ELF3 regulates cotyledon expansion and hypocotyl growth rhythmicity

Tesis doctoral inédita, leída en Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17/07/201

Establecimiento de un sistema de tres híbridos en levadura para buscar la interacción del RNA de la región líder del gen sps1 de arroz con proteínas de Arabidopsis thaliana L.

El gen sps1, que codifica para la Sacarosa Fosfato Sintasa de arroz tiene un 5’UTR (líder) inusualmente largo de 368 nucleótidos, con una estructura secundaria compleja y se ha demostrado con anterioridad que éste ejerce un potenciamiento a nivel de la traducción tanto en condiciones in vitro como in vivo. La regulación postrancripcional ocurre en varios genes mediante la interacción de proteínas con las regiones 5’ o 3’ de los RNA mensajeros, por lo que para determinar la posible interacción de factores proteicos con esta región líder se seleccionó el sistema de tres híbridos de levadura. El sistema de tres híbridos tiene la ventaja de que determina interacciones in vivo y es posible posteriormente determinar la identidad de las proteínas de interacción mediante la secuenciación de los genes que las codifican. Se establecieron las condiciones necesarias para usar este sistema como son: a) Obtención y mantenimiento de la cepa L40-ura3 de Saccharomyces cerevisiae b) Construcción de un vector que genera un RNA híbrido que lleva la región MS2 del fago del mismo nombre fusionada a la región de 368 bases del Líder sps1. Para esto se siguió una estrategia basada en PCR para obtener el fragmento sps1 con sitios de corte específicos, su clonación en pGEM T-easy y su liberación para clonarlo en un vector que lleva la región MS2. c) Análisis estructural del RNA híbrido para determinar su utilidad en el sistema, mediante el uso de un software y las condiciones de temperatura. d) Amplificación de una biblioteca con los cDNA’s de Arabidopsis thaliana fusionados al dominio de activación transcripcional GAL4, obteniendo aproximadamente 75 000 colonias que representan 3 veces el genoma codificante de esta planta. e) Validación de la biblioteca de A. thaliana mediante la liberación de los cDNA’s de los plásmidos por corte con la endonucleasa de restricción EcoRI. f) Se establecieron además las condiciones prácticas y teóricas para realizar el escrutinio de la interacción de RNA’s y proteínas, enfocado a la posible interacción del RNA Líder sps1 con una o más proteínas de la biblioteca de A. thaliana

ELF3-PIF4 interaction regulates plant growth independently of the Evening Complex

7 Pág.The circadian clock plays a pivotal role in the control of Arabidopsis hypocotyl elongation by regulating rhythmic expression of the bHLH factors PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4 and 5 (PIF4 and 5). Coincidence of increased PIF4/PIF5 transcript levels with the dark period allows nuclear accumulation of these factors, and in short days it phases maximal hypocotyl growth at dawn. During early night, PIF4 and PIF5 transcription is repressed by the Evening Complex (EC) proteins EARLY FLOWERING3 (ELF3), EARLY FLOWERING4 (ELF4), and LUX ARRHYTHMO (LUX). While ELF3 has an essential role in EC complex assembly, several lines of evidence indicate that this protein controls plant growth via other mechanisms that are presently unknown. Here, we show that the ELF3 and PIF4 proteins interact in an EC-independent manner, and that this interaction prevents PIF4 from activating its transcriptional targets. We also show that PIF4 overexpression leads to ELF3 protein destabilization, and that this effect is mediated indirectly by negative feedback regulation of photoactive PHYTOCHROME B (phyB). Physical interaction of the phyB photoreceptor with ELF3 has been reported, but its functional relevance remains poorly understood. Our findings establish that phyB is needed for ELF3 accumulation in the light, most likely by competing for CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC1 (COP1)-mediated ubiquitination and the proteasomal degradation of ELF3. Our results explain the short hypocotyl phenotype of ELF3 overexpressors, despite their normal clock function, and provide a molecular framework for understanding how warm temperatures promote hypocotyl elongation and affect the endogenous clock.This work was supported by grant BIO2011-30546 and the CONSOLIDER TRANSPLANTA project from the Spanish MICIIN.Peer reviewe

COP1 dynamics integrate conflicting seasonal light and thermal cues in the control of Arabidopsis elongation

As the summer approaches, plants experience enhanced light inputs and warm temperatures, two environmental cues with an opposite morphogenic impact. Key components of this response are PHYTOCHROME B (phyB), EARLY FLOWERING 3 (ELF3), and CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1). Here, we used single and double mutant/overexpression lines to fit a mathematical model incorporating known interactions of these regulators. The fitted model recapitulates thermal growth of all lines used and correctly predicts thermal behavior of others not used in the fit. While thermal COP1 function is accepted to be independent of diurnal timing, our model shows that it acts at temperature signaling only during daytime. Defective response of cop1-4 mutants is epistatic to phyB-9 and elf3-8, indicating that COP1 activity is essential to transduce phyB and ELF3 thermosensory function. Our thermal model provides a unique toolbox to identify best allelic combinations enhancing climate change resilience of crops adapted to different latitudes.Research has been supported by Spanish MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ and FEDER Una manera de hacer Europa (grant nos. PGC2018-098186-B-100 to P.C., FIS2016-78313-P to S.A., and BIO2017-90056-R/PID2020-119758RB-I00 to S.P.), besides grant BADS, no. PID2019-109320GB-100, to S.A. and P.C, and funding from University of Buenos Aires (grant no. 20020170100505BA to J.J.C.), and Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (grant no. PICT-2019-2019-01354 to J.J.C.). The CNB and CRAG Institutes also received the “Severo Ochoa” Centers of Excellence SEV 2017-0712 (CNB) and CEX2019-000902-S (CRAG) awards from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación.Peer reviewe