Splicing functional analysis of DNA variants within the breast cancer type 2 susceptibility gene (BRCA2), and its effect on hereditary breast and ovarian cancaer (HBOC): A hybrid minigene approach

We aim to assess exon 17 splicing variants involvement in the genetic susceptibility to HBOC, by a bioinformatic analysis and mRNA functional assays through a hybrid minigene strategy. 1) To select the candidate variants of the functional analysis based on a bioinformatic prediction, using online databases as BIC and algorithms as the presented on the Human Splicing Finder Database (HSF). 2) To construct and validate a wild type minigene that contains the 14-20 exons of BRCA2 and can be used as a vector of the functional analysis. 3) To generate each of the selected BRCA2 variants within the minigene. 4) To perform a functional analysis of the variants (driven in eukaryote cells), in order to evaluate its effect on the mRNA splicing. 5) To characterize the new-generated splicing patterns. 6) To contribute to the understanding of the HBOC genetic predisposition spectrum.Máster en Investigación Biomédic

Functional classification of DNA variants by hybrid minigenes: identification of 30 spliceogenic variants of BRCA2 exons 17 and 18

Mutation screening of the breast cancer genes BRCA1 and BRCA2 identifies a large fraction of variants of uncertain clinical significance (VUS) whose functional and clinical interpretations pose a challenge for genomic medicine. Likewise, an increasing amount of evidence indicates that genetic variants can have deleterious effects on pre-mRNA splicing. Our goal was to investigate the impact on splicing of a set of reported variants of BRCA2 exons 17 and 18 to assess their role in hereditary breast cancer and to identify critical regulatory elements that may constitute hotspots for spliceogenic variants. A splicing reporter minigene with BRCA2 exons 14 to-20 (MGBR2_ ex14-20) was constructed in the pSAD vector. Fiftytwo candidate variants were selected with splicing prediction programs, introduced in MGBR2_ ex14-20 by site-directed mutagenesis and assayed in triplicate in MCF-7 cells. Wild type MGBR2_ ex14-20 produced a stable transcript of the expected size (1,802 nucleotides) and structure (V1-[BRCA2_ exons_ 14-20]-V2). Functional mapping by microdeletions revealed essential sequences for exon recognition on the 3 ' end of exon 17 (c. 79447973) and the 5 ' end of exon 18 (c. 7979-7988, c. 7999-8013). Thirty out of the 52 selected variants induced anomalous splicing in minigene assays with > 16 different aberrant transcripts, where exon skipping was the most common event. A wide range of splicing motifs were affected including the canonical splice sites (15 variants), novel alternative sites (3 variants), the polypyrimidine tract (3 variants) and enhancers/silencers (9 variants). According to the guidelines of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG), 20 variants could be classified as pathogenic (c. 7806-2A > G, c. 7806-1G > A, c. 7806-1G > T, c. 7806-1_ 7806-2dup, c. 7976+ 1G > A, c. 7977-3_ 7978del, c. 7977-2A > T, c. 7977-1G > T, c. 7977-1G > C, c. 8009C > A, c. 8331+ 1G > T and c. 8331+ 2T > C) or likely pathogenic (c. 78069T > G, c. 7976G > C, c. 7976G > A, c. 7977-7C > G, c. 7985C > G, c. 8023A > G, c. 8035G > T and c. 8331G > A), accounting for 30.8% of all pathogenic/likely pathogenic variants of exons 17-18 at the BRCA Share database. The remaining 8 variants (c. 7975A > G, c. 7977-6T > G, c. 7988A > T, c. 7992T > A, c. 8007A > G, c. 8009C > T, c. 8009C > G, and c. 8072C > T) induced partial splicing anomalies with important ratios of the full-length transcript (>= 70%), so that they remained classified as VUS. Aberrant splicing is therefore especially prevalent in BRCA2 exons 17 and 18 due to the presence of active ESEs involved in exon recognition. Splicing functional assays with minigenes are a valuable strategy for the initial characterization of the splicing outcomes and the subsequent clinical interpretation of variants of any disease-gene, although these results should be checked, whenever possible, against patient RNA

Ensayos sobre aplicación de la Teoría del Estado en las algunas culturas del Perú antiguo

Investigations of State Theory on the cultures of ancient Peru.Capítulos de libro con investigaciones de Teoría del Estado sobre las culturas del Perú antiguo, realizado por docentes y estudiantes de la Escuela Profesional de Derecho de la Universidad Nacional del Altiplano de Puno.      

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