Development and Validation of a Food Frequency Questionnaire for Preschool Children Using Multiple Methods

Background: The ability to determine the relationship between diet and health outcomes in children requires reproducible and validated long-term dietary assessment tools such as food frequency questionnaire (FFQ).Objective: To test the reproducibility and relative validity of a FFQ for young children using 24-hour food recalls (24HRs), anthropometric measurements, and a comprehensive feeding practices questionnaire (CFPQ).Methods: Children (aged 5-6) and their mothers were recruited during one school-year (2008) from preschools. Children's anthropometric measurements were obtained. Mothers provided during a personal interview on three occasions a 110-item semiquantitative FFQ, 24HRs and CFPQ. Pearson-correlation coefficients were calculated between the results of the FFQ and 3*24HR. Validity coefficients between the FFQ and the different measurements were calculated. Scores of the 12 factors of the CFPQ were calculated and related to dietary intake.Results: Sixty-six healthy children (47% boys) were recruited. Pearson's correlations between the average of the FFQs and 3*24HRs ranged from 0.3-0.6 (P<0.05). The highest correlation coefficients were 0.59 for total fat intake and 0.56 for energy. Dietary intake of energy and carbohydrates differed significantly (P=0.05, 0.001 respectively) across the three BMI z-score levels (normal-weight, overweight, obese) and the three waist circumference tertiles (0.019, 0.006 respectively). Obesogenic factors from the CFPQ correlated with consumption of empty calories like sweets, snacks, junk foods and sweet drinks.Conclusions: The modified FFQ is a relatively valid instrument to estimate mean energy intake in preschool children. The questionnaire performs reasonably well to rank children with respect to macronutrients intake as well as obesogenic food groups

Digital data sources and methods for conservation culturomics

Peer reviewe

Absence of SCAPER causes male infertility in humans and Drosophila by modulating microtubule dynamics during meiosis

Mutation in S-phase cyclin A-associated protein rin the endoplasmic reticulum (SCAPER) have been found across ethnicities and have been shown to cause variable penetrance of an array of pathological traits, including intellectual disability, retinitis pigmentosa and ciliopathies. Human clinical phenotyping, surgical testicular sperm extraction and testicular tissue staining. Generation and analysis of short spindle 3 (ssp3) (SCAPER orthologue) Drosophila CAS9-knockout lines. In vitro microtubule (MT) binding assayed by total internal reflection fluorescence microscopy. We show that patients homozygous for a SCAPER mutation lack SCAPER expression in spermatogonia (SPG) and are azoospermic due to early defects in spermatogenesis, leading to the complete absence of meiotic cells. Interestingly, Drosophila null mutants for the ubiquitously expressed ssp3 gene are viable and female fertile but male sterile. We further show that male sterility in ssp3 null mutants is due to failure in both chromosome segregation and cytokinesis. In cells undergoing male meiosis, the MTs emanating from the centrosomes do not appear to interact properly with the chromosomes, which remain dispersed within dividing spermatocytes (SPCs). In addition, mutant SPCs are unable to assemble a normal central spindle and undergo cytokinesis. Consistent with these results, an in vitro assay demonstrated that both SCAPER and Ssp3 directly bind MTs. Our results show that SCAPER null mutations block the entry into meiosis of SPG, causing azoospermia. Null mutations in ssp3 specifically disrupt MT dynamics during male meiosis, leading to sterility. Moreover, both SCAPER and Ssp3 bind MTs in vitro. These results raise the intriguing possibility of a common feature between human and Drosophila meiosis

Tumor-activated lymph node fibroblasts suppress T cell function in diffuse large B cell lymphoma

Recent transcriptomic-based analysis of diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) has highlighted the clinical relevance of LN fibroblast and tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) signatures within the tumor microenvironment (TME). However, the immunomodulatory role of fibroblasts in lymphoma remains unclear. Here, by studying human and mouse DLBCL-LNs, we identified the presence of an aberrantly remodeled fibroblastic reticular cell (FRC) network expressing elevated fibroblast-activated protein (FAP). RNA-Seq analyses revealed that exposure to DLBCL reprogrammed key immunoregulatory pathways in FRCs, including a switch from homeostatic to inflammatory chemokine expression and elevated antigen-presentation molecules. Functional assays showed that DLBCL-activated FRCs (DLBCL-FRCs) hindered optimal TIL and chimeric antigen receptor (CAR) T cell migration. Moreover, DLBCL-FRCs inhibited CD8+ TIL cytotoxicity in an antigen-specific manner. Notably, the interrogation of patient LNs with imaging mass cytometry identified distinct environments differing in their CD8+ TIL-FRC composition and spatial organization that associated with survival outcomes. We further demonstrated the potential to target inhibitory FRCs to rejuvenate interacting TILs. Cotreating organotypic cultures with FAP-targeted immunostimulatory drugs and a bispecific antibody (glofitamab) augmented antilymphoma TIL cytotoxicity. Our study reveals an immunosuppressive role of FRCs in DLBCL, with implications for immune evasion, disease pathogenesis, and optimizing immunotherapy for patients

Robust estimation of bacterial cell count from optical density

Optical density (OD) is widely used to estimate the density of cells in liquid culture, but cannot be compared between instruments without a standardized calibration protocol and is challenging to relate to actual cell count. We address this with an interlaboratory study comparing three simple, low-cost, and highly accessible OD calibration protocols across 244 laboratories, applied to eight strains of constitutive GFP-expressing E. coli. Based on our results, we recommend calibrating OD to estimated cell count using serial dilution of silica microspheres, which produces highly precise calibration (95.5% of residuals <1.2-fold), is easily assessed for quality control, also assesses instrument effective linear range, and can be combined with fluorescence calibration to obtain units of Molecules of Equivalent Fluorescein (MEFL) per cell, allowing direct comparison and data fusion with flow cytometry measurements: in our study, fluorescence per cell measurements showed only a 1.07-fold mean difference between plate reader and flow cytometry data

Functional analysis of innate immunity receptors in chronic lymphocytic leukemia

Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι μια αιματολογική κακοήθεια που χαρακτηρίζεται από την in vivo συσσώρευση CD5+ μονοκλωνικών Β λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα, στο μυελό των οστών και στο λεμφικό ιστό. Μέχρι σχετικά πρόσφατα θεωρούνταν ως μια ομοιογενής πάθηση ανώριμων Β λεμφοκυττάρων που αθροίζονται λόγω βλάβης μηχανισμών της απόπτωσης(76). Μέσα στις δυο τελευταίες δεκαετίες ωστόσο η αντίληψή μας για την παθογένεια της ΧΛΛ έχει πλήρως αναθεωρηθεί. Φαίνεται πως συνδυασμός τόσο γενετικών συμβαμάτων όσο και ερεθισμάτων από το μικροπεριβάλλον επηρεάζουν σημαντικά την εμφάνιση και πρόοδο της νόσου, η οποία είναι πολύ περισσότερο ετερογενής από ό,τι αρχικά θεωρούνταν (77). Αρκετά δεδομένα υποστηρίζουν ότι ο Β κυτταρικός υποδοχέας παίζει κεντρικό ρόλο στη φυσική ιστορία της νόσου και μοριακά χαρακτηριστικά του θεωρούνται πλέον σημαντικοί ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για την πορεία και έκβασή της. Σε τουλάχιστον 50% των περιπτώσεων ΧΛΛ τα λευχαιμικά κύτταρα φέρουν σωματικές μεταλλάξεις των IGHV γονιδίων και αυτό γενικά συσχετίζεται με καλύτερη πρόγνωση. Αντιθέτως, «μη μεταλλαγμένες» περιπτώσεις ΧΛΛ αναμένονται να ακολουθήσουν πιο επιθετική πορεία. Eπιπλέον, το ρεπερτόριο των ανοσοσφαιρινών που απαντώνται στα Β λευχαιμικά κύτταρα από ασθενείς με ΧΛΛ παρουσιάζει μια προτίμηση σε επιλεγμένα ΙGHV γονίδια σε σύγκριση με το φυσιολογικό ρεπερτόριο των Β λεμφοκυττάρων (94-97). Πρόσφατα, αρκετές ερευνητικές ομάδες ανακοίνωσαν την ύπαρξη υποομάδων περιπτώσεων ΧΛΛ (υποσύνολα) που χαρακτηρίζονται από ξεχωριστές αναδιατάξεις βαρέων και ελαφρών αλύσων ανοσοσφαιρινών, οι οποίες καταλήγουν στη δημιουργία αξιοσημείωτα ομόλογων («στερεότυπων») CDR3 αλληλουχιών στους Β κυτταρικούς υποδοχείς τους (98-102). Τέτοια εντυπωσιακή ομοιότητα Β κυτταρικών υποδοχέων σε ανεξάρτητες περιπτώσεις ΧΛΛ υποδεικνύει την ύπαρξη περιορισμένου αριθμού αντιγόνων ή δομικά σχετιζόμενων επιτόπων που παίζουν ρόλο στη λευχαιμογένεση. Επιπρόσθετη απόδειξη για αυτήν την υπόθεση αποτελεί η ανάδειξη στερεότυπης σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης σε αυτά ακριβώς τα υποσύνολα ΧΛΛ (103). Μέχρι τώρα έχουν ταυτοποιηθεί περισσότερα από 150 υποσύνολα ΧΛΛ. Πρόσφατες έρευνες αναφέρουν ότι περίπου 30% των ασθενών με ΧΛΛ φέρουν στερεότυπους Β κυτταρικούς υποδοχείς (102-104). Επιπλέον, περιπτώσεις ΧΛΛ με ταυτόσημους, στερεότυπους Β κυτταρικούς υποδοχείς έχει δειχθεί ότι παρουσιάζουν και κοινά κλινικά χαρακτηριστικά, ούτως ώστε συγκεκριμένα υποσύνολα έχουν πλέον συσχετιστεί με συγκεκριμένη πρόγνωση (98,102,105-106). Συνολικά λοιπόν, διέγερση των Β λεμφοκυττάρων μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα φαίνεται να παίζει κρίσιμο ρόλο στην παθογένεση της ΧΛΛ. Συνεπώς, θα είχε μεγάλη σημασία να διευκρινιστούν τα εμπλεκόμενα αντιγονικά στοιχεία. Τα λευχαιμικά κύτταρα στη ΧΛΛ συχνά εκφράζουν Β κυτταρικούς υποδοχείς που προσδένουν αυτοαντιγόνα με πολυαντιδραστικό τρόπο. Επίσης, έχουν βρεθεί να προσδένουν νεοαντιγόνα, καθώς και αλλοαντιγόνα (110-113,116-117). Περίπου 80% των «αμετάλλακτων» και ~15% των «μεταλλαγμένων» Β κυτταρικών υποδοχέων στη ΧΛΛ έχουν βρεθεί να αντιδρούν in vitro με μια σειρά από αυτο- και αλλοαντιγόνα, όπως επίσης και με κύτταρα που έχουν καταστεί διαπερατά, με πολυαντιδραστικό τρόπο (118). Αξίζει να αναφερθεί ότι τα περισσότερα ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα από «αμετάλλακτα» ΧΛΛ κύτταρα που δεν εμφάνιζαν πολυαντιδραστικότητα per se την απέκτησαν όταν η αλληλουχία τους αναστράφηκε στην αρχική, πριν την εισαγωγή σωματικών μεταλλάξεων (110).. Συνοψίζοντας τα παραπάνω προκύπτει η υπόθεση ότι τα ΧΛΛ κύτταρα μπορεί να προέρχονται από έναν πληθυσμό αυτό/πολυαντιδραστικών Β λεμφοκυττάρων. Οι Τoll-like υποδοχείς (ΤLR) αναγνωρίζουν μια σειρά από διακριτά μοριακά μοτίβα και είναι γνωστό ότι γεφυρώνουν έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία. Τα ανθρώπινα ανώριμα Β λεμφοκύτταρα εκφράζουν χαμηλά έως μη ανιχνεύσιμα επίπεδα όλων των TLR, ωστόσο η διέγερση του Β κυτταρικού υποδοχέα οδηγεί σε ταχύτατη έκφραση των TLR2, TLR6, TLR7, TLR9 and TLR10 (56). Αντιθέτως, τα CD5+ Β λεμφοκύτταρα μνήμης εκφράζουν ιδιοσυστασιακά αυτούς τους TLR(55-56). Πρόσφατα διατυπώθηκε η πρόταση ότι η διέγερση των TLR λειτουργεί ως απευθείας σήμα που ενισχύει την απάντηση των ανώριμων Β λεμφοκυττάρων του ανθρώπου στο αντιγόνο (61,63). Μια πρωτοποριακή μελέτη από τον Leadbetter και συν. έδειξε πως συμπλέγματα ΙgG ανοσοσφαιρίνης και χρωματίνης τα οποία περιέχουν DNA είναι ικανά να ενεργοποιήσουν αυτοαντιδραστικά Β λεμφοκύτταρα έτσι ώστε να παράγουν αντισώματα κατά αυτo-IgG διεγείροντας τον Β κυτταρικό υποδοχέα και τον TLR9 με διαδοχική σειρά (32). Αυτή η ιδέα επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τον Lau και συν., οι οποίοι έδειξαν ότι συμπλέγματα αυτοαντιγόνων με RNA ενεργοποιούν Β λεμφοκύτταρα διεγείροντας ταυτόχρονα τον Β κυτταρικό υποδοχέα και τον TLR7, υποστηρίζοντας έτσι τον ρόλο των TLR στην κατάργηση της ανοσολογικής ανοχής (71). Θα ήταν ενδιαφέρον να ελέγξει κανείς αν το μοντέλο αυτό μπορεί να έχει εφαρμογή και στην παθογένεια της ΧΛΛ, τουλάχιστον όσον αφορά τις περιπτώσεις με αυτό/πολυαντιδραστικό Β κυτταρικό υποδοχέα. Περιορισμένα δεδομένα υπάρχουν αναφορικά με το ποιοι TLR εκφράζονται από τα Β λευχαιμικά κύτταρα στη ΧΛΛ. Μέχρι τώρα, το προφίλ έκφρασής τους φαίνεται να μοιάζει σε εκείνο των Β λεμφοκυττάρων που έχουν έρθει σε επαφή με αντιγόνο. Αρκετές ερευνητικές ομάδες αναφέρουν σταθερή έκφραση των TLR7 και TLR9 στα ΧΛΛ κύτταρα (140-141,144) και οι αντίστοιχοι αγωνιστές δοκιμάζονται ήδη σε κλινικές μελέτες με σκοπό να αυξήσουν την ανοσογονικότητα των λευχαιμικών κυττάρων ενισχύοντας την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων και/ή τον ρυθμό πολλαπλασιασμού και συνεπώς την ευαισθησία τους σε κυττταροτοξικές θεραπείες (155,158). Παρόλα αυτά, η επίδραση της διέγερσης των TLR στα ΧΛΛ κύτταρα παραμένει σχετικά αδιευκρίνιστη. Υπάρχουν εξάλλου μελέτες οι οποίες υποστηρίζουν ότι η διέγερση των TLR, και ειδικά του TLR9, μπορεί να οδηγεί σε διαφορετικά αποτελέσματα ανάλογα με την ύπαρξη ή όχι σωματικών μεταλλάξεων στα IGHV γονίδια (144). Η παρούσα μελέτη αποσκοπεί στο να διερευνήσει τη λειτουργία των TLR και NLR υποδοχέων σε υποομάδες ΧΛΛ, όπως αυτές ορίζονται από τη χρήση επιλεγμένων IGHV γονιδίων, την ύπαρξη ή όχι σωματικών μεταλλάξεων στα IGHV γονίδια ή τη στερεοτυπία του Β κυτταρικού υποδοχέα. Υπό αυτό το πρίσμα, αναλύσαμε μια σειρά από 67 ασθενείς με ΧΛΛ, επιλεγμένους με προτίμηση για περιπτώσεις με στερεότυπους Β κυτταρικούς υποδοχείς οι οποίες υπάγονται στα υποσύνολα #4 και #1, καθότι τα υποσύνολα αυτά μπορούν να θεωρηθούν πρότυπα «μεταλλαγμένων» περιπτώσεων/καλής πρόγνωσης και «αμετάλλακτων» περιπτώσεων/κακής πρόγνωσης, αντίστοιχα. Αρνητικά επιλεγμένα, κεκαθαρμένα λευχαιμικά Β λεμφοκύτταρα από κάθε περίπτωση διεγέρθηκαν με ειδικούς προσδέτες για όλους τους TLR που έχουν βρεθεί ως τώρα να εκφράζονται -έστω και σε ελάχιστα επίπεδα- σε ΧΛΛ κύτταρα, καθώς και για τον NOD2 της οικογένειας NLR˙ εν συνεχεία, ελέγχθηκε με κυτταρομετρία ροής η αύξηση της έκφρασης των CD25 και CD86, που αποτελούν δείκτες ενεργοποίησης. Διαπιστώθηκε ότι ο TLR9 ήταν λειτουργικός σε όλες πρακτικά τις περιπτώσεις (αύξηση της έκφρασης του CD25 και/ή CD86 στο 98.5% των περιπτώσεων μετά από διέγερση με CpG). Επιπλέον, ο TLR1/2, ο TLR2/6 και ο NOD2 βρέθηκαν λειτουργικοί στις περισσότερες περιπτώσεις (86.6%, 89.6% και 86.6%, αντίστοιχα) και μάλιστα διαπιστώθηκε ισχυρή συσχέτιση της λειτουργικότητάς τους. Πάνω από δύο τρίτα των περιπτώσεων εμφάνιζε λειτουργικότητα και των τριών αυτών υποδοχέων ταυτόχρονα. Δεδομένου ότι οι TLR1/2 και TLR2/6 αναγνωρίζουν τριακετυλιωμένες και διακετυλιωμένες βακτηριακές λιποπρωτεΐνες, αντίστοιχα, ο δε NOD2 αναγνωρίζει MDP το οποίο ανευρίσκεται τόσο σε Gram+ όσο και σε Gram- βακτήρια, θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι αυτοί οι τρεις υποδοχείς σηματοδοτούν μαζί κάτω από την επίδραση κοινού βακτηριακού αντιγόνου σε συγκεκριμένες περιπτώσεις ΧΛΛ. Ο TLR7 βρέθηκε λειτουργικός σε λιγότερες περιπτώσεις (61.2%), και μόνο όταν διεγέρθηκε με το συνθετικό του αγωνιστή imiquimod. Ο φυσικός προσδέτης του (loxoribine) δεν είχε πρακτικά καμία επίδραση στην έκφραση των CD25 και CD86. Τέλος, ο TLR4 και ο TLR8 δε βρέθηκαν λειτουργικοί σε καμία περίπτωση. Στη συνέχεια διερευνήσαμε την ύπαρξη πιθανών συσχετίσεων μεταξύ των προφίλ TLR/NLR λειτουργικότητας και μοριακών χαρακτηριστικών του Β κυτταρικού υποδοχέα, δηλαδή χρήση επιλεγμένων IGHV γονιδίων, ύπαρξη ή όχι σωματικών μεταλλάξεων στα IGHV γονίδια και παρουσία στερεοτυπίας. Η πρώτη σύγκριση αφορούσε «μεταλλαγμένες» και «αμετάλλακτες» περιπτώσεις ΧΛΛ. Διέγερση του TLR9 φάνηκε να έχει ισχυρή επίδραση στην αύξηση της έκφρασης του CD86 στις «μεταλλαγμένες» περιπτώσεις ΧΛΛ, ενώ δεν είχε παρόμοιο αποτέλεσμα στις «αμετάλλακτες» περιπτώσεις. Αντιθέτως, διέγερση του TLR7 με imiquimod είχε ως αποτέλεσμα την έντονη αύξηση της έκφρασης του CD25 στις «αμετάλλακτες», αλλά όχι στις «μεταλλαγμένες» περιπτώσεις ΧΛΛ. Κατόπιν εστιάσαμε στα υποσύνολα #4 και #1. Συγκρίνοντας περιπτώσεις του υποσυνόλου #4 με όλες τις άλλες περιπτώσεις που έφεραν μεταλλαγμένα IGHV γονίδια, καθώς και με τις περιπτώσεις που έφεραν το IGHV4-34 γονίδιο σε μη- στερεότυπες αναδιατάξεις, διαπιστώσαμε ότι η διέγερση των TLR1/2, TLR2/6 και NOD2 έχει πολύ ισχυρότερη επίδραση όσον αφορά την αύξηση του CD25 ή/και του CD86 στο υποσύνολο #4. Επιπλέον, 6/7 περιπτώσεις από το υποσύνολο αυτό ανταποκρίνονταν λειτουργικά και στους τρεις συνδέτες - Pam3CSK4, MALP-2 και MDP. Θα μπορούσε λοιπόν κανείς να υποθέσει ότι αυτό το μοτίβο TLR/NLR λειτουργικότητας στο υποσύνολο #4 αντιστοιχεί σε κάποιον κοινό αντιγονικό ερεθισμό. Όταν συγκρίναμε το υποσύνολο #4 με το υποσύνολο #1, διαπιστώσαμε ότι η διέγερση των TLR9, TLR1/2, TLR 2/6 και NOD2 δεν είχε καμιά επίδραση όσον αφορά την έκφραση του CD86 στο υποσύνολο #1. Τουναντίον, η διέγερση του TLR7 αύξησε σημαντικά την έκφραση του CD25, σε έντονη αντίθεση με το υποσύνολο #4. Βάσει αυτών θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι πίσω από αυτά τα ξεχωριστά προφίλ λειτουργικότητας των ΤLR/NLR στα υποσύνολα #4 και #1 κρύβονται διαφορετικοί παθογόνοι μικροοργανισμοί. Όλα τα παραπάνω μπορούν να θεωρηθούν ως επιπρόσθετη απόδειξη του πόσο ετερογενής είναι η ΧΛΛ, τόσο σε μοριακό όσο και σε λειτουργικό επίπεδο. Θα μπορούσε άραγε η σηματοδότηση μέσω των TLR/NLR να λειτουργεί ως μη-ειδική διέγερση για τα ΧΛΛ κύτταρα, και αν ναι, πόσο μη-ειδική είναι; Διαφορετικά προφίλ TLR/NLR λειτουργικότητας μεταξύ υποσυνόλων πιθανώς αντιστοιχούν σε διαφορετικά αντιγονικά στοιχεία και ενδέχεται να χρήζουν διαφορετικής θεραπευτικής προσέγγισης όσον αφορά TLR αγωνιστές ή ανταγωνιστές. Άλλα καταληκτικά σημεία της TLR/NLR σηματοδότησης, όπως απόπτωση και πολλαπλασιασμός, χρειάζεται επίσης να διερευνηθούν προκειμένου να κατανοήσουμε καλύτερα πώς λειτουργούν αυτά τα μονοπάτια στη ΧΛΛ και πώς μπορούν να αξιοποιηθούν από θεραπευτική σκοπιά.Background: Mature B cells recognize antigens through the B cell receptor (BCR) in a specific way and through Toll-like receptors (TLRs) and Nod-like receptors (NLRs) in a costimulatory manner. Plenty of evidence supports a role for antigenic stimulation in the natural history of chronic lymphocytic leukemia (CLL). While BCR signaling has extensively been studied, little is known regarding the function of TLRs and NLRs in CLL cells. Design and methods: We used a series of 67 patients, selected with an intentional bias for cases assigned to two different subsets with stereotyped BCRs, namely subsets #1 and #4. We stimulated negatively isolated CLL cells with specific ligands for all TLRs/NLRs found to be expressed in B cells and measured by flow cytometry the upregulation of CD25 and CD86 expression as a marker of NF-κB activation. We compared our findings among CLL subgroups based on IGHV mutational status, IGHV gene usage and BCR stereotypy. Results: TLR9 was functional in practically all cases. TLR1/2, TLR2/6 and NOD2 were functional in most cases with concordant functionality in different cases. TLR7 was functional in fewer cases and responded only to imiquimod, but not loxoribine. Moreover, TLR9 upregulated CD86 expression only in “mutated” CLL cases while TLR7 upregulated CD25 expression only in “unmutated” CLL cases. Finally, TLR1/2, TLR2/6 and NOD2 stimulation had a much stronger effect in CD25/86 upregulation in subset #4 cases when compared to all other “mutated” cases or cases carrying the IGHV4-34 gene in heterogeneous rearrangements. When subset #4 was compared to subset #1, we found that TLR9, TLR1/2, TLR 2/6 and NOD2 stimulation had no effect in CD86 expression in subset #1. Instead, TLR7 stimulation strongly induced CD25 upregulation, in sharp contrast with subset #4. Conclusions: TLRs and NLRs are functional in CLL cells, yet in a heterogeneous fashion. Their stimulation has a pleiotropic effect on the upregulation of costimulatory molecules, depending on the IGHV mutational status. Patterns of TLR/NLR functionality can be recognized among CLL subsets with distinct stereotyped BCRs, offering hints for the nature of the antigenic drive

Ontogenesis of chronic lymphocytic leukemia: immunogenetic evidence

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common adult leukemia in the Western world. It is an incurable disease, yet very heterogeneous in terms of clinical course and outcome, most probably reflecting underlying biological heterogeneity. Over the last decades, it became obvious that CLL is subdivided in categories with distinct biological characteristics, regarding both the genomic and epigenetic profile (however without certain defects being detected in a large proportion of patients), as well as structural and signaling features of the clonotypic B-cell receptor immunoglobulin (BcR IG)247.Immunogenetic analysis of the clonotypic BcR IG has proved to be instrumental, not only for understanding the pathogenesis of CLL but also for defining clinical subgroups with strikingly different behavior and outcome. That said, the full potential of the IG molecule was not immediately realized, rather initial studies62-64 set in action a train of events culminating with the current notion that CLL is an antigen-driven disease74,76,100. Nowadays, the successful development of drugs targeting the BcR signaling pathway is revolutionizing CLL therapeutics214,216.Besides BcR signaling, CLL clones appear to actively interact with their microenvironment, receiving prosurvival and proliferation signals while at the same time efficiently escaping immune surveillance217,219. Immunomodulatory drugs acting at the level of the immune synapse between clonal B cells and their cognate T cells are currently being tested in clinical trials with promising results218,231.The immunogenetic approach of CLL pathogenesis needs to be able to also explain the existence of CLL-like monoclonal B-cell lymphocytosis (MBL). The term describes the presence of a clonal B cell expansion with CLL immunophenotype in the peripheral blood, at a size that does not reach the consensus cut-off for CLL diagnosis (i.e. <5000 clonal B cells/μL). The incidence of CLL-like MBL in the general population is ~10% and rises even further with age, or when more sophisticated flow cytometry protocols are applied. It is generally perceived as a premalignant condition of CLL, as it progresses to CLL requiring treatment at a 1-2%/year rate154. However, if MBL cells are CLL progenitors, why don't all MBL progress to CLL?We investigated CLL ontogenesis from an immunogenetic point of view, at three separate directions: (i) BcR IG immunoprofiling in MBL and comparison to CLL (especially early-stage disease), (ii) BcR IG immunoprofiling of IG-switched CLL in order to examine its ontogenetic relation to the common IgM/IgD variant, and, (iii) T-cell receptor (TR) immunoprofiling in order to gain insight into the possible role of antigen in the selection and activation of cognate T cells. We performed a detailed immunogenetic profiling of 333 CLL-like MBL cases (60 LC and 273 HC). Low-count (LC) and high-count (HC) MBL had distinct IG gene repertoires, whereas the HC-MBL IG gene repertoire exhibited clear similarities to early-stage CLL (CLL Rai stage 0, CLL-0). Furthermore, we sought for the expression of stereotyped BcR IG through a cluster analysis of the MBL sequences together with all CLL sequences from our cohort and non-CLL IG sequences retrieved from the IMGT/LIGM-DB sequence database. Overall, only 5.5% LC-MBL rearrangements could be clustered with other sequences. In contrast, HC-MBL included a significantly higher frequency of ‘CLL-specific’ BcR stereotypes, with 23.3% of cases clustering together with either MBL or CLL cases. This frequency was similar to that observed in CLL-0 (20.2%). Collectively, the frequency of BcR IG stereotypy seemed to increase in parallel with the absolute count of CLL-like cells, starting with 5.5% in LC-MBL, raising to 23.3-20.2% in HC MBL/CLL-0 and peaking at 30.4% in the entire CLL cohort. Overall, these findings suggest that LC-MBL is not a true premalignant condition, but rather the result of chronic antigenic stimulation or immune senescence. In contrast, HC-MBL is just a step behind early-stage CLL, requiring either additional genetic hits or simply time to cross the numerical cut-off that discriminates it from CLL. Therefore, the identification of molecular biomarkers that may predict progression of HC MBL/CLL-0 into CLL requiring treatment is strongly warranted.Next, we performed a comprehensive immunogenetic comparison of 169 IgG-switched CLL patients (G-CLL) versus 1087 IgM/IgD CLL patients (classic MD-variant, MD-CLL). The IG gene repertoire was significantly different among G-CLL and MD-CLL, with overrepresentation of the IGHV4-34 and IGHV4-39 genes and underrepresentaion of the IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 and IGHV3-48 genes, respectively. G-CLL included significantly more cases with mutated IGHV genes compared to MD-CLL, and significantly more MD-CLL cases carried BcR IGs with no SHM compared to G-CLL. The extreme skewing of the G-CLL repertoire merely reflected the fact that almost one-third of all cases concerned three CLL subsets: mutated stereotyped subsets #4 and #16 utilizing the IGHV4-34 gene, and truly unmutated subset #8, utilizing the IGHV4-39 gene (18.3%, 4%, and 7.3% of all G-CLL, respectively).These subsets, especially subsets #4 and #8, are polar opposites in terms of prognosis, with subset #4 cases exhibiting particularly indolent disease whereas subset #8 cases experience an aggressive disease course often complicated by Richter’s syndrome. In clear contrast to these 3 subsets utilizing the IGHV4-34 and IGHV4-39 genes, all major CLL subsets utilizing the IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 and IGHV3-48 genes were exclusively represented in MD-CLL. Even when restricting the comparison solely to cases with mutated BcR IGs, G-CLL still exhibits an overall distinct immunogenetic profile from MD-CLL, thus prompting speculations about distinct cell of origin and/or distinct immune triggering and raising questions regarding the timing of CSR in regards to malignant transformation21. That said, the paradigmatic case of truly unmutated, G-switched subset #8 suggests that CSR and SHM may occur independently in CLL. Finally, considering the critical role of antigenic stimulation in CLL pathogenesis, we sought to gain insight into the immune pathways shaping the T-cell repertoire in CLL. Our preliminary approach entailed classic subcloning techniques, followed by Sanger sequencing. We analyzed 58 CLL patients, selected upon their clonotypic BcR IG molecular characteristics so as to represent major stereotyped CLL subsets (namely subsets #1, #2, and #4), where the CLL clone is most evidently selected by antigen. Our study revealed skewed TR repertoire and oligoclonality. Moreover, we identified common T-cell clonotypes among different patients, alluding to selection by a shared antigenic elements. However, low-throughput methods such as classic subcloning, despite widely used, are inherently limited in describing other than monoclonal immune repertoires, thus precluding definite conclusions. Therefore, we aimed to advance our analytical depth by employing high-throughput, next-generation sequencing techniques, in order to obtain a comprehensive profile of the T-cell repertoire in CLL. Considering PCR-based NGS limitations, we followed a strict experimental approach including multiple types of controls, and we developed in-house, purpose-built bioinformatics tools for the management, curation and interpretation of the produced (big) data. In total, 32 CLL patients were analyzed. Again, we focused on patients assigned to major stereotyped subsets (namely subsets #1, #2, and #4), but we also included patients expressing heterogeneous clonotypic BcR IGs (mutated and unmutated), in order to seek for T-cell immunogenetic signatures that may be ubiquitous in CLL. The study confirmed TR repertoire skewing, with oligoclonality that came in sharp contrast to the polyclonal profile of age-matched healthy controls, alluding to antigenic selection. Longitudinal analysis showed that T-cell clones persist and expand over time, suggesting a persistent antigenic drive. Moreover, the identification of shared clonotypes among different patients, most specially patients assigned to the same stereotyped subset, indicates common antigenic stimulation, perhaps in a CLL subset-specific context.How could all these pieces of information contribute in a plausible scenario for CLL ontogenesis? There is no doubt that many aspects of disease pathogenesis remain elusive or debatable. However, we could postulate that, in a premalignant phase, B cells with or without genetic predisposition for unrestrained clonal expansion are subjected to persistent stimulation by exogenous or endogenous antigens and are driven to oligo/polyclonal expansion. In this context, they may undergo SHM/CSR depending on their origin (B2, B1, marginal zone B cells?) and/or the nature of antigenic triggering, and while they proliferate, they may acquire genetic lesions that translate to aberrant (i.e. CLL) phenotype. Thereby they enter the LC-MBL state, which remains stable over time unless further genetic/epigenetic hits and/or the functional properties of the clonotypic BcR IG (e.g. polyreactivity or capability of autonomous cell signaling through homotypic BcR interactions) lead to HC-MBL, which, given time and appropriate microenvironmental signals will progress to CLL requiring treatment.Η CLL είναι η συχνότερη λευχαιμία των ενηλίκων στη Δύση. Πρόκειται για ανίατη πάθηση, ωστόσο πολύ ετερογενή ως προς την κλινική πορεία και την απάντηση στη θεραπεία. Αυτή η κλινική ετερογένεια φαίνεται να συνδέεται με ετερογένεια σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο. Η έρευνα των τελευταίων ετών αποκάλυψε ότι η CLL διακρίνεται σε υποκατηγορίες με ξεχωριστά βιολογικά χαρακτηριστικά που αφορούν στο γενωμικό και επιγενωμικό προφίλ (χωρίς ωστόσο να υπάρχουν συγκεκριμένες βλάβες που χαρακτηρίζουν μεγάλο ποσοστό ασθενών), αλλά και σε δομικές/σηματοδοτικές ιδιαιτερότητες του κλωνοτυπικού Β-κυτταρικού υποδοχέα (B-cell receptor, BcR)247.Η ανοσογενετική ανάλυση των κλωνοτυπικών BcR στη CLL υπήρξε αποκαλυπτική για την παθογένεια της νόσου. Η έντονη επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών62, η διαφορετική πρόγνωση των ασθενών ανάλογα με την κατάσταση μεταλλάξεων των γονιδίων της μεταβλητής περιοχής της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών (IGHV)63,64 και, κυρίως, η ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με παρόμοιους, στερεότυπους BcR (30% του συνόλου των ασθενών με CLL)74,76,100, αποτελούν ισχυρές ενδείξεις επιλογής του κλώνου από αντιγόνο(-α), χωρίς ωστόσο να έχει διευκρινιστεί η φύση αυτών των αντιγόνων, ούτε το πού, πότε και για πόσο διάστημα επιδρούν. Αυτές οι παρατηρήσεις αποτέλεσαν τη βάση για την πρόσφατη ανάπτυξη και εφαρμογή στην κλινική πράξη βιολογικών θεραπειών που στοχεύουν το σηματοδοτικό μονοπάτι του ΒcR, με θεαματικά αποτελέσματα214,216.Εκτός από τη σηματοδότηση μέσω του BcR, ο λευχαιμικός κλώνος της CLL φαίνεται να αλληλεπιδρά ποικιλοτρόπως με το μικροπεριβάλλον του προκειμένου να εκμεταλλευτεί σήματα επιβίωσης και πολλαπλασιασμού και ταυτόχρονα να αποφύγει την ανοσοεπιτήρηση217,219. Ανοσοτροποποιητικά φάρμακα που δρουν στο επίπεδο της άνοσης σύναψης μεταξύ Β και Τ λεμφοκυττάρων δοκιμάζονται σήμερα σε κλινικές μελέτες, με υποσχόμενα αποτελέσματα218,231.H ανοσολογική προσέγγιση της CLL πρέπει να μπορεί να ερμηνεύσει και την ύπαρξη της CLL-like μονοκλωνικής Β λεμφοκυττάρωσης (CLL-like monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL). Ο όρος περιγράφει την παρουσία κλωνικού Β λεμφοκυτταρικού πληθυσμού με τυπικό ανοσοφαινότυπο CLL στο περιφερικό αίμα, με μέγεθος μικρότερο από το απαιτούμενο για τη διάγνωση της CLL, δηλαδή <5000 κλωνικά Β λεμφοκύτταρα/μL. Η CLL-like MBL είναι οντότητα συχνή στο γενικό πληθυσμό, με επίπτωση ~10% η οποία αυξάνει με την ηλικία και με την ευαισθησία της μεθόδου ανίχνευσης και θεωρείται προκαρκινική κατάσταση της CLL, επειδή μεταπίπτει σε CLL που απαιτεί θεραπεία με ρυθμό 1-2% ανά έτος154. Αν όμως τα κλωνικά κύτταρα της MBL αντιστοιχούν σε πρόγονους κυττάρων CLL, γιατί δε μεταπίπτουν όλες οι περιπτώσεις MBL σε CLL;Διερευνήσαμε την οντογένεση της CLL από ανοσογενετική σκοπιά, κινούμενοι σε τρεις άξονες: (i) ανάλυση του ρεπερτορίου των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στην MBL, προκειμένου να διαπιστωθούν ανοσογενετικές ομοιότητες ή διαφορές με τη CLL και μάλιστα τη CLL πρώιμου σταδίου (CLL-0), (ii) ανάλυση της CLL με εναλλαγή ισοτύπου, μια ειδική υποκατηγορία CLL, προκειμένου να διερευνηθεί αν η εναλλαγή ισοτύπου συνοδεύεται κι από άλλα ειδικά ανοσογενετικά χαρακτηριστικά που μπορεί να προσανατολίσουν ως προς το είδος αλληλεπίδρασης με το αντιγόνο(-α), και (iii) μελέτη του ρεπερτορίου των Τ κυτταρικών υποδοχέων (TR) στα Τ λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ, προκειμένου να διερευνηθεί η αλληλεπίδρασή τους με (αλλο-, αυτο-, ογκο-)αντιγόνα. Μελετήθηκαν 333 περιπτώσεις CLL-like MBL από συνεργαζόμενα κέντρα Ελλάδας, Ευρώπης και Η.Π.Α (60 με LC-MBL και 273 με HC-MBL). To ρεπερτόριo των γονιδίων IG διέφερε μεταξύ LC-MBL και HC-MBL. Ωστόσο, το ρεπερτόριο των γονιδίων IG της HC-MBL προσομοίαζε εκείνο της CLL πρώιμου κλινικού σταδίου (Rai 0). Επιπλέον, αναζητήσαμε έκφραση στερεότυπων BcR IGs εφαρμόζοντας ανάλυση ομαδοποίησης στο σύνολο των αλληλουχιών MBL, CLL, καθώς και των αλληλουχιών που ανασύρθηκαν από τη δημόσια βάση δεδομένων IMGT/LIGM-DB. Μόλις 5.5% των αναδιατάξεων LC-MBL ομαδοποιήθηκαν με άλλες αλληλουχίες, που προέρχονταν από ασθενείς με CLL, άλλα λεμφοϋπερπλαστικά ή αυτοάνοσα νοσήματα και συνεπώς χαρακτηρίστηκαν ως "κοινές" (public) στερεότυπες BcR IG. Αντίθετα, στη HC-MBL ανιχνεύθηκε σαφώς μεγαλύτερη συχνότητα ειδικών για τη CLL στερεοτύπων BcR IGs, με 23.3% των περιπτώσεων να φέρουν ταυτόσημες BcR IGs είτε με άλλες περιπτώσεις HC-MBL είτε με περιπτώσεις CLL. Μάλιστα, αυτή η συχνότητα ήταν παρόμοια με την αντίστοιχη για τη CLL Rai-0 (20.2%). Συνολικά, παρατηρήθηκε βαθμιαία αύξηση της συχνότητας στερεοτυπίας που ακολουθεί την αύξηση του απόλυτου αριθμού των κλωνικών Β κυττάρων, ξεκινώντας με 5.5% στη LC-MBL, αυξανόμενη σε 23.3-20.2% στη HC-MBL/CLL Rai-0 και τελικά κορυφούμενη σε 30.4% στη CLL όλων των σταδίων. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν πως η LC-MBL δεν αντιστοιχεί σε πραγματική προκαρκινική κατάσταση, αντίθετα μπορεί να αποτελεί επιφαινόμενο χρόνιου αντιγονικού ερεθισμού ή ανοσολογικής γήρανσης. Από την άλλη μεριά, η HC-MBL παρουσιάζει μεγάλες ανοσογενετικές ομοιότητες με τη CLL-, και πιθανώς αντιστοιχεί σ' ένα πρωιμότερο στάδιο που χρειάζεται είτε επιπρόσθετες γενετικές βλάβες είτε απλά περισσότερο χρόνο για να ξεπεράσει το αριθμητικό -και όχι βιολογικό- κατώφλι των 5000 κλωνικών Β κυττάρων/μL αίματος. H αναγνώριση μοριακών δεικτών ικανών να προβλέψουν την εξέλιξη της HC-MBL/CLL Rai-0 σε CLL που απαιτεί θεραπεία θα είχε ιδιαίτερη κλινική σημασία.Στη συνέχεια, μελετήσαμε το ανοσογενετικό προφίλ 169 ασθενών με CLL γάμμα ισοτύπου (G-CLL) σε σχέση με 1087 ασθενείς με κλασική CLL χωρίς εναλλαγή ισοτύπου (ΜD-CLL). Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV διέφερε σημαντικά μεταξύ G-CLL και MD-CLL, με υπερεκπροσώπηση των γoνιδίων IGHV4-34 και IGHV4-39, και υποεκπροσώπηση των γονιδίων IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 και IGHV3-48, αντιστοίχως. Η G-CLL περιλάμβανε σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό περιπτώσεων με μεταλλαγμένα γονίδια IGHV σε σχέση με την MD-CLL. Αντίθετα, η MD-CLL περιλάμβανε σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό περιπτώσεων με πλήρως αμετάλλακτα γονίδια IGHV (100% ταυτότητα με τη βλαστική σειρά) σε σχέση με τη G-CLL. Η αναζήτηση ειδικών για τη CLL στερεότυπων BcR IGs αποκάλυψε πως η ακραία επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου της G-CLL οφείλεται στο γεγονός ότι σχεδόν το 1/3 των περιπτώσεων αφορά σε ασθενείς που κατατάσσονται σε τρία συγκεκριμένα στερεότυπα υποσύνολα: #4 και #16, που χρησιμοποιούν το γονίδιο IGHV4-34 με SHMs, και #8, που χρησιμοποιεί το γονίδιο IGHV4-39 σε πλήρως αμετάλλακτη μορφή (18.3%, 4%, και 7.3% της G-CLL, αντιστοίχως). Αυτά τα υποσύνολα, ιδίως το υποσύνολο #4 και το υποσύνολο #8, έχουν πολύ διαφορετική πρόγνωση, με τους ασθενείς του υποσυνόλου #4 να ακολουθούν εξαιρετικά ήπια κλινική πορεία και τους ασθενείς του υποσυνόλου #8 να εμφανίζουν ιδιαίτερα επιθετική νόσο που συχνά επιπλέκεται με εκτροπή σε λέμφωμα υψηλής κακοήθειας (σύνδρομο Richter). Σε σαφή αντίθεση με τα στερεότυπα υποσύνολα που χρησιμοποιούν τα γονίδια IGHV4-34 και IGHV4-39, όλα τα πολυπληθή στερεότυπα υποσύνολα που χρησιμοποιούν τα γονίδια IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 και IGHV3-48 παρατηρήθηκαν αποκλειστικά στην MD-CLL. H G-CLL χαρακτηρίζεται από ειδική ανοσογενετική υπογραφή σε σχέση με την MD-CLL, ακόμη και όταν η σύγκριση περιοριστεί σε περιπτώσεις με μεταλλαγμένες BcR IGs. Αυτό το γεγονός υπαινίσσεται διαφορετική οντογενετική προέλευση ή/και άνοση διέγερση της G-CLL συγκριτικά με την κοινή ΙgM/D ποικιλία και υποκινεί ερωτήματα σχετικά με τη χρονική ακολουθία εναλλαγής ισοτύπου και κακοήθους εξαλλαγής.21 Σε κάθε περίπτωση, η υποδειγματική περίπτωση του στερεότυπου υποσυνόλου #8 δείχνει πως οι διεργασίες CSR και SHM μπορεί να συμβαίνουν ανεξάρτητα στη CLL.Τέλος, λαμβάνοντας υπόψη τον κρίσιμο ρόλο που φαίνεται να παίζει το αντιγόνο(-α) στη φυσική ιστορία του CLL κλώνου, διερευνήσαμε τις άνοσες επιδράσεις που διαμορφώνουν το ρεπερτόριο των Τ λεμφοκυττάρων στη CLL. Η αρχική, προκαταρκτική προσέγγιση αφορούσε χαρακτηρισμό του Τ ρεπερτορίου με μεθόδους κλασικής υποκλωνοποίησης και αλληλούχησης κατά Sanger. Aναλύθηκαν 58 ασθενείς με CLL που επιλέχθηκαν κυρίως με βάση την κατάταξή τους σε γνωστά, καλά χαρακτηρισμένα στερεότυπα υποσύνολα της CLL (υποσύνολα #1, #2 και#4), με το σκεπτικό ότι η στερεοτυπία αποτελεί την πιο ισχυρή ένδειξη επιλογής του CLL κλώνου από αντιγόνο. Η μελέτη ανέδειξε επιλεκτικότητα και ολιγοκλωνικότητα του Τ ρεπερτορίου στη CLL, καθώς και κοινούς Τ κλωνοτύπους μεταξύ διαφορετικών ασθενών, ένδειξη επιλογής από κοινό αντιγόνο. Ωστόσο, οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν, παρότι καθιερωμένες, αποδίδουν χαμηλής κλίμακας ανάλυση ρεπερτορίων που δεν είναι αμιγώς μονοκλωνικά, γεγονός που εμπόδιζε την εξαγωγή οριστικών συμπερασμάτων. Έτσι, επιχειρήσαμε να εμβαθύνουμε την ανάλυσή μας αξιοποιώντας τεχνικές μαζικής αλληλούχησης νέας γενιάς (next-generation sequencing) προκειμένου να χαρτογραφήσουμε ενδελεχώς το ρεπερτόριο των Τ λεμφοκυττάρων στη CLL. Επειδή η αλληλούχηση προϊόντων PCR με NGS αποτελεί καινοτόμο τεχνική στον τομέα της ανοσογενετικής με συγκεκριμένους περιορισμούς και εγγενείς αδυναμίες, επιλέξαμε μια συστηματική, αυστηρή προσέγγιση συμπεριλαμβάνοντας πολλών ειδών εσωτερικά και εξωτερικά controls, και αναπτύξαμε εξειδικευμένα βιοπληροφορικά εργαλεία για τη διαχείριση, τον ποιοτικό έλεγχο και την ερμηνεία των παραγόμενων δεδομένων. Συνολικά αναλύθηκαν 32 ασθενείς με CLL. Συμπεριλήφθηκαν ασθενείς που κατατάσσονταν σε στερεότυπα υποσύνολα (υποσύνολα #1, #2 και#4), αλλά και ασθενείς με ετερογενείς BcR IG (μεταλλαγμένες ή αμετάλλακτες), ώστε να διαπιστώσουμε ανοσογενετικά χαρακτηριστικά του Τ ρεπερτορίου που είναι κοινά για όλη τη CLL. Η μελέτη επιβεβαιώνει την επιλεκτικότητα του Τ ρεπερτορίου στη CLL, με ευρήματα ολιγοκλωνικότητας που έρχονται σε αντίθεση με το πολυκλωνικό προφίλ υγιών μαρτύρων αντίστοιχης ηλικίας και παραπέμπουν σε επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων από αντιγόνο(-α). Η ανάλυση διαχρονικών δειγμάτων έδειξε ότι ο αντιγονικός ερεθισμός παραμένει στο χρόνο, οδηγώντας τους αντίστοιχους Τ-κυτταρικούς κλώνους σε περαιτέρω έκπτυξη. Εξάλλου, η διαπίστωση κοινών Τ κλωνοτύπων μεταξύ ασθενών, ιδίως αυτών που κατατάσσονται στο ίδιο στερεότυπο υποσύνολο, αναδεικνύει μοριακές υπογραφές ειδικές για τη CLL, με προεκτάσεις για τη διερεύνηση μηχανισμών άρσης της ανοχής των Τ λεμφοκυττάρων. Πώς συνοψίζονται όλα τα παραπάνω σ' ένα κοινό παθογενετικό σενάριο για τη CLL; Σίγουρα υπάρχουν πολλά σημεία της οντογένεσης της νόσου που παραμένουν σκοτεινά ή αμφιλεγόμενα. Θα μπορούσαμε όμως να υποθέσουμε ότι σε μια προνεοπλασματική φάση, Β κύτταρα με ή χωρίς γενετική προδιάθεση για ανεξέλεγκτο κλωνικό πολλαπλασιασμό δέχονται εμμένοντα αντιγονικό ερεθισμό, είτε από εξωγενή είτε από ενδογενή αντιγόνα, και οδηγούνται σε ολιγο- ή πολυκλωνική έκπτυξη. Στα πλαίσια αυτά, μπορεί να υποβάλλονται σε SHM/CSR ανάλογα με την προέλευσή τους (κλασικά Β2 κύτταρα, Β1 κύτταρα, Β κύτταρα οριακής ζώνης;) ή/και ανάλογα με τη φύση της αλληλεπίδρασης με το αντιγόνο, ενώ κατά τον κλωνικό πολλαπλασιασμό τους ίσως αποκτούν γενετικές βλάβες που σχετίζονται με το φαινότυπο της CLL. Έτσι, μπορεί να προκύψει η LC-MBL, που παραμένει σταθερή στο χρόνο, εκτός αν επιπρόσθετες γενετικές/επιγενετικές αλλαγές ή οι ίδιες οι λειτουργικές ιδιότητες της BcR IG (π.χ. πολυαντιδραστικότητα ή/και ικανότητα ομότυπων αλληλεπιδράσεων για αυτόνομη σηματοδότηση μέσω του BcR) οδηγήσουν γρήγορα στη φάση της HC-MBL, η οποία εμφανίζει κακόηθες δυναμικό και, με το πέρασμα του χρόνου και εφόσον επιδράσουν κατάλληλα σήματα μέσω του BcR ή/και από το μικροπεριβάλλον, θα μεταπέσει σε CLL που απαιτεί θεραπεία