Orthogonal Translation Meets Electron Transfer: In Vivo Labeling of Cytochrome c for Probing Local Electric Fields

Cytochrome c (cyt c), a redox protein involved in diverse fundamental biological processes, is among the most traditional model proteins for analyzing biological electron transfer and protein dynamics both in solution and at membranes. Studying the role of electric fields in energy transduction mediated by cyt c relies upon appropriate reporter groups. Up to now these had to be introduced into cyt c by in vitro chemical modification. Here, we have overcome this restriction by incorporating the noncanonical amino acid p-cyanophenylalanine (pCNF) into cyt c in vivo. UV and CD spectroscopy indicate preservation of the overall protein fold, stability, and heme coordination, whereas a small shift of the redox potential was observed by cyclic voltammetry. The C≡N stretching mode of the incorporated pCNF detected in the IR spectra reveals a surprising difference, which is related to the oxidation state of the heme iron, thus indicating high sensitivity to changes in the electrostatics of cyt c.Fil: Völler, Jan. Technishe Universitat Berlin; AlemaniaFil: Biava, Hernan Daniel. Technishe Universitat Berlin; Alemania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Química Rosario; ArgentinaFil: Koksch, Beate. Freie Universitä t Berlin; AlemaniaFil: Hildebrandt, Peter. Technishe Universitat Berlin; AlemaniaFil: Budisa, Nediljko. Technishe Universitat Berlin; Alemani

An optimized protocol for assessment of sputum macrorheology in health and muco-obstructive lung disease

Background: Airway mucus provides important protective functions in health and abnormal viscoelasticity is a hallmark of muco-obstructive lung diseases such as cystic fibrosis (CF). However, previous studies of sputum macrorheology from healthy individuals and patients with CF using different experimental protocols yielded in part discrepant results and data on a systematic assessment across measurement settings and conditions remain limited. Objectives: The aim of this study was to develop an optimized and reliable protocol for standardized macrorheological measurements of airway mucus model systems and native human sputum from healthy individuals and patients with muco-obstructive lung disease. Methods: Oscillatory rheological shear measurements were performed using bovine submaxillary mucin (BSM) at different concentrations (2% and 10% solids) and sputum samples from healthy controls (n = 10) and patients with CF (n = 10). Viscoelastic properties were determined by amplitude and frequency sweeps at 25°C and 37°C with or without solvent trap using a cone-plate geometry. Results: Under saturated atmosphere, we did not observe any temperature-dependent differences in 2% and 10% BSM macrorheology, whereas in the absence of evaporation control 10% BSM demonstrated a significantly higher viscoelasticity at 37°C. Similarly, during the measurements without evaporation control at 37°C we observed a substantial increase in the storage modulus G′ and the loss modulus G″ of the highly viscoelastic CF sputum but not in the healthy sputum. Conclusion: Our data show systematically higher viscoelasticity of CF compared to healthy sputum at 25°C and 37°C. For measurements at the higher temperature using a solvent trap to prevent evaporation is essential for macrorheological analysis of mucus model systems and native human sputum. Another interesting finding is that the viscoelastic properties are not much sensitive to the applied experimental deformation and yield robust results despite their delicate consistency. The optimized protocol resulting from this work will facilitate standardized quantitative assessment of abnormalities in viscoelastic properties of airway mucus and response to muco-active therapies in patients with CF and other muco-obstructive lung diseases

The prognostic effect of cardiac rehabilitation in the era of acute revascularisation and statin therapy : A systematic review and meta-analysis of randomized and non-randomized studies - The Cardiac Rehabilitation Outcome Study (CROS)

BACKGROUND: The prognostic effect of multi-component cardiac rehabilitation (CR) in the modern era of statins and acute revascularisation remains controversial. Focusing on actual clinical practice, the aim was to evaluate the effect of CR on total mortality and other clinical endpoints after an acute coronary event. DESIGN: Structured review and meta-analysis. METHODS: Randomised controlled trials (RCTs), retrospective controlled cohort studies (rCCSs) and prospective controlled cohort studies (pCCSs) evaluating patients after acute coronary syndrome (ACS), coronary artery bypass grafting (CABG) or mixed populations with coronary artery disease (CAD) were included, provided the index event was in 1995 or later. RESULTS: Out of n = 18,534 abstracts, 25 studies were identified for final evaluation (RCT: n = 1; pCCS: n = 7; rCCS: n = 17), including n = 219,702 patients (after ACS: n = 46,338; after CABG: n = 14,583; mixed populations: n = 158,781; mean follow-up: 40 months). Heterogeneity in design, biometrical assessment of results and potential confounders was evident. CCSs evaluating ACS patients showed a significantly reduced mortality for CR participants (pCCS: hazard ratio (HR) 0.37, 95% confidence interval (CI) 0.20-0.69; rCCS: HR 0.64, 95% CI 0.49-0.84; odds ratio 0.20, 95% CI 0.08-0.48), but the single RCT fulfilling Cardiac Rehabilitation Outcome Study (CROS) inclusion criteria showed neutral results. CR participation was also associated with reduced mortality after CABG (rCCS: HR 0.62, 95% CI 0.54-0.70) and in mixed CAD populations. CONCLUSIONS: CR participation after ACS and CABG is associated with reduced mortality even in the modern era of CAD treatment. However, the heterogeneity of study designs and CR programmes highlights the need for defining internationally accepted standards in CR delivery and scientific evaluation

Learning from Embryogenesis—A Comparative Expression Analysis in Melanoblast Differentiation and Tumorigenesis Reveals miRNAs Driving Melanoma Development

Malignant melanoma is one of the most dangerous tumor types due to its high metastasis rates and a steadily increasing incidence. During tumorigenesis, the molecular processes of embryonic development, exemplified by epithelial–mesenchymal transition (EMT), are often reactivated. For melanoma development, the exact molecular differences between melanoblasts, melanocytes, and melanoma cells are not completely understood. In this study, we aimed to identify microRNAs (miRNAs) that promote melanoma tumorigenesis and progression, based on an in vitro model of normal human epidermal melanocyte (NHEM) de-differentiation into melanoblast-like cells (MBrCs). Using miRNA-sequencing and differential expression analysis, we demonstrated in this study that a majority of miRNAs have an almost equal expression level in NHEMs and MBrCs but are significantly differentially regulated in primary tumor- and metastasis-derived melanoma cell lines. Further, a target gene analysis of strongly regulated but functionally unknown miRNAs yielded the implication of those miRNAs in many important cellular pathways driving malignancy. We hypothesize that many of the miRNAs discovered in our study are key drivers of melanoma development as they account for the tumorigenic potential that differentiates melanoma cells from proliferating or migrating embryonic cells

Die Rolle der Argonaut Proteine in der Entstehung und Progression des malignen Melanoms

Das maligne Melanom ist eine bösartige Krebserkrankung der pigmentbildenden Zellen der Haut, den Melanozyten. Die Krankheit ist nahezu immer heilbar wenn der Primärtumor frühzeitig erkannt und vollständig entfernt wird. Das rasche Erkennen des Tumors ist wichtig, da das Melanom bereits in einem frühen Stadium zur Metastasierung neigt. Eine derzeit zugelassene Behandlungsmethode für Patienten mit einem metastasierenden Melanom in Kombination mit einer aktivierenden BRAF Mutation stellt der selektive Inhibitor Vemurafenib dar. Dieser inhibiert das aktivierte Onkogen BRAF(V600E), welches in ca. 50 % aller Melanom-Patienten vorhanden ist und führt dadurch die Tumorzelle in Seneszenz. Allerdings entwickeln Melanom-Patienten mit zunehmender Behandlungsdauer Resistenzen gegen Vemurafenib. Diese Resistenzen und die Eigenschaft des Melanoms, eine hohe Toleranz gegenüber klassischen Chemo- oder Strahlentherapien zu besitzen, unterstreichen die Notwendigkeit für alternative Behandlungsmethoden für Melanom-Patienten. MikroRNAs (miRNAs) könnten einen Angriffspunkt für eine solche Behandlungsmethode darstellen, da sie durch die Regulation der Proteinexpression viele wichtige Funktionen, wie beispielsweise die Proliferation, die Differenzierung und den Metabolismus einer Zelle, steuern. MiRNAs werden transkribiert und anschließend über eine Enzymkaskade bis zur maturen miRNA prozessiert. Eine Proteinfamilie nimmt dabei eine Schlüsselfunktion ein: die Familie der Argonaut (AGO) Proteine. Diese Proteine binden die Duplex aus der maturen miRNA und der zu inhibierenden messenger RNA (mRNA) des miRNA-Zielgens. Im Menschen gehören vier verschiedene AGO Proteine (AGO1-4) dieser Proteinfamilie an. Jedoch ist nur AGO2 in der Lage, die mRNA direkt hydrolytisch zu spalten. Die AGO Proteine 1, 3 und 4 können ebenfalls die Translation des Zielproteins inhibieren, jedoch nicht durch eine direkte Degradation des Gentranskripts. Im ersten Abschnitt dieser Dissertation konnte erstmalig eine deutliche Reduktion aller AGO Proteine im Melanom im Vergleich zu Melanozyten nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich, dass das AGO2 Protein stärker reprimiert wird als die übrigen AGO Proteine. Es konnte zudem festgestellt werden, dass es sich bei der AGO2 Reduktion um ein für das Melanom spezifisches Phänomen handelt, da in anderen Tumorarten keine differenzielle AGO2 Expression nachgewiesen werden konnte. Resultierend aus den primären Ergebnissen, der melanomspezifischen AGO2 Reduktion, beschäftigte sich der zweite Teil dieser Arbeit mit den Konsequenzen dieses Phänomens für die miRNA Prozessierung und deren Einfluss auf die Zelle. Dabei zeigte sich, dass die AGO2 Reduktion für eine erhebliche Verminderung der si- und miRNA Effektivität verantwortlich ist. Mit Hilfe von cDNA-Array Analysen konnte zudem nachgewiesen werden, dass die AGO2 Modulation im Melanom eine sehr große Anzahl an Proteinen beeinflusst, die in vielen wichtigen Zellprozessen involviert sind. Zudem konnte auch eine phänotypische Veränderung in der Migrationsfähigkeit von Melanomzellen aufgrund der AGO2 Reduktion festgestellt werden. Der dritte Teil spiegelt die Suche nach der Ursache der AGO2 Reduktion wieder. Die Änderung der AGO2 Proteinmenge ist nur durch direkte Proteinanalysen zu detektieren, nicht jedoch durch Analysen der Genexpression, was auf einen post-transkriptionellen Regulationsmechanismus hindeutet. Nach dem experimentellen Ausschluss des Proteasom-Systems als AGO2-modulierendes System in Melanomzellen konnte der Nachweis einer AGO2 Reduktion durch miRNAs erbracht werden. Seit ihrer Entdeckung 1993 ist der Erkenntnisstand über miRNAs und deren vielseitiges Regulationsnetzwerk in der Zelle erheblich gewachsen. Seitdem sind miRNAs gewiss auch für einen Einsatz in der Therapie von Krankheiten von großem Interesse. Beispielsweise wird bei der miRNA Replacement Therapie eine tumor-suppressor-miRNA, welche einen Funktionsverlust in der Krebszelle aufweist, durch eine therapeutische miRNA ersetzt. Dieser Therapieansatz ist jedoch vollständig abhängig von einer funktionellen miRNA Prozessierung und somit auch von den AGO Proteinen. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse über die spezifische AGO2 Reduktion im Melanom können daher dazu beitragen die Effektivität der miRNA Replacement Therapie für das maligne Melanom zu steigern