIMS. Elle consiste à découpler la phase de pulvérisation de l échantillon de la phase d analyse. Pour cela, la matière pulvérisée par bombardement ionique est déposée en sous-monocouche sur un collecteur optimisé. Le dépôt est ensuite analysé par SIMS. La probabilité d ionisation de la matière ne dépend plus de son environnement initial ( effet de matrice ), mais de la surface du collecteur. Le choix du collecteur permet un gain de sensibilité et la quantification des concentrations de l échantillon initial. L efficacité de la technique dépend du choix du collecteur et d un facteur de collection ? caractérisant la phase de pulvérisation-dépôt. Dans ce travail, nous avons étudié la pulvérisation et l émission de la matière sous bombardement ionique pour optimiser ce facteur ?. Nous avons mis au point un dispositif expérimental ainsi qu un protocole d analyse par SIMS qui nous a permis d étudier la distribution angulaire sous un bombardement d ions Cs+ avec une incidence oblique pour différents paramètres d impact. L étude menée sur quatre cibles (Si, Ge, InP et GaAs) a montré que la distribution angulaire est de forme cosn (?-?Max) pour une énergie et un angle d impact de respectivement 2 à 10 keV et 30 à 60. L exposant n est ~2 tandis que la direction d émission préférentielle ?Max varie de la normale à la surface (0) jusqu à un angle d émission de 35 dans la direction spéculaire au faisceau en fonction de l énergie d impact et de l angle d incidence. Ces résultats appliqués à Storing Matter ont permis de déterminer la configuration optimum pour une collection maîtrisée en fonction du bombardementThe Storing Matter technique aims at optimising the sensitivity and quantitativeness of SIMS analysis. It consists in decoupling the sputtering of the specimen from the subsequent analysis step. The specimen is sputtered by means of an ion beam. The emitted particles are deposited at a sub-monolayer level on an optimised collector. The deposit is subsequently analysed in a SIMS instrument. The ionisation probability in SIMS does not depend anymore on the initial sample composition ( Matrix effect ), but on the collector surface chemistry. The collector is chosen in order to increase the sensitivity and to quantify the specimen. The efficiency of this new technique depends on the collector choice and on the collection factor ? characterising the sputter-deposition step. In this work, the sputtering and emission processes under ionic bombardment have been studied in order to optimise this factor ?. We developed an experimental set-up and an analysis protocol based on SIMS that allows us to study the angular distribution under Cs+ bombardment with an oblique incidence for different impact parameters. Four targets (Si, Ge, InP and GaAs) were studied. The results show that the angular distribution is shaped as a cosine function cosn (?-?Max) for impact energies between 2 and 10 keV and for incidence angles from 30 to 60. Under these conditions, the exponent n is ~2 and the preferential direction of emission ?Max varies from the normal to the surface to 35 in the specular direction in function of the impact energy and the incidence angle. The results allowed to find the best settings for the Storing Matter technique to control the sputtered matter collection in function of the bombardment parametersNANCY-INPL-Bib. électronique (545479901) / SudocSudocFranceF