Controlling ligand surface density on streptavidin-magnetic particles by a simple, rapid, and reliable chemiluminescent test

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Electrokinetic characterization of extracellular vesicles with capillary electrophoresis : A new tool for their identification and quantification

This work reports on the development of the first capillary electrophoresis methodology for the elucidation of extracellular vesicles' (EVs) electrokinetic distributions. The approach is based on capillary electrophoresis coupled with laser-induced fluorescent (LIF) detection for the identification and quantification of EVs after their isolation. Sensitive detection of these nanometric entities was possible thanks to an 'inorganic-species-free' background electrolyte. This electrolyte was made up of weakly charged molecules at very high concentrations to stabilize EVs, and an intra-membrane labelling approach was used to prevent EV morphology modification. The limit of detection for EVs achieved using the developed CE-LIF method reached 8 x 10(9) EV/mL, whereas the calibration curve was acquired from 1.22 x 10(10) to 1.20 x 10(11) EV/mL. The CE-LIF approach was applied to provide the electrokinetic distributions of various EVs of animal and human origins, and visualize different EV subpopulations from our recently developed high-yield EV isolation method. (C) 2020 Elsevier B.V. All rights reserved.Peer reviewe

Standardized incidence ratios and risk factors for cancer in patients with systemic sclerosis: Data from the Spanish Scleroderma Registry (RESCLE)

Aim: Patients with systemic sclerosis (SSc) are at increased risk of cancer, a growing cause of non-SSc-related death among these patients. We analyzed the increased cancer risk among Spanish patients with SSc using standardized incidence ratios (SIRs) and identified independent cancer risk factors in this population. Material and methods: Spanish Scleroderma Registry data were analyzed to determine the demographic characteristics of patients with SSc, and logistic regression was used to identify cancer risk factors. SIRs with 95% confidence intervals (CIs) relative to the general Spanish population were calculated. Results: Of 1930 patients with SSc, 206 had cancer, most commonly breast, lung, hematological, and colorectal cancers. Patients with SSc had increased risks of overall cancer (SIR 1.48, 95% CI 1.36-1.60; P < 0.001), and of lung (SIR 2.22, 95% CI 1.77-2.73; P < 0.001), breast (SIR 1.31, 95% CI 1.10-1.54; P = 0.003), and hematological (SIR 2.03, 95% CI 1.52-2.62; P < 0.001) cancers. Cancer was associated with older age at SSc onset (odds ratio [OR] 1.22, 95% CI 1.01-1.03; P < 0.001), the presence of primary biliary cholangitis (OR 2.35, 95% CI 1.18-4.68; P = 0.015) and forced vital capacity <70% (OR 1.8, 95% CI 1.24-2.70; P = 0.002). The presence of anticentromere antibodies lowered the risk of cancer (OR 0.66, 95% CI 0.45-0.97; P = 0.036). Conclusions: Spanish patients with SSc had an increased cancer risk compared with the general population. Some characteristics, including specific autoantibodies, may be related to this increased risk

Síntesis y evaluación de nanomateriales metálicos fluorescentes como marcadores en el desarrollo de inmunoensayos

En la actualidad la Nanociencia está siendo de vital importancia para el desarrollo, crecimiento y mejora de la calidad de numerosos y muy variados sectores como la electrónica, la industria textil, energías renovables, medicina, bioanálisis, control ambiental, etc. Así, la Química Analítica (Ciencia al servicio de los problemas de la sociedad) encuentra en esta Ciencia emergente diversas líneas de de actuación, como son: - La investigación de nuevas metodologías de análisis basadas en el empleo de nanomateriales. - El desarrollo de estrategias para el control de la síntesis y caracterización de nuevas nanopartículas. - La investigación de nuevas vías para el marcaje de analitos de interés con estas nanoestructuras y su posterior caracterización y análisis. También cabe remarcar la emergente y urgente demanda por parte del sector nanotecnológico de: - El desarrollo de procesos sintéticos sencillos, fáciles de controlar y escalar y extensibles para su aplicación a la síntesis del mismo nanomaterial con distinto núcleo metálico, así como la búsqueda de nuevos nanomateriales multifuncionales. - El desarrollo y mejora de las técnicas de caracterización de nanomateriales, haciendo que cada vez sean más eficaces y fiables, ya que una buena caracterización estructural y de composición es esencial a la hora de intentar comprender mejor las propiedades que presentan estos materiales y establecer relaciones estructura-propiedad. Por otro lado, dentro de la Química Analítica, la rama del bioanálisis está experimentando un creciente desarrollo debido a la gran demanda de métodos de análisis cada vez más sensibles, fiables y rápidos que nos aporten la mayor información posible. Así, una de las técnicas de bioanálisis más empleadas, en la que siempre se intenta innovar y que reúne dichas características, son las metodologías de análisis inmunoquímico. De hecho, en este campo, la detección fotoluminiscente ofrece una serie de ventajas que confieren a los inmunoensayos una elevada sensibilidad analítica. Por ello, el desarrollo de nuevas generaciones de fluoróforos (p.e. quantum dots o QDs y nanoclustes o NCs) con propiedades que mejoren y/o solventen los problemas que presentan los fluoróforos convencionales (baja fotoestabilidad, cortos desplazamientos de Stokes, tiempos de vida media pequeños) es especialmente apreciado. En este contexto, el objetivo general que se plantea en la presente Tesis Doctoral es: Desarrollo de nuevas estrategias sintéticas, caracterización y aplicación de nanomateriales luminiscentes como marcadores en inmunoensayos cuantitativos. Este propósito global se persiguió a través de los siguientes objetivos específicos consiguiéndose los resultados que se muestran a continuación: 1. Desarrollo de inmunoensayos fluorescentes cuantitativos basados en CdSe/ZnS quantum dots. Desde las primeras publicaciones sobre las propiedades y síntesis de QDs, hace ya dos décadas, muchos han sido los avances realizados en este campo tanto en estudios fundamentales como en las posibles aplicaciones de estos nanomateriales. Así, han sido propuestos diferentes esquemas de bioensayos en los que se utilizan QDs como marcadores aprovechando las especiales propiedades optoelectrónicas de estos nanocristales. Hasta el comienzo de la presente Tesis Doctoral en la literatura se podían encontrar diversos formatos de bioensayos e inmunoensayos basados en QDs, tales como sensores directos de (bio)moléculas basados en el enaltecimiento/apagado de la fluorescencia del QD; ensayos de transferencia de energía (FRET o BRET); inmunosensores electroquímicos; ensayos de western blotting, etc. Sin embargo, existían muy pocos trabajos en los que se empleasen los QDs como marcas directas para el desarrollo de inmunoensayos cuantitativos. Por este motivo en el primer capítulo de la presente Tesis Doctoral se llevó a cabo el diseño y completo desarrollo de un inmunoensayo competitivo fluorescente basado en QDs. Para ello, se escogió como analito modelo la Progesterona, una hormona cuyos niveles en leche de ganado bovino pueden ser empleados para determinar el momento fértil de la vaca y optimizar los tiempos de fecundación de la misma. Por otro lado, con el fin de demostrar que el formato de inmunoensayo desarrollado es una plataforma general de análisis aplicable a cualquier compuesto de interés, se aplicó con éxito dicho esquema de inmunoensayo a la determinación de Melamina en leche fórmula para bebés (esta sustancia es un adulterante empleado para incrementar de forma aparente el contenido de proteína de los alimentos). De este modo, queda puesto de manifiesto la posibilidad de realizar ensayos multiparamétricos (análisis de varios analitos a la vez) con la plataforma general de inmunoensayo basado en QDs aquí desarrollado. 2. Evaluación del empleo de CdSe/ZnS quantum dots como marcas elementales en inmunoanálisis. Teniendo en cuenta el carácter metálico de estas nanopartículas junto con la necesidad de desarrollar ensayos cada vez más sensibles y fiables para la determinación de biomoléculas a bajos niveles de concentración, en este segundo objetivo parcial se exploró el uso de los QDs como marcas elementales en inmunoensayos empleando como detector el ICP-MS. Este detector es ampliamente empleado en la identificación y cuantificación de elementos traza (endógenos o exógenos o posibles contaminantes) en una gran variedad de campos de aplicación como el medioambiental, el geológico, el clínico o el industrial. Sin embargo, no ha sido hasta esta última década cuando se ha iniciado la investigación en el empleo del ICP-MS como detector en inmunoensayos en la creencia de obtener unas poderosas ventajas de la unión de estas dos potentes técnicas analíticas. Con la investigación llevada a cabo en este objetivo se consiguió poner de manifiesto por un lado el potencial de los QDs como marcas elementales y, por otro, las ventajas que el ICP-MS puede aportar como detector de inmunoensayos. Para ello, se utilizó con éxito el inmunoensayo previamente desarrollado para la determinación de progesterona en leche de ganado vacuno. 3. Síntesis y caracterización de una nueva generación de fluoróforos nanostructurados: nanoclusters metálicos de plata. Actualmente existe una gran demanda tanto de nuevas estrategias sintéticas para la producción de nuevos nanomateriales con propiedades únicas como del desarrollo de nuevas marcas que mejoren las características analíticas de los inmunoensayos y/o técnicas de bioanálisis in vivo (p.e. técnicas de imagen). De este modo, en un intento de aunar estos retos, en este tercer objetivo se planteó la investigación de la síntesis y caracterización de nanoclusters de plata. Los NCs son unos nanomateriales emergidos recientemente y que presentan un futuro prometedor como marcadores en diversas técnicas bioanalíticas y en análisis in vivo. Sin embargo, todavía se requieren estudios fundamentales que establezcan relaciones estructura-propiedad-aplicación y en concreto, en esta Tesis Doctoral se ha estudiado los efectos que tiene la irradiación continuada de luz UV sobre las propiedades ópticas de los nanoclusters de plata. Cabe mencionar que a lo largo de la presente Tesis Doctoral y para conseguir llevar a cabo con éxito los objetivos parciales anteriormente citados se desarrollaron diversas estrategias analíticas para: # la purificación y caracterización de trazadores (biomoléculas marcadas en inmunoensayos) - Marcaje de anticuerpo: purificación por cromatografía de exclusión por tamaños y caracterización mediante ensayo ELISA - Marcaje de antígeno: purificación por UHF y caracterización mediante Test de Bradford # la caracterización de los cambios nanoestructurales que se producen a lo largo de la síntesis de nanoclusters de plata y tras el proceso de irradiación UV mediante el empleo de la técnica de separación Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation acoplada en línea a detectores moleculares (UV/Vis y fluorescencia) y detector elemental (ICP-MS). Por todo ello, esta Tesis Doctoral abarca desde la síntesis, purificación y caracterización de nanomateriales (QDs y NCs), hasta la aplicación de los mismos como marcas (fluorescentes y elementales) al desarrollo de inmunoensayos competitivos para la determinación de moléculas pequeñas (haptenos) de interés, pasando por la realización de estudios fundamentales que afectan a las propiedades únicas de estos nanocristales, así como el desarrollo de diversas estrategias para el marcaje, purificación y caracterización de biomoléculas (anticuerpos y/o conjugados hapteno-BSA) con QDs

Recent advances in the development of capillary electrophoresis methodologies for optimizing, controlling, and characterizing the synthesis, functionalization, and physicochemical, properties of nanoparticles

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Electromigration separation methodologies for the characterization of nanoparticles and the evaluation of their behaviour in biological systems

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Zwitterionic Silane Copolymer for Ultra-Stable and Bright Biomolecular Probes Based on Fluorescent Quantum Dot Nanoclusters

Fluorescent semiconductor quantum dots (QDs) exhibit several unique properties that make them suitable candidates for biomolecular sensing, including high brightness, photostability, broad excitation, and narrow emission spectra. Assembling these QDs into robust and functionalizable nanosized clusters (QD-NSCs) can provide fluorescent probes that are several orders of magnitude brighter than individual QDs, thus allowing an even greater sensitivity of detection with simplified instrumentation. However, the formation of compact, antifouling, functionalizable, and stable QD-NSCs remains a challenging task, especially for a use at ultralow concentrations for single-molecule detection. Here, we describe the development of fluorescent QD-NSCs envisioned as a tool for fast and sensitive biomolecular recognition. First, QDs were assembled into very compact 100-150 nm diameter spherical aggregates; the final QD-NSCs were obtained by growing a cross-linked silica shell around these aggregates. Hydrolytic stability in several concentration and pH conditions is a key requirement for a potential and efficient single-molecule detection tool. However, the hydrolysis of Si-O-Si bonds leads to desorption of monosilane-based surface groups at very low silica concentrations or in a slightly basic medium. Thus, we designed a novel multidentate copolymer composed of multiple silane as well as zwitterionic monomers. Coating silica beads with this multidentate copolymer provided a robust surface chemistry that was demonstrated to be stable against hydrolysis, even at low concentrations. Copolymer-coated silica beads also showed low fouling properties and high colloidal stability in saline solutions. Furthermore, incorporation of additional azido-monomers enabled easy functionalization of QD-NSCs using copper-free bio-orthogonal cyclooctyne-azide click chemistry, as demonstrated by a biotin-streptavidin affinity test.Fil: Dembele, Fatimata. Universite Pierre et Marie Curie; FranciaFil: Tasso, Mariana Patricia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; ArgentinaFil: Trapiella Alfonso, Laura. Universite Pierre et Marie Curie; FranciaFil: Xu, Xiangzhen. Universite Pierre et Marie Curie; FranciaFil: Hanafi, Mohamed. Universite Pierre et Marie Curie; FranciaFil: Lequeux, Nicolas. Universite Pierre et Marie Curie; FranciaFil: Pons, Thomas. Universite Pierre et Marie Curie; Franci

Synthesis and characterization of hapten-quantum dots bioconjugates: Application to development of a melamine fluorescentimmunoassay

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Functionalized gold nanoclusters as fluorescent labels for immunoassays: Application to human serum immunoglobulin E determination

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