Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira

International audienceLeptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira, which also includes free-living saprophyte strains. Many aspects of leptospiral basic biology and virulence mechanisms remain unexplored mainly due to the lack of effective genetic tools available for these bacteria. Recently, the type II CRISPR/Cas system from Streptococcus pyogenes has been widely used as an efficient genome engineering tool in bacteria by inducing double-strand breaks (DSBs) in the desired genomic targets caused by an RNA-guided DNA endonuclease called Cas9, and the DSB repair associated machinery. In the present work, plasmids expressing heterologous S. pyogenes Cas9 in L. biflexa cells were generated, and the enzyme could be expressed with no apparent toxicity to leptospiral cells. However, L. biflexa cells were unable to repair RNA-guided Cas9-induced DSBs. Thus, we used a catalytically dead Cas9 (dCas9) to obtain gene silencing rather than disruption, in a strategy called CRISPR interference (CRISPRi). We demonstrated complete gene silencing in L. biflexa cells when both dCas9 and single-guide RNA (sgRNA) targeting the coding strand of the β-galactosidase gene were expressed simultaneously. Furthermore, when the system was applied for silencing the dnaK gene, no colonies were recovered, indicating that DnaK protein is essential in Leptospira. In addition, flagellar motor switch FliG gene silencing resulted in reduced bacterial motility. To the best of our knowledge, this is the first work applying the CRISPRi system in Leptospira and spirochetes in general, expanding the tools available for understanding leptospiral biology

Prevalence and risk factors for bovine leptospirosis in Mato Grosso do Sul, Brazil

Foi investigada a prevalência de anticorpos antileptospira em fêmeas bovinas com idade igual ou superior a 24 meses, provenientes de 178 rebanhos de 22 municípios do estado de Mato Grosso do Sul, bem como identificados fatores de risco associados à infecção. Foram analisadas 2.573 amostras de soro sangüíneo por meio do teste de soroaglutinação microscópica perante 10 sorovares de leptospira. Títulos iguais ou superiores a 100 para um ou mais sorovares foram detectados em 1.801 fêmeas (98,8%) de 161 (96,5%) rebanhos. O sorovar Hardjo (65,6%) foi apontado como o mais provável, seguido do sorovar Wolffi (12,3%). Os resultados demonstram que a leptospirose bovina se encontra presente em todos os municípios estudados, com alta prevalência, tanto em animais como em rebanhos. Os fatores de risco identificados neste estudo e associados à infecção por bactérias do gênero lepstopira foram o tipo de exploração pecuária de corte e a raça Zebu. _____________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe prevalence of anti-Leptospira spp. antibodies was estimated for female cattle aged 24 months or older. The sample comprised 178 herds from 22 counties in the state of Mato Grosso do Sul, Brazil. The risk factors associated with the presence of infeccion were investigated. A total of 2,573 blood serum samples were tested against 10 leptospira serovars using the microagglutination test (MAT). Titers of 100 or higher for one or more serovars were detected in 1,801 females (98.8%) from 161 herds (96.5%). Serovar Hardjo (65.6%) was the most frequent, followed by serovar Wolffi (12.3%). These results suggest that bovine leptospirosis is widespread in all the counties under study, with a high prevalence both at the animal and the herd level. Beef farms and the Zebu breed were associated to the higher risk of herd infection by leptospiras

Resposta da cultura do milho a modos de aplicação e doses de fósforo, em adubação de manutenção

The most commonly studied phosphorus fertilizer placements in maize crop are scattering and furrow - localized. However, double furrow intermediary application is also possible, and may increase the fertilized soil fraction and fertilization efficiency. This research was carried out to evaluate the effects of fertilizer placement and doses of phosphorus fertilizer under maintainance fertilization of a corn crop, in a Dark-Red Latosol, in Triângulo Mineiro, Uberaba (MG, Brazil), from October 1995 to April 1996. The treatments consisted of the following fertilizer placements (triple superphosphate): broadcasting, single furrow and double furrow and the following doses of 0; 45.0; 67.5; 90.0; 112.5 and 135.0 kg ha-1 of P2O5. Doses of P were estimated based on 0; 0.50; 0.75; 1.00; 1.25; 1.50 time the dose reccomended for maitainance fertilization, 90 kg ha-1 of P2O5. It was found out that the use of increasing P doses increased corn grain yield; the phosphorus fertilizer placements in single furrows and double furrows were more efficient than broadcasting; double furrow application was the most oustanding mode of placement; foliar P content varied from 2.1 to 2.4; 2.1 to 2.7 and from 2.1 to 2.9 g kg-1, respectively, for broadcasting, single furrows and double furrows. Corn yield increased from 0.45 to 3.04 t ha-1 for single furrows and from 0.21 to 4.4 t ha-1 for double furrows.Os modos de adubação fosfatada mais estudados na cultura do milho são relacionados com a aplicação a lanço e a localizada no sulco de semeadura. No entanto, existe a possibilidade da aplicação intermediária, em sulco duplo, que pode aumentar a fração do solo fertilizada e a eficiência da adubação. Com o objetivo de avaliar os efeitos de modos de aplicação e de doses de fertilizante fosfatado em adubação de manutenção, foi realizado este presente trabalho em Latossolo Vermelho-Escuro, na região do Triângulo Mineiro, em Uberaba (MG), com a cultura do milho, no período de outubro de 1995 a abril de 1996. Os tratamentos foram constituídos pelos modos de aplicação do adubo fosfatado (superfosfato triplo), a lanço, sulco simples e sulco duplo, e pelas doses de 0; 45,0; 67,5; 90,0; 112,5 e 135,0 kg ha-1 de P2O5. As doses de P foram estimadas, tomando por base 0; 0,50; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50 vêzes a dose recomendada para a adubação de manutenção, 90 kg ha-1 de P2O5. Verificou-se que: o uso de doses crescentes de P aumentou a produção de grãos de milho; os modos de aplicação do adubo fosfatado em sulco simples e sulco duplo foram mais eficientes que a lanço; dentre os modos de aplicação, destacou-se a aplicação em sulco duplo; o teor foliar de P variou de 2,1 a 2,4 ; 2,1 a 2,7 e de 2,1 a 2,9 g kg-1, respectivamente, para a aplicação a lanço, em sulco simples e em sulco duplo. O incremento na produção do milho foi de 0,45 a 3,04 t ha-1 no sulco simples e de 0,21 a 4,4 t ha-1 no sulco duplo.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Universidade do Estado de São Paulo - UNESP Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Departamento de Solos e AdubosUNESP Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira Departamento de Ciência do Solo e Engenharia RuralUniversidade do Estado de São Paulo - UNESP Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Departamento de Solos e AdubosUNESP Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira Departamento de Ciência do Solo e Engenharia Rura

Human toxocariasis: contribution by Brazilian researchers

In the present paper the main aspects of the natural history of human infection by Toxocara larvae that occasionally result in the occurrence of visceral and/or ocular larva migrans syndrome were reviewed. The contribution by Brazilian researchers was emphasized, especially the staff of the Tropical Medicine Institute of São Paulo (IMT)