Life in the Fas lane: differential outcomes of Fas signalling

Fas, also known as CD95 or APO-1, is a member of the tumor necrosis factor/nerve growth factor superfamily. Although best characterized in terms of its apoptotic function, recent studies have identified several other cellular responses emanating from Fas. These responses include migration, invasion, inflammation, and proliferation. In this review, we focus on the diverse cellular outcomes of Fas signaling and the molecular switches identified to date that regulate its pro- and anti-apoptotic functions. Such switches occur at different levels of signal transduction, ranging from the receptor through to cross-talk with other signaling pathways. Factors identified to date including other extracellular signals, proteins recruited to the death-inducing signaling complex, and the availability of different intracellular components of signal transduction pathways. The success of therapeutically targeting Fas will require a better understanding of these pathways, as well as the regulatory mechanisms that determine cellular outcome following receptor activation

CD95L Inhibition Impacts Gemcitabine-Mediated Effects and Non-Apoptotic Signaling of TNF-α and TRAIL in Pancreatic Tumor Cells

Despite the potential apoptotic functions, the CD95/CD95L system can stimulate survival as well as pro-inflammatory signaling, particularly through the activation of NFκB. This holds true for the TNF/TNFR and the TRAIL/TRAILR systems. Thus, signaling pathways of these three death ligands converge, yet the specific impact of the CD95/CD95L system in this crosstalk has not been well studied. In this study, we show that gemcitabine stimulates the expression of pro-inflammatory cytokines, such as IL6 and IL8, under the influence of the CD95/CD95L system and the pharmacological inhibitor, sCD95Fc, substantially reduced the expression in two PDAC cell lines, PancTuI-luc and A818-4. The stem cell phenotype was reduced when induced upon gemcitabine as well by sCD95Fc. Moreover, TNF-α as well as TRAIL up-regulate the expression of CD95 and CD95L in both cell lines. Conversely, we detected a significant inhibitory effect of sCD95Fc on the expression of both IL8 and IL6 induced upon TNF-α and TRAIL stimulation. In vivo, CD95L inhibition reduced xeno-transplanted recurrent PDAC growth. Thus, our findings indicate that inhibition of CD95 signaling altered the chemotherapeutic effects of gemcitabine, not only by suppressing the pro-inflammatory responses that arose from the CD95L-positive tumor cells but also from the TNF-α and TRAIL signaling in a bi-lateral crosstalk manner

c Jun N terminale Kinasen vermitteln Fas induzierte Neuritenregeneration in PC12 Zellen

Als Reaktion auf Schädigung und Verletzung beginnen periphere neuronale Zellen komplexe Signalkaskaden zur Förderung von Überleben und Regeneration. In der vorliegenden Dissertation wurde ein Modell einer experimentellen Neuritenläsion in der Phäochromozytomzelllinie PC12 verwendet, um Rezeptorsignale zu untersuchen, die zum Neuritenauswachsen führen. Die PC12-Zellen wurden nach Neuritenläsion zum Vergleich des Neuritenwachstums mit unterschiedlicher NGF-Konzentration inkubiert. Der Anteil neuritentragender Zellen wurde einen Tag, drei und fünf Tage nach Neuritenläsion bestimmt. Danach wurden Untersuchungen mittels qualitativer Techniken (RT-PCR, Western Blot) auf mRNA- und Proteinebene durchgeführt und die Expression der NGF-Rezeptoren TrkA und p75NTR nach Neuritenläsion analysiert. Rezeptor-spezifische Inhibitoren wurden verwendet, um zu zeigen, ob beide Rezeptoren für die Neuritenregeneration notwendig sind. Anschließend wurden Rezeptoren der Apoptosesignalkaskade untersucht. Aus diesen Untersuchungen resultierten folgende Ergebnisse: Der Nervenwachstumsfaktor NGF induzierte das Neuritenwachstum und die Expression der NGF-Rezeptoren TrkA und p75NTR sowie von Fas und Fas-Ligand. Die Neuritenregeneration wurde durch chemische Inhibition von TrkA, jedoch nicht von p75NTR, und durch das Fas-Inhibitor Protein Fas-Fc vermindert. Die mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) extracellular signal-regulated Kinase 1/2 (ERK1/2) und die c-Jun N-terminale Kinase (JNK) wurden als Antwort auf NGF aktiviert und trugen beide signifikant zum Neuritenwachstum bei. Interessanterweise unterstützte die sonst apoptotisch wirkende Fas-Ligation die neuronale Regeneration, wobei die Fas-Ligation die Regeneration ausschließlich via JNK aktivierte und das Neuritenwachstum parallel zu NGF förderte. Diese Ergebnisse weisen auf eine neuartige Signalvernetzung von den NGF- und Fas-Signalwegen in der JNK-Achse der MAPK-Kaskaden hin. Diese Arbeit zeigt, dass JNK-Signalwege degenerative in regenerative Signale umwandeln können

The Role of NFκB Factor Relish in Developmentally Programmed Cell Death

Several types of cell death including apoptosis, necroptosis and autophagic cell death play diverse roles in different biological processes. In addition to its essential roles in development and metabolism, programmed cell death is indispensable for host immunity. Interestingly, current research shows that these processes are connected but the nature and extent of the crosstalk between host defense and programmed cell death still remains an area of great interest. The NFkB factor Relish is best characterized as a crucial component of Drosophila Imd pathway, which generates immune responses by producing antimicrobial peptides following Gram-negative bacterial infection. In this dissertation, I demonstrate a novel role of Relish in developmentally programmed cell death. During metamorphosis, Drosophila salivary glands are degraded by the collective actions of caspase-dependent and autophagic cell death. Here I show that Relish mutants displayed improper salivary gland degradation and the persistence of salivary gland cell fragments. Expression of Relish in salivary glands rescued this phenomenon. Among the upstream components of the Imd pathway, mutants in the bacterial peptidoglycan receptors, PGRP-LC and-LE also exhibited similar defects in gland degradation, but surprisingly none of the other Imd pathway components examined had any such effect. As both Relish and PGRPs are critical for host defense against bacterial infection, our next concern was the role of host microflora in salivary gland degradation. However, observation of normal salivary gland cell death in axenic flies ruled out the possible involvement of microbiota. Robust genetic analyses proved that Relish-mediated cell death occurs in caspase-independent but autophagy-dependent manner. Moreover, expressions of either active version of Relish or PGRP-LC resulted in the premature gland degradation and induction of autophagy. Finally, I show that Relish controls autophagy by regulating the expression of Atg1, a core component of the autophagy pathway. Together these findings suggest the existence of a novel pathway, which connects immune response factors to developmentally programmed cell death

Gammabestrahlung führt zur CD95-abhängiger Invasivität in apoptoseresistenten Glioblastomzellen

Hirntumore, wie das Glioblastom multiform (GBM), zählen zu den häufigsten und bösartigsten Tumoren des zentralen Nervensystems (ZNS). Trotz sich weiterentwickelnder Diagnosemöglichkeiten ist die Überlebensrate sehr gering. Weniger als 3% der Patienten überleben die ersten 5 Jahre nach der Diagnose. Der klinische Verlauf bösartiger Glioblastome ist von der Invasion isolierter Tumorzellen in das normale Gehirngewebe abhängig. Diese Zellen entkommen der operativen Entfernung des Tumors. Sie sind Ziel der postoperativen Strahlen- und Chemotherapie. Diese postoperativen Therapieformen induzieren Apoptose durch Induktion der Expression der Todesrezeptoren und ihrer Liganden, wie beispielsweise das CD95-(Fas/Apo-1) Todessystem. In den letzten 20 Jahren wurden immer wieder neue Therapieformen entwickelt, die oftmals aber einen gegenteiligen Effekt erzielten. So führten beispielsweise die Antiangiogenese Medikamente zu einem verstärkten Auswachsen der Zellen aus dem Glioblastom (Lamszus et al., 2003). Ein weiteres Problem ist die zunehmende Resistenz der Glioblastome gegenüber apoptoseinduzierender Therapien. Das Anliegen dieser Studie war den Mechanismus der Invasion genauer zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die Stimulierung des CD95-Rezeptors einen Anstieg der Migration/Invasion in apoptoseresistenten etablierten und primären Glioblastomzellen auslöste. Diese Zunahme konnte sowohl mit exogenen Stimuli (α-Apo-1 Antikörper bzw. LZ-CD95L) als auch durch die Hochregulierung des endogenen CD95/CD95L-Systems nach -Bestrahlung beobachtet werden. Der CD95-vermittelte Anstieg konnte durch einen neutralisierenden Antikörper gegen CD95L blockiert werden. Die Tendenz der Zellen zu migrieren, anstatt durch Apoptose zu sterben, steigt mit dem Malignitätsgrad primärer Glioblastome an. Der Signalweg der CD95-vermittelten Migration läuft über die Aktivierung der PI3Kinase (PI3K), der Integrin-Linked-Kinase (ILK), der Inhibierung von GSK3 und der Expression der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Caspasen sind an diesem Signalweg nicht beteiligt. Das direkte Verbindungsglied unterhalb des CD95-Rezeptors konnte in dieser Studie nicht detektiert werden. Das „phosphoprotein enriched in diabetes/phosphoprotein enriched in astrocytes-15-kDalton“ (PED/PEA-15) wurde als möglicher Kandidat untersucht. Jedoch konnte nach dem Ausschalten der PED/PEA-15-Expression keine Veränderung in der Inhibierung von GSK3 detektiert werden. Vor diesem Hintergrund sollten die postoperativen Therapieformen sehr gut überlegt und durch vorherige Test des entnommen Tumors auf seine Reaktion gegenüber CD95-Stimulierung getroffen werden

Regulation des Aktivierungs-Induzierten Zelltods in peripheren humanen T-Zellen duch das antiapoptotischen Protein c-FLIP

Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der T-Zell-Homöostase. Das zu Procaspase-8 homologe Protein c-FLIP ist ein wichtiger Regulator der zellulären Sensitivität für todesrezeptorabhängige Apoptose. In der vorliegenden Arbeit wird die Regulation der Apoptosesensitivität primärer T-Lymphocyten durch Regulation der Expression von c-FLIP analysiert. Es wird gezeigt, dass die Expression von c-FLIP durch Stimulation des T-Zell-Rezeptors sowohl in naiven als auch in aktivierten T-Lymphocyten induziert wird. Die Abhängigkeit der c-FLIP-Expression von zwei differenziell regulierten Promotoren wird erstmalig demonstriert

Immunevasion von Herpes-simplex-Virus Typ 1: Angriff auf Zellen des Immunsystems

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, neue Mechanismen zu identifizieren, wie HSV-1 die Immunantwort durch Interaktion mit Zellen des Immunsystems unterdrücken kann. Es konnte kein verändertes Proliferationsverhalten von Lymphozyten in Anwesenheit von VP22 beobachtet werden. Wie die vielfältigen Interaktionen dieses viralen Tegumentproteins mit zellulären Molekülen verdeutlicht, läßt sich eine Rolle von VP22 in der Immunevasion damit jedoch nicht ausschließen. Dagegen konnte gezeigt werden, daß HSV-1 in unreifen Dendritischen Zellen über einen Caspase-8 abhängigen Mechanismus Apoptose einleiten kann. In infizierten Zellen war die Menge an TNFalpha und TRAIL stark erhöht. Die Menge an CD95L blieb jedoch unverändert. Da unreife Dendritische Zellen resistent gegen einen durch Todesliganden induzierten Zelltod sind, müssen Viren diese Zellen durch einen veränderten Signalweg empfänglich für Apoptose machen. Die Expression einiger Proteine, die an der Regulation der Apoptose beteiligt sind (z.B. Bcl-2, RIP, FADD), wurde nach HSV-1-Infektion nicht verändert. Allerdings konnte gezeigt werden, daß die Menge an p53 im Zytoplasma nach HSV-1-Infektion verstärkt wurde. Eine Translokation von p53 in den Zellkern und eine damit verbundene Transkriptionsaktivität konnte aber ausgeschlossen werden. Darüber hinaus zeigte sich auf Proteinebene eine 50%ige Verringerung von c-FLIP(L) in HSV-1-infizierten unreifen Dendritischen Zellen. Die Transkriptmenge von c-FLIP(L) war nach HSV-1-Infektion jedoch erhöht, was dessen Herunterregulation durch eine verminderte Transkription oder mRNA-Stabilität ausschließt. Statt dessen könnte eine Ubiquitinylierung und ein Abbau durch Proteasomen an der verringerten Proteinmenge von c-FLIP(L) beteiligt sein. Dazu scheint die Transkription früher Gene notwendig zu sein, da die HSV-1-induzierte Apoptose unreifer Dendritischer Zellen nicht durch die Anwesenheit von Acyclovir, einem Inhibitor der herpesviralen DNA-Replikation, gehemmt werden konnte. Letztendlich war der zugrundeliegende Mechanismus zelltypspezifisch, da andere Zellen des Immunsystems, die mit HSV-1 infiziert wurden, unveränderte c-FLIP(L)-Mengen zeigten. Die hier untersuchten Wechselwirkungen von HSV-1 mit seinen Wirtszellen sind nur wenige Beispiele einer Vielzahl möglicher viraler Immunevasionsmechanismen. Die fehlende Kenntnis der Funktion aller viraler Proteine läßt vermuten, daß die Interaktion von HSV-1 mit seinem Wirt und damit auch dem Immunsystem noch sehr viel komplexer ist, als es bisher absehbar ist

Convergence Of Proliferative And Survival Signals On The pRB/E2F Pathway In Haematopoietic Cells

Chronic myeloid leukemia (CML) is a malignant stem cell disease characterised by an expansion of myeloid progenitor cells. These cells express a BCR/ABL fusion protein with constitutively activated tyrosine kinase activity, which causes a deregulation of apoptosis and cell cycle progression. In the pro-B BaF3 cell line, BCR/ABL has been shown to abrogate the EL-3 dependence to proliferate, but the signalling pathways activated by BCR/ABL and IL-3 to promote proliferation and survival are not yet well defined. In this study, BaF3 cells and a BaF3 cell line stably over-expressing BCR/ABL, BaF3-p210, were used to identify the downstream targets of BCR/ABL and IL-3. Both BCR/ABL and IL-3 were shown to induce the expression of cyclin D2 and inhibit the expression of the cell cycle inhibitor, p27 kipl. This regulation was shown to be directly due to BCR/ABL, in haematopoietic cells, by two different approaches. First, using a BaF3 cell line (TonB210.1) where the BCR/ABL expression is inducible by doxycycline and second, by inhibiting the kinase activity of BCR/ABL with the Abl tyrosine kinase inhibitor STI571. In order to establish the functional significance of cyclin D2 and p27 Kipl expression in response to IL-3 and BCR/ABL expression, the effects of ectopic expression of cyclin D2 and p27 Kipl on cell proliferation and survival were studied. The results demonstrate that both cyclin D2 and p27 Kipl have a role in BaF3 cell proliferation and survival, as ectopic expression of cyclin D2 is sufficient to abolish the cell cycle arrest and apoptosis induced by IL-3 withdrawal or BCR/ABL inactivation, while over-expression of p27 Kipl can cause cell cycle arrest and apoptosis in BaF3 cells. Next, the signal pathways triggered by BCR/ABL and IL-3 to regulate cell proliferation and apoptosis via cyclin D2 and p27 Kipl were investigated. The PI 3-Kinase inhibitor LY294002 blocks the ability of BCR/ABL or IL-3 to induce cyclin D2 up-regulation and p27 Kipl down-regulation and inhibits BCR/ABL-induced entry in S phase. Ectopic expression of cyclin D2 was found to overcome the cell cycle arrest induced by inhibition of PI 3-Kinase by LY294002. The results indicate that BCR/ABL and EL-3 target cyclin D2 and p27 Kipl to mediate cell cycle arrest and apoptosis through a pathway involving the phosphatidylinositol-3 kinase (PI 3-K)