Detection of lactic acid bacteria bacteriocins' genes and their expression in cheese

Nous avons étudié la présence de bactéries lactiques capables de produire des bactériocines dans des fromages traditionnels Slovènes. Dans cinq échantillons de Tolminc (fromage au lait de vache) et quatre échantillons de Kraški ovčji sir (fromage au lait de brebis), nous avons recherché la présence de 19 gènes de bactériocines par PCR. L'ADN a été extrait directement à partir des fromages ainsi qu'à partir de consortia microbiens de ces fromages isolés sur gélose CATC, Rogosa et M17. Nous avons utilisé des tests par diffusion sur gélose pour déterminer l'activité antimicrobienne des consortia sur différentes bactéries indicatrices. L'activité anti-staphylococcique a aussi été déterminée in situ dans du lait et du fromage. L'avantage compétitif des souches productrices de bactériocines a été évalué en effectuant des repiquages successifs des consortia dans du lait. Lors de ces essais, nous avons suivi la présence de différents déterminants génétiques de bactériocines ainsi que l'activité antimicrobienne des consortia. Ces mêmes propriétés ont aussi été déterminées pour des souches individuelles productrices de bactériocines, qui ont été isolées du consortium initial ou de consortia obtenus après propagation dans le lait. La mise en évidence de gènes de bactériocines par PCR dépendait de l'efficacité d'extraction de l'ADN. L'extraction de l'ADN total était plus efficace lorsque l'homogénéisation du fromage était réalisée avec une solution de citrate de sodium. Dans l'ADN issu des fromages et consortia microbiens, nous avons détecté plusieurs gènes de bactériocines. Leur nombre diminuait lors de la propagation dans le lait, ce qui indique un faible avantage compétitif des souches productrices de bactériocines. Les résultats n'ont montré un avantage compétitif que pour des souches comportant des déterminants génétiques de la cytolysine. Nous n'avons détecté une production de bactériocines dans les fromages que lorsque qu'une culture pure d'une souche productrice de nisine A a été ajoutée. La différence entre la détection de déterminants génétiques de bactériocines et l'activité antimicrobienne montre la complexité qui relie ces deux propriétés.En raison des limitations concernant les tests par diffusion sur gélose pour détecter l'expression des gènes in situ, nous avons mis en place une méthode moléculaire basée sur la reverse transcription et la PCR en temps réel. Cette méthode sera très utile pour de futures études concernant le rôle des bactériocines dans les fromages.We examined the presence of lactic acid bacteria (LAB) able to produce different bacteriocins in traditional Slovenian cheeses. In five samples of Tolminc cheese (from cows' milk) and four samples of Kraški ovčji sir (from ewes' milk) we looked for the presence 19 LAB bacteriocins' gene determinants using PCR. The DNA analysed was extracted directly from cheese samples as well as from cultivable microbial consortia of cheese which were isolated on CATC, Rogosa and M17 agar media. We used diffusion tests to determine the antimicrobial activity of microbial consortia against different indicator bacteria. Anti-staphylococcal activity was also determined in situ in milk and cheese. Competitive advantage of bacteriocinogenic strains was examined by consecutive propagation of microbial consortia in milk. During this we followed the presence of different bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity of microbial consortia. The same properties were also determined for individual bacteriocinogenic strains that were isolated from initial consortia and from consortia obtained after propagation in milk. The success of finding bacteriocin gene determinants with PCR depended greatly on the efficiency of DNA extraction. The extraction of total DNA was the most successful when sodium citrate was used for cheese homogenisation. In DNA of different cheeses and microbial consortia we detected a number of bacteriocin gene determinants. Their number was reduced during the process of propagation in milk, which indicates a poor competitive advantage of some bacteriocinogenic strains. The results demonstrated competitive advantage only for strains that carried gene determinants for cytolysin. We detected bacteriocin activity in cheese only when monoculture of nisin A producer was added. The discrepancy between detected bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity shows the complexity that links these two properties. This method will be very useful in the future studies of the role of bacteriocins in cheese

Détection et étude de l'expression de gènes de bactériocines de Bactéries lactiques dans les fromages

Nous avons étudié la présence de bactéries lactiques capables de produire des bactériocines dans des fromages traditionnels Slovènes. Dans cinq échantillons de Tolminc (fromage au lait de vache) et quatre échantillons de Kraški ovčji sir (fromage au lait de brebis), nous avons recherché la présence de 19 gènes de bactériocines par PCR. L'ADN a été extrait directement à partir des fromages ainsi qu'à partir de consortia microbiens de ces fromages isolés sur gélose CATC, Rogosa et M17. Nous avons utilisé des tests par diffusion sur gélose pour déterminer l'activité antimicrobienne des consortia sur différentes bactéries indicatrices. L'activité anti-staphylococcique a aussi été déterminée in situ dans du lait et du fromage. L'avantage compétitif des souches productrices de bactériocines a été évalué en effectuant des repiquages successifs des consortia dans du lait. Lors de ces essais, nous avons suivi la présence de différents déterminants génétiques de bactériocines ainsi que l'activité antimicrobienne des consortia. Ces mêmes propriétés ont aussi été déterminées pour des souches individuelles productrices de bactériocines, qui ont été isolées du consortium initial ou de consortia obtenus après propagation dans le lait. La mise en évidence de gènes de bactériocines par PCR dépendait de l'efficacité d'extraction de l'ADN. L'extraction de l'ADN total était plus efficace lorsque l'homogénéisation du fromage était réalisée avec une solution de citrate de sodium. Dans l'ADN issu des fromages et consortia microbiens, nous avons détecté plusieurs gènes de bactériocines. Leur nombre diminuait lors de la propagation dans le lait, ce qui indique un faible avantage compétitif des souches productrices de bactériocines. Les résultats n'ont montré un avantage compétitif que pour des souches comportant des déterminants génétiques de la cytolysine. Nous n'avons détecté une production de bactériocines dans les fromages que lorsque qu'une culture pure d'une souche productrice de nisine A a été ajoutée. La différence entre la détection de déterminants génétiques de bactériocines et l'activité antimicrobienne montre la complexité qui relie ces deux propriétés.En raison des limitations concernant les tests par diffusion sur gélose pour détecter l'expression des gènes in situ, nous avons mis en place une méthode moléculaire basée sur la reverse transcription et la PCR en temps réel. Cette méthode sera très utile pour de futures études concernant le rôle des bactériocines dans les fromages.We examined the presence of lactic acid bacteria (LAB) able to produce different bacteriocins in traditional Slovenian cheeses. In five samples of Tolminc cheese (from cows' milk) and four samples of Kraški ovčji sir (from ewes' milk) we looked for the presence 19 LAB bacteriocins' gene determinants using PCR. The DNA analysed was extracted directly from cheese samples as well as from cultivable microbial consortia of cheese which were isolated on CATC, Rogosa and M17 agar media. We used diffusion tests to determine the antimicrobial activity of microbial consortia against different indicator bacteria. Anti-staphylococcal activity was also determined in situ in milk and cheese. Competitive advantage of bacteriocinogenic strains was examined by consecutive propagation of microbial consortia in milk. During this we followed the presence of different bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity of microbial consortia. The same properties were also determined for individual bacteriocinogenic strains that were isolated from initial consortia and from consortia obtained after propagation in milk. The success of finding bacteriocin gene determinants with PCR depended greatly on the efficiency of DNA extraction. The extraction of total DNA was the most successful when sodium citrate was used for cheese homogenisation. In DNA of different cheeses and microbial consortia we detected a number of bacteriocin gene determinants. Their number was reduced during the process of propagation in milk, which indicates a poor competitive advantage of some bacteriocinogenic strains. The results demonstrated competitive advantage only for strains that carried gene determinants for cytolysin. We detected bacteriocin activity in cheese only when monoculture of nisin A producer was added. The discrepancy between detected bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity shows the complexity that links these two properties. This method will be very useful in the future studies of the role of bacteriocins in cheese.PARIS-AgroParisTech Centre Paris (751052302) / SudocSudocFranceF

Development of a standardized single gene (rpoB) sequencing-based approach for the identification and characterization of aerobic food-related spore-forming Bacillales

Aerobic spore -forming bacteria of the order Bacillales represent a highly diverse and ubiquitous group that includes organisms that cause foodborne illnesses and food spoilage. Classical microbiological and biochemical identification of members of the order Bacillales represents a challenge due to the diversity of organisms in this group as well as the fact that the taxonomic assignment of many validly named species in this group is not consistent with their genomic characteristics. DNA-sequencing-based tools, on the other hand, have been shown to enable fast, cost-effective, and more reliable identification and characterization of Bacillales isolates. In comparison to 16S rDNA, rpoB was shown to better discriminate between Bacillales isolates and to allow for taxonomic assignment to the species and subspecies levels. However, the lack of a publicly accessible rpoB database, as well as the lack of standardized protocols for rpoB-based typing and strain identification, is a major challenge. Here, we report (i) a curated DNA sequence database and online tool for rpoB-based subtype classification and identification of Bacillales isolates; and (ii) standardized protocols for PCR-amplification and sequencing of rpoB from Bacillales isolates. The curation of a rpoB database will facilitate widespread application of the rpoB sequence-based approach for the characterization of aerobic and facultative anaerobic spore-forming Bacillales isolates. Specifically, we curated a database of DNA sequences for a 632-nt internal variable region within the rpoB gene from the Bacillales representative reference type strains and a large number of isolates that we have previously isolated and characterized in the frame of multiple pathogen environmental monitoring projects. As of May 2021, the rpoB database contains more than 8,350 rpoB sequences representing 1,902 distinct rpoB allelic types that can be classified into 160 different genera; this database also includes 1,129 rpoB sequences for representative reference type strains of the order Bacillales as available on May 2021 in the NCBI database. The rpoB database is integrated into the online Food Microbe Tracker platform (www.foodmicrobetracker.com) and can be queried using the integrated BLAST tool to initially subtype and taxonomically identify aerobic and facultative anaerobic spore-formers. While whole-genome sequencing is increasingly used for the characterization of bacterial isolates, this rapid and standardized single gene sequence-based scheme provides a valuable tool as it allows for rapid and cost-effective initial isolate characterization, which often is essential to promptly detect and identify foodborne pathogens and foodspoilage bacteria. In addition, the database and primers described here can also be adopted for target metagenomics approaches that include rpoB as a target, improving discriminatory power and identification over what can be achieved using 16S rDNA as a target